KR101376195B1 - 내건성 ａｇｐ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내건성을 갖는 AGP 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 건조 저항성 단백질의 세포내 수준을 조절하여 식물의 내건성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 내건성을 갖는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있으며, 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

Description

내건성 ＡＧＰ 유전자 및 이의 용도{Drought stress tolerant gene AGP and use thereof}

본 발명은 내건성 AGP(arabinogalactan protein) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포 내 수준을 조절하여 식물의 내건성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.

농업은 타 산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성이 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물 가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업 생산의 장과 생산물의 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동, 식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다.

한발(가뭄, 건조)은 강수부족으로 수량손실을 야기하거나 일정한 강수 기간이 없어 관개수에 의존하여 작물을 재배하는 것으로 한발은 재배기간 중 어느 때라도 발생할 수 있고 지역에 따라서는 연중 발생하기도 한다. 생육초기에는 이앙 시점이나 파종이 지연되고 중기에 발생한 한발이 지속되면 개화시기의 지연으로 수량에 치명적인 영향을 미친다. 우리나라는 연 강수량이 1,250 mm 정도로 풍부하지만 7-8월에 편중되어 있어 봄, 가을에는 반 건조성 기후의 성격을 띠고 있다. 따라서 봄, 가을은 상습적으로 한발이 일어나고 때에 따라서는 7-8월에도 강우가 부족하여 한해(旱害)를 입기도 한다.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물 개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다.

특히, 한발은 작물의 삼투압에 의한 수분 부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등도 야기한다.

현재 인구 증가에 따라 식량 증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836 천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업 생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 내건성을 부여하는 새로운 유전자를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 내건성이 향상된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 내건성을 부여하는 새로운 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 내건성을 부여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 내건성을 부여하는 새로운 유전자를 이용하여 내건성을 조절하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 내건성 AGP 단백질을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 AGP 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 AGP 유전자를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 AGP 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 내건성이 향상된 형질전환 식물체 세포를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 AGP 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 내건성을 부여하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 AGP 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물체의 내건성을 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 내건성 AGP 단백질에 관한 것이다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 건조에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 AGP의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 AGP의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 AGP와 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 AGP의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 AGP 단백질을 암호화하는 내건성 AGP 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 AGP 단백질을 암호화하는 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 혼성화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 AGP 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(수미 감자) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 내건성이 향상된 형질전환 식물체 세포에 관한 것이다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한 형질전환에 사용될 수 있는 균으로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.

상기 식물은 감자, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 담배, 배추, 고추, 유채, 상추 등의 식물일 수 있으며, 보다 바람직하게 본 발명의 유전자로 형질전환 시 높은 내건성을 보이는 식물은 감자이다.

본 발명의 일 실시예에서 재조합 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 감자에 접종하여 형질전환체를 제작하였다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 AGP 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 내건성을 부여하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물의 내건성을 조절하는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물의 내건성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 AGP 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 AGP 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1의 AGP 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, M1 RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형 또는 머리핀(hairpin) 형　또는　microRNA　형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 유전자에 대한 안티센스 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 AGP 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 형질전환시킴으로써 AGP의 세포내 발현 수준을 증가시켰다.

그리고 AGP의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, AGP의 과발현이 건조 스트레스에 대한 저항성을 가져 내건성을 크게 향상시킴을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 건조 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 내건성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

도 1. 수미 감자에 10% PEG 처리 후 RT-PCR 에 의한 AGP 유전자 발현 양상 분석
도 2. 식물 형질전환용 AGP 과발현 벡터의 모식도
도 3. 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 감자 형질전환체. A: 아그로박테리움 감염 조직, B: 감자 캘러스, C: shooting 유도 캘러스, D: 형질전환체.
도 4. AGP 형질전환 식물체에 12시간 오스모틱 스트레스 처리 후 스트레스 관련 Marker 유전자의 RT-PCR 방법을 이용한 각 유전자의 발현 정도 분석.
도 5. AGP 형질전환 감자의 내건성 및 오스모틱 스트레스 검정 결과
도 6. AGP 형질전환 감자 라인들의 오스모틱 스트레스 검정 결과

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 하기 실시예를 제시한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.

<실시예 1> AGP 유전자 분리 및 염기서열 결정

AGP 유전자의 건조 스트레스 처리 후 발현 양상을 확인하기 위하여 수미 감자를 10% PEG (Poly ethylene glycol 3350 분자량)가 첨가된 MS(Murashige and Skoog) 액체 배지에서 무처리, 30분, 3시간, 12시간, 24 시간 처리 후 AGP 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 도 1은 수미 감자에 10% PEG 처리 후 RT-PCR에 의한 AGP 유전자 발현 양상 분석 결과이다. 여기에서 보듯이, 오스모틱 스트레스 처리에 의해 시간이 지남에 따라 수미에 비해 발현량이 증가됨을 확인하였다.

따라서 이 AGP 유전자의 분리를 위하여 먼저 감자의 잎에서 전체 RNA를 추출하여 sprint RT complete oligodT(Clontech)를 이용하여 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 상기 단편을 증폭하기 위한 프라이머로 정방향 프라이머(sense primer) 5'-ATGGATAGAAAATTTGTATT-3'(서열번호 3)와 역방향 프라이머(antisense primer) 5'-TTAGAACAAGAGCCAGCTCA-3'(서열번호 4)을 합성하여 감자의 제1 가닥 cDNA를 주형으로 하여 Takara사의 Ex Taq 중합효소(polymerase)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 25회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동한 후 AGP 유전자로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.

수득한 AGP 예상 유전자를 Topo 2.1 vector(Invitrogen 사, TOPO TA Cloning kit)에 클로닝하고 X-gal이 첨가된 LB배지에 plating하여 얻어진 화이트 콜로니를 선발하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 그 결과 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석에 이용하였다.

염기서열 분석 결과 AGP 유전자로 결정하여 Genbank (GQ168938.1)에 등록하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 AGP 유전자를 확보하였다.

<실시예 2> AGP 과발현 형질전환용 벡터의 제작

상시 발현 프로모터로 알려진 pCaM35S 프로모터가 삽입된 pCAMBIA1300PT 상용 벡터에 감자에서 분리된 AGP 유전자를 연결하여 Binary vector를 완성하였다.

실시예 2에서 제조된 벡터의 모식도를 도 2에 나타내었다.

<실시예 3> 아그로박테리움 및 감자 형질전환체의 제작

AGP 유전자가 삽입된 binary vector를 아그로박테리움 (LBA4404)에 형질전환하기 위하여 freeze와 thaw를 2-3번 반복한 후, 37℃의 heat shock방법에 의해 형질전환(transformation)한 후 밤새도록 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에 두었다가 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 감자에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

감자 형질전환체를 얻기 위하여 2일간 MS 배지에서 배양하고 있던 감자 절간과 YEP 배지에서 배양한 아그로박테리움 형질전환된 유전자들을 함께 MS 액체배지에서 30분간 배양한 후 cefotaxime과 Hygromycin 이 첨가된 MS 고체배지에 옮겨 7일간 배양하였다. 다시 캘러스 유도 배지에 옮겨 7일간 배양한 후 1/5 Kanamycine이 첨가된 새로운 MS 배지에서 7일간 배양하였다. 슈팅(shooting) 유도를 위해 2주마다 새로운 배지에 옮겨 2번 반복하여 옮긴 후 슈팅(shooting) 후 발근이 되면 계대배양하여 AGP 유전자가 삽입된 AGP 유전자 과발현 형질전환체를 확보하였다.

도 3은 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 감자 형질전환체를 나타낸 것이다.

<실시예 4> 감자 형질전환체 검정 및 RT-PCR 을 이용한 과발현 검정

형질전환체임을 확인하기 위하여 Genomic DNA를 분리하여 PCR에 의해 AGP 유전자의 삽입 여부를 확인하였으며, 확인된 감자 형질전환체의 total RNA를 분리하여 RT-PCR에 의해 AGP 유전자의 과발현을 확인하였다.

pCaM35S 프로모터가 연결된 AGP 유전자가 삽입된 감자 형질전환체들은 AGP 유전자 22 라인 확보하였으나 그중 표현형에 이상이 있거나 유전자가 삽입되어 있지 않는 라인 들은 모두 제거하고 최종 발현 분석에 활용한 형질전환체들은 AGP 유전자 10 라인을 선발하였다.

도 4 에서 나타낸 것과 같이 AGP 유전자가 삽입된 감자 형질전환체 2, 4, 9, 10, 11, 22, 24, 25, 34 라인들에서 비교군인 수미에 비해 발현량이 증가됨을 확인하였다.

또한 AGP 유전자 형질전환체에 있어 다른 스트레스 관련 유전자와의 관련 여부를 확인하기 위하여 Lea2-2, ERD10B (early responsive to dehydration) 및 ZFP (Zinc finger protein)의 유전자의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과는 도 4에 나타내었다. 여기에서 보듯이, Marker gene들에 있어 비교군인 수미에 비해 몇몇의 라인에서는 발현량이 증가함을 확인하였다.

LEA2-2 유전자는 형질전환체 4, 11, 25, 34 라인들에서 수미에 비해 발현량이 증가 되었으며, ERD10B의 경우 형질전환체 4, 10, 11, 14, 22, 25, 34라인들에서 수미에 비해 발현량이 증가됨을 확인하였다. ZFP 유전자는 형질전환체 4, 10, 25, 34 라인들에서 수미에 비해 발현량이 증가됨을 확인하였다.

도 4는 AGP 형질전환 식물체에 12시간 오스모틱 스트레스 처리 후 스트레스 관련 Marker 유전자의 RT-PCR 방법을 이용한 각 유전자의 발현 정도 분석 결과이다.

< 실시예 5> AGP 형질전환 감자의 내건성 검정

AGP 유전자의 과발현 형질전환체임이 확인된 약 10 라인들에 건조 스트레스를 처리한 후 AGP 유전자 과발현 형질전환체가 건조 저항성을 가지는지를 확인하였다. 보다 구체적으로, 22℃ 배양실에서 3주간 계대 배양하고 3-5일간 순화시킨 후 온실에서 3주간 다시 재배하여 약 20cm 정도 키운 후 실험하였는바, 약 25℃ 정도의 온실에서 원예용 화분에 충분히 물을 주어 약 300-350g이 되도록 무게를 맞추고 건조시키기 시작하여 화분 무게가 약 150g 정도(약 건조 처리 3주 후임)에서 시든 정도를 확인하여 저항성을 확인하였다.

그 결과, 스트레스 저항성이 강한 것으로 알려진 식용 감자 ‘수미’와 ‘벡터(pCAMBIA1300PT)가 삽입된 감자’는 2주 건조 처리 후 시들었지만 AGP 유전자가 삽입된 형질전환체는 생존함으로써 건조 저항성을 나타냈다 (도 5, 좌측). 또한, 3주 건조 처리 후 다시 물을 공급한 결과 ‘수미’와 ‘벡터(pCAMBIA1300PT)가 삽입된 형질전환체’는 생존하지 못하는 반면 AGP 유전자가 삽입된 형질전환체는 다시 생존함을 확인할 수 있었다(도 5, 중앙).

도 5는 AGP 형질전환 감자의 내건성 및 오스모틱 스트레스 검정 결과를 나타낸 것이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 건조 조건 하에서 과발현체는 야생형인 수미 감자 및 벡터만 함유하는 pCaM35S 형질전환체에 비하여 3-5일 동안 생존율을 나타내었다. 상기 결과는 AGP의 발현으로 형질전환 감자의 내건성이 증진되었음을 증명한 것이다.

또한, 오스모틱 스트레스에 의한 건조 내성을 확인하기 위하여 0.3% PEG 을 첨가한 MS 고체배지에 형질전환체의 각각의 라인들을 계대배양하여 3주간 키운 후 오스모틱 스트레스에 의한 건조 내성을 확인하였다(도 5, 우측).

< 실시예 6> AGP 형질전환 감자의 오스모틱 스트레스 확인

과발현 형질전환체의 건조 삼투내성 검정을 위하여 AGP 유전자가 삽입된 형질전환 감자를 무균 상태의 배양실에서 0.3% PEG가 첨가된 MS고체 배지에서 14일과 21일 처리 후 각각의 라인들의 오스모틱 스트레스 반응에 대해 조사하였다. 도 6은 AGP 형질전환 감자 라인들의 오스모틱 스트레스 검정 결과이다. 여기에서 보듯이, 3, 11, 22, 32, 34 라인들에서 강한 건조 삼투내성을 나타냄을 확인하였다.

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Claims (9)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 내건성 AGP(Arabinogalactan protein) 단백질.
2. 제 1 항의 단백질을 암호화하는 AGP 유전자.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 AGP 유전자.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제 4 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 내건성이 향상된 형질전환 식물체 세포.
6. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 AGP 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 내건성을 부여하는 방법.
7. 제 1 항에 따른 AGP 단백질을 과발현시켜 식물체의 내건성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 내건성을 조절하는 방법.
8. 삭제
9. 제 7 항에 있어서,
   상기 단백질을 과발현시키는 방법은 이 프로모터에 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 식물에 형질전환하는 것을 특징으로 하는 방법.

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