KR20230161078A - 초형 변이를 유도하는 OsHDSTART2 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시는 벼 유래 OsHDSTART2 유전자 교정을 통한 작물 잎의 초형변이 유도에 관한 것이다. 본 개시에 따른, OsHDSTART2 유전자 편집용 가이드 RNA는 OsHDSTART2 유전자의 표적 서열에 변이를 유도하여 유익한 잎의 초형변이를 유발할 수 있다. 본 개시에 따른 편집된 OsHDSTART2 유전자에 의해 발현되는 변형된 단백질을 포함하는 형질전환 벼는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이가 증대되어 잎의 물 이용효율이 증가하고, 토양 수분사용량을 낮춰 물이 부족한 환경에서 생존력이 높아질 수 있다. 따라서 본 개시에 따른 OsHDSTART2 유전자 편집용 가이드 RNA, 이 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제를 포함하는 벡터를 이용하여 내건성이 증진된 식물체를 생산하는데 기여할 수 있다.

Description

초형 변이를 유도하는 OsHDSTART2 유전자 및 이의 용도{OsHDSTART2 gene inducing plant ideotype and use thereof}

본 개시는 벼 유래 OsHDSTART2 유전자 교정을 통한 작물 잎의 초형변이 유도에 관한 것이다.

벼는 전세계적으로 수많은 사람들이 주식으로 먹고 있는 쌀을 생산하는 중요한 작물이다. 기온 상승, 가뭄, 토양 염도 증가, 살충제 내성 해충 및 병원균 증가 등으로 인해 벼의 재배 환경은 해가 갈수록 악화되고 있고, 그에 따라 재배 환경 변화를 예측하기가 점점 더 어려워지고 있다.

이러한 환경 변화에 대응하기 위한 우수한 특질을 갖는 벼 품종을 개발하고 육종할 필요성이 지속적으로 대두되고 있으며, 이를 해결할 수단 중 하나로서 유전체/유전자 편집에 관심이 모아지고 있다.

유전체/유전자 편집(genome/gene editing)은 원하는 염기서열을 인식하여 절단하는 천연 또는 인공 제한효소로 동물 또는 식물 세포내에서 원하는 유전체 또는 유전자의 염기서열을 정확히 절단하여 기존 기술들에 비해 높은 효율로 유전체상의 유전정보를 교정하는 분자도구이다. 실제로 유전자 교정 방법은 2002년 초파리에서 유전자 녹-아웃(knock-out)을 위해 사용된 이래로, 기존 기술로는 정확한 유전자 녹아웃이 매우 비효율적이거나 불가능하였던 다양한 동물뿐만 아니라, 애기장대, 담배, 벼, 옥수수 등의 식물에서도 성공적인 유전정보 조작을 유도할 수 있음이 밝혀졌다.

최근 들어 관심이 집중되고 있는 CRISPR/Cas9 시스템은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 효소를 이용한 게놈(유전체) 편집 수단으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)와 특정 염기서열을 자르는 가위로 역할하는 Cas9(CRISPR associated protein 9) 엔도뉴클레아제 효소로 구성된다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 식물이나 동물의 유전체에 특정 유전자 또는 돌연변이를 도입하거나 특정 유전자 또는 돌연변이를 녹-아웃시키는 것이 가능하다.

그러나 표적-이탈 효과(off-target effect) 등의 문제로 인해, 최근에는 원하는 유전자 교정의 성공률을 높이기 위해 교정하고자 하는 유전자의 타겟 위치에 대한 정확도 및 교정 효율이 높으면서, 비특이적인 위치에 대한 변이를 초래하지 않는 CRISPR/Cas9 시스템에 대한 요구가 증가하고 있다.

한편, 식물체 지상부의 구조를 일컫는 식물의 초형(ideotype)은 작물의 생산성에 영향을 미친다. 식물의 초형을 결정하는 인자에는 간장(예컨대, 벼의 키, 지표면에서 이삭목마디까지의 길이), 수장(예컨대, 이삭목부터 이삭 끝까지의 길이), 개체당 이삭수(예컨대, 이삭이 달린 유효수), 분얼(分蘖; tiller)의 정도, 엽신의 열 개 정도, 엽각 등이 있다(Guo, J., E.S. Seong, Y.H. Kim, H.J. Jo, J.H. Cho and M.H. Wang. 2007. Transformation of 'Ilmibyeo, using pCAMBIA 1300 and microstructural investigation of leaves. Korean J. Plant Res. 20(5):437-441.; Jin, J., W. Huang, J.P. Gao, J. Yang, M. Shi, M.Z. Zhu, D. Luo and H.X. Lin. 2008. Genetic control of rice plant architecture under domestication. Nature Genet. 40:1365-1369; Peng, S., G.S. Khush, P. Virk, Q. Tang and Z. Yingbin. 2008. Progress in ideotype breeding to increase rice yield potential. Field Crops Research 108(1):32-38.).

벼의 초형에 영향을 미치는 인자 중 하나인 잎은 광합성, 호흡, 증발 등 작물이 생육하는 데에 필요한 여러가지 역할을 한다. 잎의 넓이, 길이, 직립성 및 말림에 의해 광합성, 호흡 및 증발의 효율성이 달라질 수 있고, 이는 벼 자체의 생육, 이삭의 생산량 등과 밀접하게 연관되어 있으므로 잎의 형태는 중요한 농업형질 중 하나이다.

한편, 앱시스산(abscisic acid)은 식물의 성장 중에 일어나는 여러 과정을 억제하는 식물호르몬으로 흔히 ABA라고 약칭한다. 세스키테르펜의 일종으로 휴면 중의 종자, 나무눈, 구근 등에 많이 존재하며, 보통 발아되면서 함량이 감소한다. 식물의 수분결핍시 ABA가 많이 합성되면서 기공이 닫혀 증산을 억제하여 건조로부터 식물을 보호한다.

또한, 휴면을 유도하기도 하고, 식물이 스트레스를 받을 때 ABA의 함량이 증가하여 각종 스트레스로부터 식물이 견딜 수 있도록 한다. 또한, 앱시스산의 합성 저하는 식물의 조숙한 발아 및 시들음(wilting)의 원인이 되는 것으로 추측되고 있다. 또한 ABA는 호분층에서 지베렐린에 의한 알파-아밀라아제 mRNA의 증가를 방해한다. 식물에서 앱시스산 합성을 제어할 수 있다면, 조기 발아의 억제, 종자의 휴면성 조절 등과 같은 식물 발현의 조절을 비롯한 건조내성 등과 같은 유익한 특성의 부여도 가능해질 것으로 기대되어 왔다.

최근까지 벼의 초형을 개선하고자 하는 시도가 있어 왔으나, 식물체에서 ABA 신호전달을 조절하는 인산화효소 관련 유전자와 벼 잎의 초형변이에 관한 연관성을 규명하고 이를 통해 벼의 특성을 개량한 사례는 전무하다.

이러한 상황에서, 정확도가 높고 효율적인 유전체 내지 유전자 조작 기법을 통해 벼 잎의 초형변이를 유도하여 기후 환경 변화에 대응하여 우수한 생육특성을 나타내는 개량된 벼 품종을 개발할 필요성은 여전히 있다.

대한민국등록특허 제10-2113500호(공고일: 2020.05.21)

본 개시는 전술한 당업계에서 요구되어 온 개량된 특성을 갖는 벼 품종을 개발하기 위해 안출된 것으로서, 잎, 더 구체적으로 잎말림에 관한 유익한 초형변이를 유도하여 물 이용효율을 증가시키는 변이를 도입하기 위한 유전자 편집 도구, 더 구체적으로 벼의 잎말림 초형변이에 관여하는 유전자를 편집하기 위한 가이드 RNA, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벼의 잎말림 초형변이에 관여하는 유전자 편집용 벡터, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 벼의 잎말림 초형변이에 관여하는 유전자 편집용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 개시는 전술한 벡터 또는 조성물을 형질도입하여, 야생형 또는 비변형된 식물체 대비 물 이용효율이 증가하고/하거나 물 손실율이 감소된 형질전환 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 벼의 잎과 관련한 유익한 초형변이를 유도하는 유전자를 지속적으로 탐색하여 호메오도메인(Homeodomain)과 START도메인(STARTdomain)을 가지고 있는 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자에 변이를 도입하였을 때, 바깥쪽으로 잎말림이 발생하는 초형변이가 유발되고 그에 따라 물 이용효율이 개선됨을 규명하여 본 발명을 완성했다.

본 개시는 벼 유래의 호메오도메인과 START도메인을 가지고 있는 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자(또는 특정 유전자 영역)을 특이적으로 인식하는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

상기 가이드 RNA는 벼 유래의 OsHDSTART2 유전자의 표적서열에 엔도뉴클레아제를 특이적으로 가이드하여 원하는 유전자 변이, 더 구체적으로 삽입/결실(IN/DEL) 변이를 유도하는 것일 수 있다.

본 개시는 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 유전자 편집용 벡터를 제공한다.

본 개시는 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 또는 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 OsHDSTART2 유전자 편집용 조성물을 제공한다.

본 개시는 상기 벡터 또는 상기 조성물에 의해 변형된 OsHDSTART2 유전자 또는 변형된 OsHDSTART2 단백질을 발현하고/하거나 변형된 OsHDSTART2 단백질 활성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 개시에 따른 상기 형질전환 식물체는 바깥쪽으로 잎말림이 발생하고, 잎의 물 이용효율이 증가하고/하거나 물 손실율이 감소된 식물체일 수 있다.

상기 식물체는 벼(Orizaya stavia)일 수 있다.

본 개시에 따른 OsHDSTART2 유전자 편집용 조성물을 이용하여 형질전환된 벼는 잎을 구성하는 기동 세포(motor cell; bulliform cell)가 좁고 깊어지는 고유한 형태적 특성을 나타낼 수 있다.

본 개시는 변형된 OsHDSTART2 유전자 또는 변형된 OsHDSTART2 단백질 활성을 갖는 형질전환 식물체로부터 수득한 종자를 제공한다.

본 개시는 OsHDSTART2 유전자 편집용 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열과 동일하거나 이 염기서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 염기서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsHDSTART2 유전자의 표적서열에 변이를 유도하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 개시는 상기 제조방법에 의해 제조된 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 나타내고 물 이용효율이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 개시에 따른 벼 유래의 OsHDSTART2 유전자에 특이적인 가이드 RNA는 OsHDSTART2 유전자의 표적서열에 대해 DNA 염기서열 변형을 유도하여 잎의 초형변이를 조절할 수 있다.

구체적으로 본 개시에 따른 잎의 초형변이를 나타내는 형질전환 식물체는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 나타내고 잎의 물 이용효율이 증가하고, 토양 수분 사용량을 낮춰 물이 부족한 환경에서 생존력이 높아질 수 있다.

본 개시에 따른 가이드 RNA, 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 벡터, 상기 벡터의 도입에 따라 대상 식물체를 형질전환시키는 방법, 및 상기 방법으로 제조한 식물체 및 이의 종자는 기후 변화에 따른 내건성이 향상되어, 생산성 증대를 기대할 수 있다.

도 1은 전사인자 유전자 2,839종의 아미노산 서열에서 발견되는 SnRK2 인산화 모티브의 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 OsHDSTART2 단백질의 주요 기능영역 및 인산화 모티브의 위치를 나타낸 것으로, HOMEO는 homeo domain; START는 START domain을 나타낸다.
도 3은 OsHDSTART2 유전자 편집 벡터 OsHDSTART2-pRGEB32의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터가 도입된 아그로박테리아(LBA4404)의 콜로니 PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터를 도입하여 형질전환시킨 벼의 게놈(genomic) PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼의 표적 유전자 염기서열 변이(A) 및 아미노산 변이(B)를 나타낸 것이다.
도 7은 OsHDSTART2 유전자가 편집된 형질전환 벼 호모계통에서 Os04g53540의 상동성 유전자인 Os08g08820의 염기서열 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8은 OsHDSTART2 유전자가 편집된 형질전환 벼 호모계통의 잎 형태 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼 잎의 조직학적 분석을 나타낸 것이다.
도 10은 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼와 야생형(삼광벼)의 물 이용 형질 분석을 나타낸 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시가 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 명세서 사용된, 용어 “OsHDSTART2(Oryza sativa Homeo Domain StAR-related lipid Transfer 2)”은 벼(Oryza sativa)의 염색체 4번에 위치한 Os04g53540 유전자로부터 유래한 폴리펩티드 또는 단백질로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. OsHDSTART2를 코딩하는 핵산 서열은 oshdstart2로 표기되며, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가질 수 있다. 서열번호 1의 염기 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지면서 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 상동체, 유사체 등은 본 개시의 범위에 포함된다.

본 개시에 따른 Os04g53540 유전자는 식물의 스트레스 내성을 유도하는 호르몬인 ABA 신호전달에 관여하는 SnRK2 단백질 키나제(SnRK2 kinase) 단백질과의 연관성에 기초하여 후보로 선발되었다. 구체적으로, 본 발명자들은 SnRK2 단백질 키나제가 인식하는 인산화모티브(RXXS/T)를 다수, 예를 들어, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 이상 포함하는 벼의 전사인자들 중에서 호메오도메인과 START도메인을 갖는 유전자를 탐색하여 Os04g53540 유전자를 선발하고, 이 유전자에 의해 코딩되는 START도메인 내의 특정 위치에 돌연변이를 유발한 결과 변형된 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩되는 변형된 단백질이 발현되어 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이가 유도되고, 그에 따라 물 이용 효율이 증가하는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 Os04g53540 유전자의 잎말림 초형변이와 관련된 구조적 특징을 강조하기 위해 “OsHDSTART2”로 명명하였다.

일 양태에서, 본 개시는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식하는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "가이드 RNA(guide RNA; gRNA)"는 동물 또는 식물 대상체에서 특정 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 인식하여 찾아내는 특이적인 RNA를 말하며, 타겟 DNA 서열 전부 또는 일부와 상보적으로 결합하여 해당 타겟 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산(ribonucleic acid)을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 타겟 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 지칭하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 타겟 서열에서 활성을 나타낼 수 있는 형태라면, 제한 없이, 본 개시의 범위에 포함될 수 있다.

본 개시에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 또는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo)에서 전사된 것, 예컨대, 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 개시에 따른 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 호메오도메인과 START도메인을 포함하는 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자(oshdstart2), 더 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식할 수 있는 것이라면, 특별한 제한 없이 사용가능하다.

일 실시형태에서, 본 개시에 따른 가이드 RNA는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 서열번호 3의 염기서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 염기서열을 특이적으로 인식하는 것일 수 있다.

상기 OsHDSTART2 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 바람직하게는 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자는 코돈 축퇴성에 따라 서열번호 1의 축퇴된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 표적 유전자, 구체적으로 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 유전자를 특이적으로 인식하여 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9을 이 유전자로 가이드하여 목적하는 유전자 편집을 유도할 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA는 벼 유래의 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 위치에서 특정 염기의 삽입 및/또는 결실을 유도하는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 OsHDSTART2 단백질의 START도메인, 구체적으로 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열 중의 START 도메인 영역, 구체적으로 아미노산 위치 286번에서 523번까지의 영역을 특이적으로 인식하여 엔도뉴클레아제와 연계하여 변이, 구체적으로 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 유발하는 변이를 유발할 수 있는 것이라면, 제한됨이 없이 사용될 수 있다.

이러한 특성을 갖는 가이드 RNA의 서열을 특정하고 선별하는 것은 본 개시에 비추어 당업자에게 자명할 것이다.

본 개시에 따른 상기 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 Os04g53540 유전자와 상동성이 높은 다른 유전자, 구체적으로 Os08g08820 유전자는 특이적으로 인식하지 않고, 상동성 영역에 비특이적인 유전자 변이를 유도하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 일 양태에서, 본 개시는 전술한 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열, 특히 Os04g53540 유전자 내의 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 핵산 서열, 및 엔도뉴클레아제, 특히 Cas9을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 유전자(oshdstart2)의 편집을 유도하기 위한 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "유전체/유전자 편집(genome/gene editing)"은 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 타겟 지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전체 내지 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 개시의 목적상 상기 유전자 편집은 특히 Cas 단백질과 같은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 원하는 변이를 도입하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “엔도뉴클레아제” 또는 “엔도뉴클레아제 단백질”은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Cas9 단백질은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 타겟 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 타겟 DNA의 염기서열 근처에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기 쌍 사이를 추정하여 절단한다. 본 개시의 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질 복합체를 형성하여 식물체 내에서 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "CRISPR/Cas9" 또는 "CRISPR/Cas9 시스템"은 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용하여 원하는 유전자 염기서열을 절단하는 유전자 편집 도구로서, 유전자의 특정 타겟 위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도하는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의해 유전자를 편집한다. 이것은 구성적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "타겟 유전자"는 식물체의 유전체 또는 유전자 내에 있는 편집하고자 하는 특정 핵산, 예컨대 DNA를 의미한다.

본 개시의 일 양태에서, 상기 타겟 유전자는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 유전자(oshdstart2), 더 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이 유전자와 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 상동체, 유사체 등일 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.

본 개시에 따른 벡터는 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 핵산서열(DNA) 및 엔도뉴클레아제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템(발현 카세트)을 포함하는, 플라스미드와 같은 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제기점(replication origin), 프로모터, 작동유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 식물체의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위(예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 식물체의 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.

일예로, 본 개시에 따른 벡터는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA를 코딩하는 서열번호 3의 핵산 서열 및 상기 가이드 RNA와 작동가능하게 연결된 Cas9을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 특히 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)에 도입가능한 식물형질전환용 재조합 바이너리 벡터일 수 있다(도 3 참조).

일 실시형태에서 본 개시에 따른 벡터는 타겟 유전자의 편집용 벡터는 벼 유래의 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자를 특이적으로 인식하여 유전자 편집을 유도하는 가이드 RNA가 도입된 식물형질 전환용 재조합 벡터를 지칭할 수 있다.

본 개시에 따른 벡터는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자에 돌연변이를 도입하는 유전자 편집 효소, 바람직하게는 Cas9 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 개시에 따른 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 개시는 전술한 벡터를 유효성분으로 포함하는 OsHDSTART2를 코딩하는 유전자 편집용 조성물에 관한 것이다. 여기서, “OsHDSTART2 유전자”, “가이드 RNA”, 및 “벡터”는 앞서 설명한 바와 같다.

본 개시에 따른 OsHDSTART2를 코딩하는 유전자 편집용 조성물은 OsHDSTART2를 코딩하는 유전자, 더 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자의 특정 위치에 벼잎의 바깥쪽 잎말림 초형변이를 초래하는 돌연변이를 도입할 수 있다. 상기 돌연변이는 결과적으로 벼의 물 이용효율을 향상시킬 수 있다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 상기 벡터 또는 상기 조성물에 의해 도입된 돌연변이를 포함하는 변형된 OsHDSTART2를 코딩하는 유전자를 발현하는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 개시에 따른 형질전환 식물체는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “형질전환”은 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 식물세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다. 식물의 형질전환에 이용되는 식물 세포는 어떤 식물세포든 가능하다. 상기 식물세포는 배양세포, 배양조직, 배양기관 또는 전체 식물조직이다. 상기 식물조직은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 따라서, 식물조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관배양, 조직배양 또는 세포배양 상태일 수 있다.

상기 식물세포를 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "식물체"는 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 개시에 따른 상기 식물체는 배추, 애기장대, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류이며, 더욱 구체적으로는 벼(Orizaya stavia)일 수 있다.

본 개시에 따른 형질전환 식물체는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이가 발생하고, 잎의 물 이용효율이 증가된 식물체일 수 있다.

본 개시의 일 실시형태에서, 본 개시에 따른 벡터 또는 유전자 편집용 조성물에 의해 OsHDSTART2를 코딩하는 유전자가 편집된 형질전환 벼는 대조구인 야생형(삼광벼)에 비해 잎이 바깥쪽으로 말리는 초형변이를 나타낼 수 있다. 본 개시에 따른 형질전환 벼는 야생형 OsHDSTART2 단백질을 코딩하는 유전자의 995 bp 위치에 A 또는 C 삽입 돌연변이가 도입되어 결과적으로 조기 종결코돈이 생성됨으로써 변형된 OsHDSTART2 단백질을 발현할 수 있다(도 6 및 도 7 참조). 상기 OsHDSTART2 단백질은 야생형 단백질 대비 바깥쪽으로 잎말림을 촉진하는 활성을 나타낼 수 있다.

달리 말해서, 본 개시에 따른 형질전환된 벼는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 증대시키는 활성을 나타내는 변형된 OsHDSTART2 단백질을 발현하는 것일 수 있다.

본 개시에 따른 변형된 OsHDSTART2 단백질은 야생형 OsHDSTART2 단백질, 더 구체적으로 이 단백질의 START도메인에 변이가 도입되어 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 증대시키고/거나 물 이용효율을 증가시킬 수 있는 것이라면, 제한됨이 없이 본 개시의 범위 내에 포함되어야 한다.

본 개시에 따른 변형된 OsHDSTART2 단백질은 야생형 OsHDSTART2 단백질의 START도메인 영역을 코딩하는 염기 서열에 단일 염기 삽입 변이가 도입되어, 야생형 단백질에 비해 비정상적인 인산화모티브를 갖거나 이를 불포함하거나 적게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 특징을 나타내는 변이형 OsHDSTART2 단백질을 발현하는 형질전환 벼는, 제한됨이 없이, 본 개시의 범위 내에 포함되어야 한다

일 실시형태에서, 본 개시에 따른 변형된 OsHDSTART2 단백질은 서열번호 14, 16, 18, 20 중에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 유전자로부터 발현된 것일 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.

본 개시에 따른 형질전환 벼는 잎말림지수(leaf rolling index; LRI)가 야생형 벼에 비해 40% 이상의 잎 말림 현상이 더 증가한 것일 수 있다. 또한, 본 개시에 따른 형질전환 벼는 물 공급을 차단한 조건(None mode)에서 야생형(대조군)에 비해 토양의 수분 사용량이 낮은 특징을 보유할 수 있다. 본 개시에 따른 형질전환 벼는 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 나타내면서 낮은 물 손실율과 높은 물 이용효율을 나타내는 특징을 보유할 수 있다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 상기 형질전환 식물체 또는 상기 유전자가 편집된 식물체의 종자에 관한 것이다.

본 개시에 따른 종자는 잎 말림이 발생한 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 벼와 교배하여 얻은 자손 벼로부터 수득한 잡종 종자일 수 있다.

또 다른 일 실시형태에서, 본 개시는 서열번호 3의 염기서열을 특이적으로 인식하는 염기서열과 동일하거나 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 염기서열로 이루어진 OsHDSTART2 유전자 편집용 가이드 RNA를 포함하는 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsHDSTART2 유전자의 표적위치에 변이를 유도하는 단계를 포함하는, 바깥쪽으로 잎말림이 발생하고 잎의 물 이용효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 개시를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 개시를 예시하기 위한 것으로, 본 개시의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: OsHDSTART2 유전자 선발

SnRK2 단백질 키나제(SnRK2 kinase)는 ABA 신호전달을 매개하는 주요 양성 조절자(key positive regulator)로 식물의 스트레스 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 주목되고 있으나 작용 하위에 있는 표적 전사인자 유전자는 많이 알려져 있지 않다. SnRK2 단백질 키나제는 RXXS/T 아미노산 모티브의 세린/트레오닌 잔기를 인산화시키는 것으로 보고되어 있다.

먼저 공개 DB를 통해 벼 전사인자 유전자 2,839종의 아미노산 서열을 추출하고 SnRK2 단백질 키나제 인산화모티브(RXXS/T)를 포함하는 후보 전사인자군을 탐색하였고(도 1), 그 중에서 SnRK2 인산화 모티브를 다수 포함하고 있는 OsHDSTART2(Os04g53540) 유전자를 선발하였다(도 2). OsHDSTART2 유전자의 염기서열과 아미노산 서열은 표 1에 나타나 있다.

구분	서열
OsHDSTART2 염기서열 (서열번호 1)	ATGATGATCCCGGCGAGGCATATGCCGTCGATGATCGGCCGGAACGGCGCAGCGTACGGATCCTCATCGGCACTGTCACTCAGCCAGCCAAACTTGCTGGATAATCACCAGTTCCAGCAAGCGTTCCAGCATCAGCAGCAGCAGCATCATCTCCTTGACCAGATCCCGGCGACGACGGCGGAGAGCGGCGACAACATGATCCGCAGCCGTGCGTCCGACCCTCTCGGCGGCGACGAGTTCGAGAGCAAGTCCGGCAGCGAGAACGTCGACGGCGTCTCCGTCGACGACCAGGACCCCAACCAGCGGCCGCGCAAGAAGCGCTACCACCGCCACACCCAGCATCAGATCCAGGAGATGGAAGCATTCTTCAAGGAATGTCCACACCCAGATGATAAGCAGCGCAAGGAGCTGAGCCGGGAGCTCGGCCTGGAGCCTCTCCAAGTGAAGTTCTGGTTCCAGAACAAGCGCACCCAAATGAAGAACCAGCATGAGAGGCACGAGAACTCGCAGCTGCGGTCGGATAACGAGAAGCTCCGGGCCGAGAACATGCGGTACAAGGAGGCCCTGAGCAGCGCCTCCTGCCCCAACTGCGGCGGCCCCGCCGCCCTCGGCGAGATGTCCTTCGACGAGCACCACCTCCGCATCGAGAACGCCCGCCTCCGCGAAGAGATCGATAGGATATCGGCGATCGCGGCGAAGTACGTGGGGAAGCCAATGGTGCCGTTCCCGGTGCTGTCGAACCCGATGGCGGCGGCGGCGTCGCGGGCGCCGCTGGACCTCCCCGTGGCGCCGTACGGCGTGCCGGGCGACATGTTCGGCGGCGGTGGCGCCGGGGAGCTGCTGCGCGGGGTGCAGTCGGAGGTCGACAAGCCGATGATCGTGGAGCTCGCCGTGGCGGCGATGGAGGAGCTGGTCCGCATGGCGCAGCTGGACGAGCCGCTCTGGAGCGTCGCGCCGCCGCTCGACGCCACGGCGGCGGCGATGGAGACGCTCAGCGAGGAGGAGTACGCGCGCATGTTCCCCCGAGGGCTCGGCCCCAAGCAGTACGGGCTCAGGTCGGAGGCGTCCCGCGACAGCGCCGTCGTCATCATGACGCACGCCAACCTCGTCGAGATCCTCATGGACGCGAATCAGTACGCGGCAGTGTTCTCGAACATCGTGTCGAGGGCCATCACGCTGGAGGTGCTGTCCACCGGCGTCGCGGGGAACTACAACGGTGCATTGCAAGTGATGTCAGTGGAGTTTCAGGTGCCATCGCCACTGGTGCCAACGAGAGAGAGCTACTTCGTGAGATACTGCAAGCAGAACGCAGACGGGACATGGGCCGTCGTCGACGTCTCGCTGGACAGCCTCCGCCCTAGCCCCGTCCTCAAATGTCGCCGCCGTCCGTCAGGCTGCCTCATCCAAGAAATGCCCAATGGCTACTCCAAGGTGACGTGGGTGGAGCATGTGGAGGTGGACGACAGGTCGGTGCACAACATCTACAAGCTGCTGGTGAACTCCGGGCTGGCGTTCGGCGCGCGGCGGTGGGTCGGCACGCTGGACCGCCAGTGCGAGCGCCTCGCCAGCGTCATGGCCAGCAACATCCCCACCAGCGACATCGGCGTGATTACGAGCTCGGAGGGGAGGAAGAGCATGCTGAAGCTGGCGGAGAGGATGGTGGTGAGCTTCTGCGGCGGCGTGACGGCGTCGGTGGCGCATCAGTGGACGACGCTGTCCGGCAGCGGCGCCGAGGACGTCCGCGTCATGACGAGGAAGAGCGTCGACGACCCCGGGAGGCCCCCCGGCATCGTCCTCAACGCCGCCACCTCCTTCTGGCTCCCCGTCCCTCCCAAGCGCGTCTTCGACTTCCTCCGCGACGAATCCTCTCGCAGTGAGTGGGACATCCTCTCCAATGGCGGTATCGTTCAAGAAATGGCCCACATCGCCAATGGCCGGGATCAGGGCAACTGCGTCTCACTTCTTCGCGTCAACAGCTCGAACTCGAACCAGAGCAACATGCTGATCCTGCAGGAGAGCTGCACGGACGCGTCGGGGTCGTACGTCATCTACGCGCCGGTGGACGTGGTTGCGATGAACGTCGTGCTAAACGGCGGCGACCCGGACTACGTCGCGCTGCTGCCATCGGGCTTCGCCATCCTGCCCGATGGGCCGGCGCACGACGGTGGCGACGGCGACGGCGGCGTCGGCGTCGGCTCCGGCGGGTCGCTGCTGACGGTGGCGTTCCAGATACTGGTGGACTCCGTCCCGACGGCGAAGCTCTCGCTGGGGTCGGTGGCGACGGTGAACAGCCTCATCGCCTGCACGGTGGAGCGCATCAAGGCGGCCGTCTCCGGCGAGAGCAATCCGCAGTAG
OsHDSTART2 아미노산서열 (서열번호 2)	MMIPARHMPSMIGRNGAAYGSSSALSLSQPNLLDNHQFQQAFQHQQQQHHLLDQIPATTAESGDNMIRSRASDPLGGDEFESKSGSENVDGVSVDDQDPNQRPRKKRYHRHTQHQIQEMEAFFKECPHPDDKQRKELSRELGLEPLQVKFWFQNKRTQMKNQHERHENSQLRSDNEKLRAENMRYKEALSSASCPNCGGPAALGEMSFDEHHLRIENARLREEIDRISAIAAKYVGKPMVPFPVLSNPMAAAASRAPLDLPVAPYGVPGDMFGGGGAGELLRGVQSEVDKPMIVELAVAAMEELVRMAQLDEPLWSVAPPLDATAAAMETLSEEEYARMFPRGLGPKQYGLRSEASRDSAVVIMTHANLVEILMDANQYAAVFSNIVSRAITLEVLSTGVAGNYNGALQVMSVEFQVPSPLVPTRESYFVRYCKQNADGTWAVVDVSLDSLRPSPVLKCRRRPSGCLIQEMPNGYSKVTWVEHVEVDDRSVHNIYKLLVNSGLAFGARRWVGTLDRQCERLASVMASNIPTSDIGVITSSEGRKSMLKLAERMVVSFCGGVTASVAHQWTTLSGSGAEDVRVMTRKSVDDPGRPPGIVLNAATSFWLPVPPKRVFDFLRDESSRSEWDILSNGGIVQEMAHIANGRDQGNCVSLLRVNSSNSNQSNMLILQESCTDASGSYVIYAPVDVVAMNVVLNGGDPDYVALLPSGFAILPDGPAHDGGDGDGGVGVGSGGSLLTVAFQILVDSVPTAKLSLGSVATVNSLIACTVERIKAAVSGESNPQ

실시예 2: OsHDSTART2 gRNA 서열결정 및 유전자 편집 벡터 제작

2-1. OsHDSTART2 유전자를 교정하는 유효 가이드 RNA 서열 결정

CRISPR/Cas9 유전자 편집기술을 이용하여 OsHDSTART2 유전자의 기능을 조사하고 벼의 내재해성 형질을 개량하기 위한 목적으로 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여 먼저 OsHDSTART2 유전자에 대한 단일 guide RNA 서열(gRNA-OsHDSTART2)을 결정하였다. 이를 위하여 OsHDSTART2 단백질의 주요 기능성 영역인 START 도메인(도 2 참조)을 코딩하는 염기서열을 기준으로 공개데이터베이스 CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net)의 Cas-Designer를 이용하여 NGG 타입의 PAM 서열을 가지며 off-target 지수가 0이고 out-of-frame 점수가 60% 이상인 하기 gRNA 타겟 서열 (20 mer)을 결정하였다.

서열번호 3: gRNA-OsHDSTART2: 5'-GGCGATGGAGACGCTCAGCG-3'

2-2. 가이드 RNA가 도입된 식물형질전환용 바이너리 벡터 제작

단일 가이드 RNA를 pRGEB32 벡터에 클로닝하기 위하여 먼저 하기 한쌍의 OsU3 프라이머(서열번호 4: OsU3-F, 서열번호 5: OsU3-R)를 사용하여 381 bp의 1차 PCR 산물을 증폭하였다.

HindIII 제한효소 서열을 포함하는 하기 pRGEB32-HdIII 프라이머(서열번호 6)와 OsHDSTART2 유전자의 단일 가이드 RNA 서열(서열번호 3의 염기서열에 기초함)이 포함된 하기 합성 프라이머(서열번호 7: gRNA-OsHDSTART2-R1)가 포함된 가이드 RNA 카세트를 구축하였다. 상기 카세트를 이용하여 2차 PCR을 진행하였다. 2차 PCR 산물을 제한효소 BsaI과 HindIII로 절단한 후 pRGEB32 벡터의 BsaI과 HindIII 위치에 infusion 방법으로 클로닝하여 OsHDSTART2 유전자 편집 벡터(OsHDSTART2-pRGEB32 벡터)를 제작하였다(도 3 참조).

서열번호 4(OsU3-F): 5'-aag gaa tct tta aac ata cga aca gat cac tta aag-3'

서열번호 5(OsU3-R): 5'- tgc cac gga tca tct gca caa ctc-3'

서열번호 6(pRGEB32-HdIII): 5'-gac atg att acg cca ag ctt aag gaa tct tta aac ata c-3'

서열번호 7(gRNA-OsHDSTART2-R1)(굵은 글씨체는 gRNA 서열에 해당함):

5'- att tct agc tct aaa acc gct gag cgt ctc cat cgc ctg cca cgg atc atc tgc-3'

실시예 3: OsHDSTART2 유전자 편집 벡터가 삽입된 형질전환 벼의 제작 및 도입 벡터 확인

3-1. 형질전환 벼의 제작

실시예 2의 완성된 OsHDSTART2 유전자 편집 벡터를 아그로박테리아(Agrobacteria) LBA4404에 도입하여 형질전환 후, 하기 한쌍의 프라이머(서열번호 8: OsHDSTART2-R2; 서열번호 9: M13R)를 이용하여 colony PCR 방법으로 벡터가 도입된 아그로박테리아를 선발하였다.

서열번호 8(OsHDSTART2-R2): 5'-cgc tga gcg tct cca tcg cc-3'

서열번호 9(M13R): 5'-gcc gat aac aat ttc aca cag-3'

정확한 벡터의 도입을 검증하기 위해, 선발한 아그로박테리아로부터 플라스미드를 분리한 다음 전기영동을 실시했다.

도 4는 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터가 도입된 아그로박테리아(LBA4404)의 콜로니 PCR 분석을 나타낸 것이다. 도 4로부터, 완성된 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터에 도입된 가이드 RNA 카세트에 존재하는 인식서열을 확인할 수 있으므로, 이는 벡터가 아그로박테리아에 성공적으로 도입되었음을 입증한다.

상기 형질전환된 아그로박테리아를 삼광벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 접종하고, 하이그로마이신 30 μg/ml을 포함하는 선발 배지에서 형질전환 캘러스를 선발한 후, 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 생산하였다.

3-2. 형질전환 벼의 OsHDSTART2 유전자 편집 벡터 도입 여부 검정

OsHDSTART2 형질전환 벼의 잎에서 게놈 DNA를 분리한 후 OsHDSTART2 유전자와 벡터에 특이적인 프라이머(서열번호 8: OsHDSTART2-R2; 서열번호 9: M13R) 및 Cas9에 특이적인 프라이머(서열번호 10: Cas9F; 서열번호 11: Cas9R)를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다.

서열번호 10(Cas9F): 5'-gag aac atc gtg atc gaa at-3'

서열번호 11(Cas9R): 5'-tct cgg cct tgg tcagat tg-3'

구체적으로, 도 5에는 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터 도입 형질전환 벼 T0 독립 계통 20종의 게놈 PCR 분석 결과가 나타나 있다. 도 5를 참고하면, Cas9 프라이머(Cas9F/R)에 의해 증폭된 영역을 전기영동한 사진에서 형질전환벼 12 계통에서 목적한 Cas9 유전자에 해당하는 494bp PCR 산물을 확인하였다(도 5; Cas9F/R 밴드). 또한 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터와 OsHDSTART2 gRNA 서열 특이적인 프라이머(OsHDSTART2-R2/M13R 밴드)에 의해 증폭된 영역을 전기영동한 사진에서 형질전환벼 12 계통에서 목적한 453bp PCR 산물을 확인하였다(도 5; M13/Gene). 따라서, 형질전환벼 중 약 60%에서 유전자 편집 벡터가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다.

실시예 4: OsHDSTART2 유전자 편집 벡터가 삽입된 형질전환벼의 편집된 유전자 염기서열 확인

OsHDSTART2 유전자 편집 벡터 도입이 PCR로 확인된 형질전환 벼를 대상으로 유전자 편집 위치의 염기서열 변이를 분석한 결과, 모두 표적 유전자 위치에서 동형접합(homozygous) 또는 이형접합(heterozygous)의 염기서열변이가 일어난 것을 확인하였다. 따라서 서열번호 3의 염기서열을 특이적으로 인식하는 가이드RNA가 포함된 CRISPR/Cas9 편집 벡터를 이용하였을 때 표적 유전자인 OsHDSTART2의 편집 효율이 실질적으로 100%에 달하는 것을 확인하였다.

도 6은 OsHDSTART2-pRGEB32 벡터가 도입된 형질전환 벼 4계통의 표적 유전자 염기서열 변이(A) 및 아미노산 변이(B)를 나타낸 것이다.

도 6의 (A)를 참고하면, OsHDSTART2 유전자의 gRNA 위치에서 단일염기 삽입이 일어난 독립적인 동형접합체(homozygous) 형질전환 벼 3계통과 (oshdstart2-m05, m08, m17)과 이형접합체 (heterozygous) 형질전환 벼 1계통 (oshdstart2-m07)의 염기서열 변이를 확인할 수 있다.

또한, 삽입변이가 일어난 유전자가 인코딩하는 아미노산을 분석한 결과 도 6의 (B)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 야생형 OsHDSTART2 단백질이 784개의 아미노산으로 구성된 반면, 삽입변이가 일어난 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼에서는 조기 종결코돈이 생성되어 453개의 아미노산으로 이루어진 단백질 단편 형태(2가지 Type; Type m1, Type m2)로 생성된다는 것을 확인하였다.

실시예 5: 가이드 RNA 염기서열 인식 특이성 검정

OsHDSTART2 유전자의 가이드 RNA의 정확한 염기서열 특이성을 검증하기 위해 OsHDSTART2 유전자의 아미노산 서열을 기준으로 Blast 검색을 수행하여 Os04g53540과 가장 상동성이 높은 (85%) Os08g08820을 확인하였다. Os08g08820 유전자는 Os04g53540과 유사한 위치에 Homeodomain과 START domain을 가지고 있다 (도 7의 (A)). gRNA 서열(20mer)을 기준으로 Os08g08820은 Os04g53540과 4개의 염기서열의 차이를 보였으며, 아미노산 서열은 100% 일치하는 것을 확인하였다(도 7의 (B)).

목적하는 OsHDSTART2 가이드 RNA의 정확한 염기서열 특이성을 검증하기 위해 OsHDSTART2 유전자 편집이 확인된 동형접합체(homozygous) 3계통 (oshdstart2-m07, m08, m17)의 잎에서 genomic DNA를 분리하고, Os08g08820 유전자 특이적인 하기 프라이머 한쌍을 이용하여 gRNA 상동성 부위를 PCR로 증폭한 후 Sanger sequencing으로 염기서열을 분석하였다.

서열번호 12(Os08g08820G-726F): 5'-CGTCTCCTTCCCCGTCCTCTCC-3'

서열번호 13(Os08g08820G-1114R): 5'-GGATCTCGACGAGGTTGCTGTGC-3'

그 결과, 도 7의 (c)에서 나타난 것과 같이, Os08g08820 유전자 서열은 WT과 동일하였으며, 따라서 OsHDSTART2 유전자편집용 gRNA가 상동성이 높은 Os08g08820 유전자 위치를 비특이적으로 인식하지 않는 것을 확인하였다. 이는, 상동성 영역에서 비특이적인 유전자 편집이 일어나지 않았다는 것을 입증한다.

실시예 6: OsHDSTART2 유전자가 편집된 형질전환 벼 표현형 분석

6-1. 형질전환 벼의 잎 형태 분석

도 8은 OsHDSTART2 유전자가 편집된 형질전환 벼 호모계통의 잎 형태 분석을 나타낸 것이다. 도 8A를 참고하면, OsHDSTART2 유전자가 편집된 형질전환 벼의 잎이 대조구인 야생형 삼광벼에 비해 바깥쪽으로 말리는 초형변이가 일어난 것을 확인하였다.

또한, 출수 후 10일된 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼의 독립적 호모 계통 1종 (oshdstart2-m08)의 flag leaf의 잎말림지수(leaf rolling index; LRI)를 측정한 결과, 도 8의 (B)에서 확인되는 바와 같이, 대조군인 야생형 삼광벼의 FLRI가 10% 미만인데 비해, OsHDSTART2 유전자 편집 변이체 호모 계통(oshdstart2-m08)의 FLRI는 40% 이상으로 잎 말림이 현저하게 일어났음을 알 수 있다.

또한, 도8의 (C)에서 확인되는 바와 같이, 대조군인 삼광벼에 비해 flag leaf의 폭이 좁아지는 형태적 변이가 유도되었다.

6-2. 형질전환 벼 잎의 조직학적 분석

OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼의 잎 말림 초형과 연관된 세포 형태학적 원인을 flag leaf에 대한 파라핀 섹션 분석을 수행하였다. 도 9는 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼 잎의 조직학적 분석을 나타낸 것이다.

먼저, 대조구인 야생형 삼광벼와 oshdstart2-m08 유전자 편집 벼 flag leaf의 중앙 위치에서 약 2cm 잎 절편을 얻고 10% 포름알데하이드 용액에 12 내지 24시간 고정하였다. 일련의 에탄올로 순차적으로 탈수시킨 후 파라핀에 embedding하여 파라핀 블록을 제작하였다. Microtome을 이용하여 5um 두께로 section하여 slide glass 위에 올리고 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하였다.

이후, Aperio AT2 (Leica) 스캐너와 Imagescope 프로그램으로 획득한 이미지를 Image J 프로그램을 이용하여 면적과 길이를 측정하였다(도 9의 B에서, 좌측)

그 결과, OsHDSTART2 유전자 편집 돌연변이 벼에서, 잎을 구성하는 기동세포가 좁고 깊어지는 고유한 형태적 특성을 나타낸다는 것을 확인하였다.

6-3. 형질전환 벼 잎의 물 소모율 분석

OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼가 내건성 내지 물 이용효율을 높이는 목적으로 활용될 수 있는지를 조사하기 위하여 온도와 습도가 조절되는 정밀 환경 조절실에서 실시간 자동 무게 측정 장치(DroughtSpotter)를 이용하여 물 이용 형질을 분석하였다. 구체적으로, 물 공급을 차단한 조건(None mode)에서 시간에 따른 화분의 무게 변화를 측정하고, 낮 기간 동안의 물 손실율을 비교하였다.

도 10은 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환 벼와 야생형(삼광벼)의 물 이용 형질 분석을 나타낸 것이다. 도 10의 (A)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 30℃와 38℃ 조건에서 OsHDSTART2 유전자 편집 변이체가 대조군에 비해 토양 수분사용량이 낮으로 나타났다.

도 10의 (B)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 가뭄 스트레스에 의해 식물체내의 수분함량이 감소하면 잎의 온도가 올라가는 특성을 보이는데, 열화상 카메라 (FLIR P620)를 이용하여 열 이미지를 촬영한 후 FLIR Research 4.1 소프트웨어를 이용하여 잎의 온도를 측정한 결과, OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환체는 대조군인 삼광벼에 비해 잎의 온도가 3~4℃ 더 낮게 유지되는 것으로 나타났다.

따라서, 초형변이(잎말림)가 일어난 OsHDSTART2 유전자 편집 형질전환체의 잎이 낮은 물 손실율과 높은 물 이용효율을 나타내고, 고온 가뭄 조건에서 식물체의 수분 함량을 높게 유지하며, 고온 내지 가뭄에 대한 높은 내성을 나타낼 것으로 예측할 수 있었다.

따라서, 본 개시에 따른 잎말림 초형변이을 갖는 형질전환 벼는 특히 밀식 재배시 단위면적당 광합성에 참여하는 잎의 수 및 잎의 유효면적을 높일 수 있으며, 육종 과정에서 벼의 물 이용효율을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 가뭄 등과 같은 기후 변화에 적응력이 높을 것으로 기대된다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Rural Development Administration) <120> OsHDSTART2 gene inducing plant ideotype and use thereof <130> DP20220079 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsHDSTART2 <400> 1 atgatgatcc cggcgaggca tatgccgtcg atgatcggcc ggaacggcgc agcgtacgga 60 tcctcatcgg cactgtcact cagccagcca aacttgctgg ataatcacca gttccagcaa 120 gcgttccagc atcagcagca gcagcatcat ctccttgacc agatcccggc gacgacggcg 180 gagagcggcg acaacatgat ccgcagccgt gcgtccgacc ctctcggcgg cgacgagttc 240 gagagcaagt ccggcagcga gaacgtcgac ggcgtctccg tcgacgacca ggaccccaac 300 cagcggccgc gcaagaagcg ctaccaccgc cacacccagc atcagatcca ggagatggaa 360 gcattcttca aggaatgtcc acacccagat gataagcagc gcaaggagct gagccgggag 420 ctcggcctgg agcctctcca agtgaagttc tggttccaga acaagcgcac ccaaatgaag 480 aaccagcatg agaggcacga gaactcgcag ctgcggtcgg ataacgagaa gctccgggcc 540 gagaacatgc ggtacaagga ggccctgagc agcgcctcct gccccaactg cggcggcccc 600 gccgccctcg gcgagatgtc cttcgacgag caccacctcc 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ggcgggtcgc tgctgacggt 2220 ggcgttccag atactggtgg actccgtccc gacggcgaag ctctcgctgg ggtcggtggc 2280 gacggtgaac agcctcatcg cctgcacggt ggagcgcatc aaggcggccg tctccggcga 2340 gagcaatccg cagtag 2356 <210> 17 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oshdstart2-Type m2 <400> 17 Met Met Ile Pro Ala Arg His Met Pro Ser Met Ile Gly Arg Asn Gly 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Ala Leu Ser Leu Ser Gln Pro Asn Leu 20 25 30 Leu Asp Asn His Gln Phe Gln Gln Ala Phe Gln His Gln Gln Gln Gln 35 40 45 His His Leu Leu Asp Gln Ile Pro Ala Thr Thr Ala Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Asn Met Ile Arg Ser Arg Ala Ser Asp Pro Leu Gly Gly Asp Glu Phe 65 70 75 80 Glu Ser Lys Ser Gly Ser Glu Asn Val Asp Gly Val Ser Val Asp Asp 85 90 95 Gln Asp Pro Asn Gln Arg Pro Arg Lys Lys Arg Tyr His Arg His Thr 100 105 110 Gln His Gln Ile Gln Glu Met Glu Ala Phe Phe Lys Glu Cys Pro His 115 120 125 Pro Asp Asp Lys Gln Arg Lys Glu Leu Ser Arg Glu Leu Gly Leu Glu 130 135 140 Pro Leu Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn Lys Arg Thr Gln Met Lys 145 150 155 160 Asn Gln His Glu Arg His Glu Asn Ser Gln Leu Arg Ser Asp Asn Glu 165 170 175 Lys Leu Arg Ala Glu Asn Met Arg Tyr Lys Glu Ala Leu Ser Ser Ala 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro Ala Ala Leu Gly Glu Met Ser Phe 195 200 205 Asp Glu His His Leu Arg Ile Glu Asn Ala Arg Leu Arg Glu Glu Ile 210 215 220 Asp Arg Ile Ser Ala Ile Ala Ala Lys Tyr Val Gly Lys Pro Met Val 225 230 235 240 Pro Phe Pro Val Leu Ser Asn Pro Met Ala Ala Ala Ala Ser Arg Ala 245 250 255 Pro Leu Asp Leu Pro Val Ala Pro Tyr Gly Val Pro Gly Asp Met Phe 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Glu Leu Leu Arg Gly Val Gln Ser Glu Val 275 280 285 Asp Lys Pro Met Ile Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Met Glu Glu Leu 290 295 300 Val Arg Met Ala Gln Leu Asp Glu Pro Leu Trp Ser Val Ala Pro Pro 305 310 315 320 Leu Asp Ala Thr Ala Ala Ala Met Glu Thr Leu Thr Arg Gly Gly Val 325 330 335 Arg Ala His Val Pro Pro Arg Ala Arg Pro Gln Ala Val Arg Ala Gln 340 345 350 Val Gly Gly Val Pro Arg Gln Arg Arg Arg His His Asp Ala Arg Gln 355 360 365 Pro Arg Arg Asp Pro His Gly Arg Glu Ser Val Arg Gly Ser Val Leu 370 375 380 Glu His Arg Val Glu Gly His His Ala Gly Gly Ala Val His Arg Arg 385 390 395 400 Arg Gly Glu Leu Gln Arg Cys Ile Ala Ser Asp Val Ser Gly Val Ser 405 410 415 Gly Ala Ile Ala Thr Gly Ala Asn Glu Arg Glu Leu Leu Arg Glu Ile 420 425 430 Leu Gln Ala Glu Arg Arg Arg Asp Met Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ala 435 440 445 Gly Gln Pro Pro Pro 450

Claims (13)

1. 서열번호 3의 염기서열을 특이적으로 인식하여 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 편집을 유도하는 식물체 유전자 편집 유도용 가이드 RNA.
2. 제 1항에 있어서,
   가이드 RNA는 엔도뉴클레아제를 상기 OsHDSTART2 유전자의 표적 위치에 가이드하여 단일 염기의 삽입 변이를 유도하는 것인, 가이드 RNA.
3. 제1항에 있어서,
   OsHDSTART2 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 가이드 RNA.
4. 서열번호 3의 염기서열을 특이적으로 인식하여 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 편집을 유도하는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 유전자 편집용 벡터.
5. 제1항의 가이드 RNA 또는 제4항의 벡터를 유효성분으로 포함하는 OsHDSTART2 유전자 편집용 조성물.
6. 제4항의 벡터 또는 제5항의 조성물로 형질전환된 형질전환 식물체.
7. 제 6항에 있어서,
   야생형과 비교하여 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이가 증대되고 잎의 물 이용효율이 증가된 것인, 형질전환 식물체.
8. 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이를 증대시키는 활성을 나타내는 변형된 OsHDSTART2 단백질을 발현하는, 형질전환된 벼.
9. 제8항에 있어서,
   상기 변형된 OsHDSTART2 단백질은 서열번호 14 및 16 중에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인, 형질전환된 벼.
10. 제6항에 있어서,
    벼(Orizaya stavia)인 것인, 형질전환 식물체.
11. 제6항에 따른 형질전환 식물체 또는 그 자손 식물로부터 수득한 형질전환된 종자.
12. 서열번호 3의 염기서열을 특이적으로 인식하여 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 편집을 유도하는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 OsHDSTART2 단백질의 START도메인을 코딩하는 OsHDSTART2 유전자의 유전자 편집용 벡터를 준비하는 단계; 및
    상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 OsHDSTART2 유전자에 변이를 유도하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
13. 제12항의 제조방법에 의해 제조된, 야생형 대비 바깥쪽으로 잎이 말리는 초형변이가 증대되고 잎의 물 이용효율이 증가된, 형질전환 벼.