KR101459532B1 - 무름병 저항성을 가지는 형질전환 식물체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무름병 저항성이 증가한 형질전환 식물체에 대한 것이다. 보다 상세하게는 BrWRKY12 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 식물세포를 형질전환하여 BrWRKY12 유전자를 과발현하여 무름병에 대해 높은 저항성을 가진 형질전환 식물체에 대한 것이다.

Description

무름병 저항성을 가지는 형질전환 식물체 및 이의 제조방법{TRANSGENIC PLANT WITH RESISTANCE FOR SOFT ROT AND THE METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 채소류의 주요 병해인 무름병에 대한 저항성 유전자를 선별하고, 이러한 유전자를 이용해 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 개발하는 것에 관한 것이다.

식물의 병 또는 해충에 의한 피해는 자연재해와 더불어 인류의 안정적 식량 확보의 가장 큰 장애가 되어 왔다. 일반적인 통계에 의하면 식물의 병 또는 해충에 의한 손실은 각각 전체 생산량의 10% 정도에 이르는 것으로 나타나고 있으며 생산된 작물의 병해충에 의한 질 저하까지 고려한다면 훨씬 높은 수치를 보일 것이다. 또한 기상이변이나 특수한 환경 변화에 의한 일정 병해충의 대발생은 커다란 사회문제를 일으키는 경우도 있다.

이와 같은 병해충 방제를 위한 노력의 일환으로 인공 합성된 농약을 개발하여 방제에 이용하는 방법이 농업에 주로 이용되어 왔다. 그러나 인구의 끊임없는 증가로 인해 더 많은 양의 식량 확보가 필요하게 되면서, 이를 위한 양질의 동일품종의 대량재배는 병해충의 대량발생으로 이어지고 이들의 방제를 위한 합성 농약의 남용으로 인해 자연 생태계의 파괴는 물론 잔류독성, 인축에 대한 독성, 및 약제 내성인 새로운 병해충의 출현 등의 문제가 최근 들어 크게 야기되어 왔다. 이를 대체하기 위하여 신농약(저독성농약, 천연물농약 또는 생물농약)의 개발을 위한 연구가 진행되고 있으나, 그 개발속도가 수요를 충족시키지 못하고 있다. 또한 근래에 크게 일고 있는 환경보호운동과 오염되지 않은 청정농산물을 취하려는 인류의 성향은 인축에 해가 없고 잔류독성이나 자연생태계 파괴의 우려가 없는 새로운 방법을 절실히 요구하고 있다.

최근에 들어 유전공학기술이 발달되면서 병 저항성 형질전환 식물이 농약을 적게 사용하면서도 안정적인 식량작물을 생산할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 식물의 병 저항성 기작을 연구하여 인축 및 환경에 독성이 없는 새로운 개념의 식물보호제를 개발하려는 시도가 선진국을 중심으로 이루어지고 있다.

한편 무름병(bacterial soft rot)은 식물, 특히 배추의 잎 줄기 뿌리에 수침상(水浸狀)의 반점이 생기기 시작하여 빠른 속도로 확대되어 포기 전체가 썩게 되는 병해이며, 흰빛썩음병이라고도 한다. 재배기간과 저장 수송 중에도 나타나는 병으로, 특히 줄기의 아래쪽 토양과 인접한 부분에서 발병하기 쉽다. 무에서는 근두부(根頭部)에 발병하여 수침상으로 물렁하게 되고, 무의 중심부가 연부(軟腐)하여 속이 비게 된다. 세균에 의해서 발병하며 종자, 병든잎 뿌리, 토양곤충의 번데기에서 월동하고 다음해에 전염원이 된다. 병 발생은 온도와 밀접한 관계가 있으며 여름에 뿌린 배추에 특히 피해가 많다.

즉, 이러한 무름병은 지금까지 방제가 어려워 그 손실을 막을 방법이 현실적으로 없었다. 따라서 이러한 무름병에 저항성인 품종을 육성할 필요성이 끊임없이 대두되어왔다.

이에, 본 발명자들은 무름병 저항성 증진방법에 관해 연구를 하던 중, 배추 유래 BrWRKY12 유전자가 식물체의 무름병에 대해 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제2002-0064386호

본 발명의 목적은 무름병 저항성을 증진시킬 수 있는 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 무름병 저항성이 높아진 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체에서 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 BrWRKY12(Brassica rapa WRKY12) 단백질의 세포 내 수준(level)을 증가시켜 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 방법으로 무름병 저항성이 증진될 수 있는 식물체로는 이에 제한되지 않지만, 배추, 무, 상추, 가지, 국화, 및 백합이 있을 수 있으나, 바람직하게는 무름병의 대표적인 피해 채소인 배추, 상추이다.

상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 BrWRKY12 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 BrWRKY12 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 BrWRKY12 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 과발현시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.

상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함된다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 215 개의 아미노산으로 이루어진다.

상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 BrWRKY12 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrWRKY12 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrWRKY 유전자는 945개의 핵산으로 이루어진다.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 BrWRKY12 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.

상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 무름병에 대한 저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrWRKY12의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다 . 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrWRKY12의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과의 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 BrWRKY12 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 배추 유래 BrWRKY12 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.

또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 단백질의 활성, 즉, 무름병에 대한 저항성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 BrWRKY12 유전자는 적합한 발현벡터, 즉 재조합 발현벡터 내로 삽입되어 식물 세포를 형질전환 할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 또한 무름병 저항성을 증진시키는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 BrWRKY12 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrWRKY12 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 발현벡터는 본 발명에 따른 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 유전자는 발현조절서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다.작동 가능하게 연결(operably linked)된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다

상기발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열로써, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 "프로모터"란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 유전자를 과다발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다. 식물 세포 내로 본 발명의 유전자를 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열(예를 들어, pCAMBIA2300 벡터나 pCAMBIA2300 M2 HA2 벡터 등)과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 발명에 따른 유전자의 핵산 서열을 도입시키는 데 적합한 벡터를 선택할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 P35S 프로모터가 포함된 벡터 pB2GW7에 BrWRKY12 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 BrWRKY12-pB2GW7를 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 발현벡터의 식물체로의 도입은 당 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움-매개에 의한 방법, 즉 본 발명에 따른 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 식물 세포에 분사하여 식물 세포를 형질전환시키는 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 BrWRKY12 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공하며, 본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 무름병 저항성 식물체를 제공하고, 이러한 식물체로는 이에 제한되지 않지만, 배추, 무, 상추, 가지, 국화, 및 백합이 있을 수 있으나, 바람직하게는 무름병의 대표적인 피해 채소인 배추, 상추이다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 무름병 저항성 식물체는 BrWRKY12 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, BrWRKY12 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 전기천공법(electrophoration)에 의해 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대꽃에 분사시켜 형질전환시키고 종자를 채취하였다. T1종자를 온실에 파종하고 제초제에 살아남는 개체를 선발한 후 무름병균을 접종하여 무름병 저항성 식물체를 수득할 수 있다.

본 발명은 식물체에서 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 무름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 농약사용절감이 가능하고 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물공급이 가능하게 될 것이다.

도 1은 BrWRKY12 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 BrWRKY12-pB2GW7를 나타낸 것이다.
도 2는 BrWRKY12-pB2GW7로 형질전환된 애기장대의 BrWRKY12 과발현 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BrWRKY12-pB2GW7로 형질전환된 배추의 BrWRKY12 과발현 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 BrWRKY12-pB2GW7로 형질전환된 애기장대의 배추무름병 저항성을 나타낸 도이다;
(A) 배추무름병원균인 Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum 접종 후 균수를 측정한 그래프이다;
Bacterial population log: 지수화한 세균수;
BrWRKY12-OE: BrWRKY12 과발현하는 형질전환체들;
NT: 비형질전환체;
(B) 배추무름병 병징을 발병인자(disease index) (level 0, 1, 2)로 나타낸 그래프이다; 및
disease severity: 발병도.
도 5는 BrWRKY12-pB2GW7로 형질전환된 배추의 배추무름병 저항성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 배추 BrWRKY12 유전자 분리 및 과발현 벡터 제작

<1-1> 배추 유래 BrWRKY12 유전자 분리

본 발명자들은 국립농업과학원 유전체과로부터 배추(Brassica rapa) cDNA 클론을 분양받아 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열을 기반으로 BrWRKY 계통으로 유추되는 배추 유전자를 분리하였다.

그 결과, 분리한 유전자가 애기장대 WRKY12와 가장 유사함을 보여 BrWRKY12라 명명하였으며, 이를 서열번호 1로 기재하고 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열번호 2로 기재하였다.

<1-2> 배추 BrWRKY12 과발현 벡터 제작

본 발명자들은 배추 유래 BrWRKY12 유전자(GQ168839)를 과발현하는 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 엔트리 벡터(entry vector)를 만들기 위해 프라이머 A (서열번호 3)와 프라이머 B (서열번호 4)를 이용하여 58 ℃에서 30 사이클로 증폭한 뒤, pENTR-DTOPO 벡터 (Invitrogen, USA)에 클로닝하였다. 클로닝 후 그린진바이오텍 (용인, 대한민국)에 의뢰하여 배추 유래 BrWRKY12 유전자가 벡터로 도입되었는지를 염기서열을 확인하였다. 유전자가 도입된 entry 벡터 및 LR clonase (Invitrogen, USA)를 이용하여 식물발현벡터인 pB2GW7 (Plant Genetics, Belgium)로 BrWRKY12 유전자 클로닝하여 형질전환용 벡터 BrWRKY12-pB2GW7를 제작하였다 (도 1).

프라이머 이름	서열(5'-> 3')	서열번호
프라이머 A	AAAAAGCAGGCTTCATGGAAGGAGGAGGAAGA	3
프라이머 B	AGAAAGCTGGGTAAAAGGAAGAGAGACAATCA	4

< 실시예 2> 배추 BrWRKY12 유전자 과발현 형질전환체 제작 및 과발현 검정

<2-1> BrWRKY12 유전자 과발현 애기장대에서의 과발현 확인

본 발명자들은 실시예 <1-2>에서 제작한 BrWRKY12-pB2GW7 벡터의 식물에서의 과발현을 확인하기 위하여 애기장대에 형질전환하였다.

구체적으로, BrWRKY12의 형질전환용 벡터 BrWRKY12-pB2GW7를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 전기천공법으로 도입시켰으며, 상기 균을 이용하여 4 주된 애기장대 꽃에 분사시켜 형질전환시킨 후 종자를 채취하였다. T1종자를 온실에 파종하고 2주 후에 제초제 (0.1% 바스타)에 살아남는 개체를 선발하였다. 선발된 애기장대의 총 RNA를 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여 제조사의 추천방법을 사용하여 분리하였다. 분리한 총 RNA 및 MMLV RTase(Promega, USA)를 이용해 cDNA를 만든 후 프라이머 C (서열번호 5) 및 프라이머 D (서열번호 6)를 이용하여 58 ℃에서 30 사이클로 증폭하여 전기영동한 뒤 아가로오스 젤로 유전자 과발현을 확인하였다.

그 결과, BrWRKY12가 과발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 2).

프라이머 이름	서열(5'-> 3')	서열번호
프라이머 C	AATGATGCGCATTCTAGTTCTTGG	5
프라이머 D	TTTGACCCCAAAAGTACACATGCAAC	6

<2-2> BrWRKY12 유전자 과발현 배추 제작 및 과발현 확인

본 발명자들은 실시예 <1-2>에서 제작한 BrWRKY12-pB2GW7 벡터를 배추에서 과발현 시키기 위하여 배추 형질전환체를 제작하였다.

구체적으로, 서울배추종자(농우바이오)에서 유도된 줄기부분을 MS배지에서 6일 동안 암배양, 1일 동안 광배양한 후 줄기부분을 1 ㎝로 잘라내고 CO배지(pH 5.8, sucrose 30g/ℓ, MS 4.43g/ℓ, NAA 0.01g/ℓ, BAP 0.05g/ℓ, AgNO₃ 0.08g/ℓ)에서 3일 동안 광배양한 후에 BrWRKY12-pB2GW7 벡터가 도입된 아그로박테리움을 접종하였다. 상기 균은 37 ℃에서 스펙티노마이신(spectinomycin)이 포함된 LB 75㎎/ℓ에서 1일 동안 배양하고 O.D가 0.8-1.0이 되도록 준비하였다. 접종 후 3일간 암배양하고 washig 용액(pH 5.8, sucrose 30g/ℓ, MS 4.43g/ℓ, NAA 0.01g/ℓ, BAP 0.05g/ℓ, AgNO₃ 0.08g/ℓ, cefotaxime 250㎎/ℓ)으로 씻어낸 후에 SM배지(pH 5.8, sucrose 30g/ℓ, MS 4.43g/ℓ, NAA 0.01g/ℓ, BAP 0.05g/ℓ, AgNO3 0.08g/ℓ, cefotaxime 250㎎/ℓ, PPT 3㎎/ℓ)에 옮겨주었다. SM배지에서 선발된 shoot가 나오면 rooting 배지(pH 5.8, sucrose 30g/ℓ, MS 4.43g/ℓ, cefotaxime 250㎎/ℓ, PPT 3㎎/ℓ)로 옮겨준 뒤 뿌리가 잘 형성되면 순화과정을 거쳐 흙에 이식한 후 온실로 옮겼다. 식물체가 적응되면 제초제 (0.1% 바스타) 저항성을 이용하여 형질전환체를 육성하였다. 제초제 저항성으로 선별된 배추 BrWRKY12 형질전환체의 총RNA를 분리하여 상기 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 cDNA를 만들고 프라이머 C 및 프라이머 D를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 아가로오스 젤로 BrWRKY12 과발현을 확인하였다.

그 결과, BrWRKY12가 과발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 3).

< 실시예 3> 배추 BrWRKY12 형질전환체의 배추무름병 저항성 검정

<3-1> BrWRKY12 유전자 과발현 애기장대의 배추무름병 저항성 확인

본 발명자들은 실시예 <2-1>에서 제작한 BrWRKY12 유전자 과발현 애기장대의 배추무름병에 대한 저항성을 확인하였다.

구체적으로, 배추무름병균 (Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum)을 PSA 배지에서 1일 동안 배양하였다. 배양한 균수를 10³/ml로 조정하여 주사기로 infiltration하여 접종한 2일 후에 균수를 측정하여 도 4A에 나타내었다.

또한, 배양한 균수를 0.9% NaCl에 OD600=0.02로 조정하여 5 ul을 이쑤시게로 상처낸 애기장대 형질전환체에 접종한 뒤 접종 1 내지 2일 후에 발병지수(disease index) (0,1,2)를 기준으로 하여 %로 도 4B에 나타내었다.

그 결과, 비형질전환체(NT)에서 보다 BrWRKY12 형질전환 애기장대에서 균수가 적고 병징도 완화되었음을 알 수 있었다 (도 4).

<3-2> BrWRKY12 유전자 과발현 배추의 배추무름병 저항성 확인

본 발명자들은 실시예 <2-2>에서 제작한 BrWRKY12 형질전환 배추의 배추무름병 저항성을 확인하였다.

구체적으로, 배추무름병균 (Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum)을 PSA 배지에서 1일 동안 배양한 뒤 균수를 10³/ml로 조정하여 주사기로 infiltration하여 접종하였다. 접종 2일 후에 형질전환 배추 시료를 채취하여 균수를 측정하였다.

그 결과, 비형질전환체인 대조군 배추에 비해 BrWRKY12 형질전환 배추에서 균증식이 억제되었으므로 BrWRKY12 형질전환체가 배추무름병에 대하여 저항성을 획득했음을 알 수 있었다 (도 5).

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> TRANSGENIC PLANT WITH RESISTANCE FOR SOFT ROT AND THE METHOD FOR PRODUCING THE SAME <130> p121087 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 945 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 aattcctgtt ggctccctgg ggaacattta taacgtaatt tataagatta aatatagaca 60 aaattagtgt gatacactat tcaaaaactg atacacaata gtcaacaaaa gggagattgg 120 gattacatca aatggaagga ggaggaagaa gagtagtagt taataattac gatctacaac 180 aagtgacgat ccaagagaat atgagcttcc tcattccatt tgaagaaacc aatgtcttaa 240 ccttcttttc tccctcttct tcatcttctc tctcatctcc ttctttcccc atccacaact 300 cttcttcaac cactaatact actcatgcac ctttggggtt tcctaataat cttcaggatg 360 gaggaccctt gggatcaaag gtggttaatg atgatcaaga taattttaga ggtgtaatta 420 acaatgatgc gcattctagt tcttggtgga gatcaagtag tgggagtgga gagtcgaaga 480 acaaagtgaa gataaggagg aaactaagag agccaagatt ctgtttccag acaaaaagcg 540 atgtagacgt tcttgacgat ggctacaagt ggcgtaaata cggtcagaaa atcgtcaaga 600 acagcctcca ccccaggagt tattacagat gcacacacaa caactgtagg gtgaagaaga 660 gagtggagcg gctgtcggaa gattgtagaa tggtgattac tacttacgaa ggtcgtcaca 720 gccacattcc ctctgatgaa tccaattctc ctgaccatga ttgtctctct tccttttaat 780 atctatcctt atctctctcc ccctacatat acatagacat gtgcacacat agatgtgtga 840 tatattgcat attttatgtt gcatgtgtac ttttggggtc aaactgcatg tgttttcaag 900 agtatatcat cagatgtttt gcataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 945 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Glu Gly Gly Gly Arg Arg Val Val Val Asn Asn Tyr Asp Leu Gln 1 5 10 15 Gln Val Thr Ile Gln Glu Asn Met Ser Phe Leu Ile Pro Phe Glu Glu 20 25 30 Thr Asn Val Leu Thr Phe Phe Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ser Pro Ser Phe Pro Ile His Asn Ser Ser Ser Thr Thr Asn Thr Thr 50 55 60 His Ala Pro Leu Gly Phe Pro Asn Asn Leu Gln Asp Gly Gly Pro Leu 65 70 75 80 Gly Ser Lys Val Val Asn Asp Asp Gln Asp Asn Phe Arg Gly Val Ile 85 90 95 Asn Asn Asp Ala His Ser Ser Ser Trp Trp Arg Ser Ser Ser Gly Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Lys Asn Lys Val Lys Ile Arg Arg Lys Leu Arg Glu Pro 115 120 125 Arg Phe Cys Phe Gln Thr Lys Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Asp Gly 130 135 140 Tyr Lys Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Val Lys Asn Ser Leu His 145 150 155 160 Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr His Asn Asn Cys Arg Val Lys Lys 165 170 175 Arg Val Glu Arg Leu Ser Glu Asp Cys Arg Met Val Ile Thr Thr Tyr 180 185 190 Glu Gly Arg His Ser His Ile Pro Ser Asp Glu Ser Asn Ser Pro Asp 195 200 205 His Asp Cys Leu Ser Ser Phe 210 215 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer A <400> 3 aaaaagcagg cttcatggaa ggaggaggaa ga 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B <400> 4 agaaagctgg gtaaaaggaa gagagacaat ca 32 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C <400> 5 aatgatgcgc attctagttc ttgg 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D <400> 6 tttgacccca aaagtacaca tgcaac 26

Claims (8)

1. 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는, 서열번호 2로 이루어지는 단백질로 발현되는 서열번호 1로 이루어지는 BrWRKY12(Brassica rapa WRKY12) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
   
4. 제 1항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 무름병 저항성이 증가한 형질전환 식물체.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 식물체는 배추, 무, 상추, 가지, 국화 및 백합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체.
   
6. 서열번호 1로 이루어지는 BrWRKY12 유전자를 과발현시켜 서열번호 2로 이루어지는 BrWRKY12 단백질의 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는 방법.
   
7. 삭제
8. 제 6항에 있어서, 상기 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 발현벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것인 방법.

Images