KR101326019B1 - 남세균 유래 내염성 ＳｙＤＢＳＰ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

남세균 유래 내염성 ＳｙＤＢＳＰ 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남세균(Synechocystis) PCC 6906 유래 SyDBSP 단백질을 암호화하는 유전자 및 SyDBSP 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyDBSP를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체 및 그의 종자에 관한 것이다.

Description

남세균 유래 내염성 ＳｙＤＢＳＰ 유전자 및 이의 용도{Salt-resistant SyDBSP gene from Synechocystis and uses thereof}
본 발명은 남세균 유래 SyDBSP (Synechocystis putative DNA binding stress protein) 유전자 및 상기 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체 및 그의 종자에 관한 것이다.
남세균을 포함한 조류는 유용 유전자원, 바이오에너지 (홍조류 에탄올 및 해조류 바이오디젤) 및 유용 바이오소재(홍조류 펄프)로 개발되고 있다. 최근 해조류 생명공학을 이용하여 기존의 해조류의 이용성을 넓혀서, 분자육종에 의한 신품종 개발, 의약 또는 산업적으로 중요한 유용단백질 또는 유용물질 생산의 bioreactor로서 해조류 연구가 진행되고 있다.
최근 남조류에서 발견된 유전자가 작물에 성공적으로 적용된 연구결과들이 보고되고 있다. 남세균 유래 유전자가 내염성 등의 스트레스 저항성 향상에 긍정적 효과를 미치며, 식물에 도입될 경우 식물의 생산성 향상 등의 효과가 보고되었다. 이는 남세균 유래 유용 유전자를 식물체에 도입함으로써 식물체의 특성을 개량함과 동시에 생산성 향상, 유용물질 생산 및 그 실용화 가능성이 현저히 높음을 시사한다. 예를 들면, 시네코시스티스(Synechocystis ) sp. PCC 6906의 히스티딘 키나아제(histidine kinases)와 cognate response regulators가 고장액 스트레스(hyperosmotic strss) 및 염 유도성 유전자(salt-inducible genes)의 발현을 조절함이 보고된 바 있다.
시네코시스티스 PCC6906은 담수종과 달리 해양에 서식하는 남세균으로서 해양 환경에 적응한 종이므로 염 스트레스(salt stress)에 대한 감수성(sensitivity)이나 저항성(resistance) 기작이 발달되어 있을 것으로 생각되므로 염 스트레스 조절 및 저항성 관련 유전자를 다수 보유하고 있을 것으로 추정된다.
작물 재배를 위해 관개를 하면 농경지 내의 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 황산염, 염소 같은 수용성 염의 농도가 증가하게 된다. 이 같은 염이 일정 수준 이상 토양에 축적되면 작물이 뿌리를 통해 수분을 흡수하는 기능이 타격을 입고, 식물 세포가 정상적인 대사활동을 할 수 없게 된다. 염의 농도가 높으면 높을수록 식물로 흡수되는 수분의 양이 감소하기 때문에 작물의 생산량이 감소할 뿐만 아니라 작물 자체가 아예 사멸하는 지경까지 이를 수도 있다.
관개농지의 작물생산량은 일반농지에 비해 3배 이상이며 점차적으로 관개 농지의 비율이 높이지고 있는 실정이다. 따라서 계속적인 관개용수의 사용은 토양의 염분 농도의 증가를 가져오며 궁극적으로는 작물 생산성이 감소하며, 종자 사용량 및 시비량이 증가하게 된다. 또한 환금성이 높지 않은 내염성이 높은 작물만의 경작으로 경제력이 낮아지며 염분에 의한 토양부식이 심한 관개농지의 유기로 인해 식량자원의 고갈을 초래하게 되고, 아울러 작물생산성 감소는 노동력의 낭비도 동시에 초래하게 된다.
이와 같은 염에 의한 피해는 작물의 생산성을 심각하게 제약하는 요인 가운데 하나로 해결이 어려운 농학 분야의 난제에 속한다. 미국 농무성(U.S. Dept. of Agriculture)에 따르면, 전 세계적으로 농경지 가운데 1,000만 헥타르에 이르는 면적이 매년 관개(irrigation)에 따른 염화로 인해 사라지는 것으로 보고되었다. 농경지의 염화 문제를 해결하기 위해 많은 학자들이 교배와 같은 품종 개량법을 통해 내염성 작물을 개발하려는 연구를 시도해 왔지만 뚜렷한 성과를 얻지는 못했다.
따라서 주요 식/작물에 대하여 내염성을 유도하는 새롭고 획기적인 기술이 요구되고 있다. 많은 연구자들이 외래유전자를 식/작물에 형질전환하여 내염성을 높이는 연구를 수행하고 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 남세균 유래의 SyDBSP 유전자를 분리하고, 이를 식물체에서 과발현시켰을 때, 식물체의 내염성이 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 남세균(Synechocystis) PCC 6906 유래의 SyDBSP (Synechocystis putative DNA binding stress protein) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 SyDBSP 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 SyDBSP 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyDBSP 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체 및 그의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 SyDBSP 유전자를 포함하는, 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SyDBSP 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 SyDBSP 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있다. 상기 내염성이 증가된 형질전환 식물은 특히 간척지 및 산간 경사지 등이 많은 국내에서 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
도 1은 SyDBSP 유전자의 염기 서열이다.
도 2는 SyDBSP 유전자의 아미노산 서열이다.
도 3은 여러 남세균 간의 SyDBSP 유전자의 아미노산 서열의 유연관계 (A) 및 상동관계 (B)를 보여준다.
도 4는 본 발명에 사용된 형질전환 벡터이다.
도 5는 SyDBSP 형질전환 담배의 선발을 위한 PCR (A), 서던 분석 (B), 유전자 발현 정도의 실시간 PCR(Real-time PCR) (C) 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 SyDBSP 형질전환 애기장대의 유전자 발현 정도의 실시간 PCR(Real-time PCR) (A) 및 내염성 (B: NaCl 처리 후의 엽록소 함량) 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 SyDBSP 형질전환 개구리밥의 선발을 위한 PCR (A) 및 내염성 (B: 형질전환 개구리밥의 100mM NaCl 함유 배지에서의 생존 및 분화) 결과를 나타내는 그림이다.
도 8은 SyDBSP 형질전환 포플러의 선발을 위한 PCR (A) 및 유전자 발현 정도의 실시간 PCR(Real-time PCR) (B) 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 SyDBSP 형질전환 포플러의 내염성 결과를 나타내는 그림이다. A: SyDBSP 유전자 형질전환 포플러의 NaCl 함유 배지에서의 내염성; B: SyDBSP 유전자 형질전환 포플러의 NaCl 함유 신초(shoot) 재생 배지에서의 신초 재생 결과; C: 450mM NaCl 용액 24시간 처리 후 SyDBSP 유전자 형질전환 포플러의 내염성 (C-1) 및 Fv/Fm 값 변화 (C-2).
도 10은 SyDBSP 형질전환 포플러의 엽록소 함량 변화를 나타내는 그림이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 남세균(Synechocystis) PCC 6906 유래의 SyDBSP (Synechocystis putative DNA binding stress protein) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 SyDBSP 단백질의 범위는 남세균(Synechocystis) PCC 6906으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 유사한 기능적 특성을 갖는 단백질을 말한다.
또한, 본 발명은 상기 SyDBSP 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 SyDBSP 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SyDBSP 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 더욱 바람직하게는 도 4에 기재된 개열지도를 갖는 형질전환 벡터일 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터, 벼 유래 Clp 프로모터일 수 있다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.
터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 클라포란 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyDBSP 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽식물뿐만 아니라 단자엽식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명에 따른 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 내염성 식물체는 SyDBSP 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 신초의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, SyDBSP 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 신초의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 내염성 식물체를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한, 내염성이 증가된 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 형질전환되어 내염성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물일 수 있다. 상기 단자엽식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마, 생강 및 개구리밥이 있다. 쌍자엽식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 담배, 애기장대, 가지, 고추, 토마토, 감자, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓, 무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 및 포플러 등이 있다. 바람직하게는 담배, 애기장대, 포플러 또는 개구리밥일 수 있다.
본 발명은 또한, SyDBSP 유전자를 포함하는, 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 SyDBSP 유전자를 포함하며, 상기 SyDBSP 유전자를 식물체 내에 도입하여 발현시키면 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 상기 SyDBSP 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 SyDBSP 유전자는 SyDBSP 유전자 서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 "내염성"은 삼투 스트레스, 또는 물과 토양 내의 염류 또는 이온들에 의해 야기되는 스트레스 하에서 성장하기 위한 어떠한 식물들의 능력을 뜻한다. 예를 들면, 동일한 종들의 다른 식물의 성장에 불이익이 되는 물과 이온의 혼합물을 포함하는 액체로 수분을 공급하거나, 또는 그러한 배지로 경작되었을 때, 동일한 종 및/또는 변종 식물과 비교하여 증가된 성장 속도를 갖는 식물은 내염성이 있는 것이 된다.
본 발명은 또한, SyDBSP 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험방법
1. 핵 형질전환 벡터 제작
시네코시스티스(Synechocystis) PCC6906의 SyDBSP 유전자를 시네코시스티스 PCC6906 게놈 DNA에서 프라이머 5'-gctctagaATGACTTCAATTAATATCGGTATT-3' (프라이머 서열번호 3, XbaI site는 밑줄로 표시함)와 5'-cgggatccCTATTTGTTCAGAACCCGGAGCAT-3' (프라이머 서열번호 4, BamHI site는 밑줄로 표시함)를 이용하여 PCR 기법을 이용하여 증폭시켜 얻었다. 증폭하여 얻어진 유전자를 TA clonnig 벡터 (Solgent, Korea)에 클로닝하여 염기 서열을 확인하였다. 염기 서열이 확인된 SyDBSP 유전자를 XbaI/BamHI으로 잘라서 pHC21B에 서브클로닝하여 pHC21B-SyDBSP라 명명하였다. 이때 유전자의 삽입방향은 제한효소의 절단 크기 및 PCR 결과를 바탕으로 확인하였다. 이 벡터를 이용하여 각각의 식물체에 형질전환하여 SyDBSP 유전자를 도입하였다.
2. 식물 형질전환과 생육조건
2-1. 담배 핵 형질전환 및 생육 조건
SyDBSP 유전자가 도입된 pHC21B::SyDBSP 형질전환벡터를 동결 해동(freeze thaw) 방법으로 아그로박테리움 GV3101(Agrobacterium GV3101)에 형질전환하였다. 단일 콜로니를 100 mg/L 리팜피신(Rifampicin), 50 mg/L 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 YEP 배지에 접종하여 약 2일 동안 배양하였다 (28℃, dark shaking incubator). 기내에서 생육 중인 담배 잎의 가장자리를 제외한 부분을 약 5x5 mm2 크기의 절편체로 만들어 O.D 0.4-0.6으로 희석된 아그로(Agro) 용액 10 mL에 절편체를 기공이 위로 향하게 띄운 후, 암조건에서 약 2일간 공동배양 하였다. 공동배양 후 절편체를 멸균 증류수로 2회, 500 mg/L 카베니실린(Carbenicillin) 또는 클라포란(Claforan)이 첨가된 용액으로 1회 세척하여 멸균 페이퍼 타올에서 물기제거 후, 신초(shoot) 재분화 배지 (MS + 2 mg/L (또는 1 mg/L) BA + 0.1 mg/L NAA + 500 mg/L 카베니실린 또는 클라포란 + 100 mg/L 카나마이신)에 기공이 위로 향하게 치상하여, 25℃, 16시간 일장조건에서 배양하였다. 배양 3-4주 후에 절편체에서 발생한 신초(shoot)를 잘라내어 MS 발근 배지 (MS + 500 mg/L 카베니실린 또는 클라포란 + 100 mg/L 카나마이신)로 옮겨 발근시킨 후 토양에 이식하여 식물 생장 조절실(Phytotron)에서 생육시켰다.
2-2. 애기장대 형질전환 및 생육 조건
애기장대(Arabidopsis thaliana) 종자를 4일간 4℃의 암조건에서 저온 처리 후 토양에 파종한 다음, 약 4주 후 내염성 유전자가 도입된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 매개로 진공침윤(vacuum infiltration) 방법에 따라 형질 전환을 수행하였다. 형질전환된 애기장대의 종자는 선발마커로 카나마이신이 함유된 MS 선별배지(1/2MS, 0.5g/L MES, 10g/L sucrose, 50mg/L kanamycin, 100 mg/L cefotaxime)에서 선발하고, 동형접합자만을 선발하여 실험에 이용하였다. 모든 생육은 25℃, 16시간 광주기의 약 80 μmol m-2s-1 쿨-화이트(cool-white) 형광 조건하에서 수행하였다.
2-3. 개구리밥 형질전환 및 생육조건
개구리밥 (Lemnaceae)의 엽상체 잎과 아그로박테리아를 이용하여 개구리밥에 형질전환을 시행하였다. 구체적으로 개구리밥의 엽상체 배양을 위한 배양배지로 MS 배지의 모든 무기염류 농도를 1/2로 낮추고 각각 1 mg/L BA, 0.4 mg/L 티아민 HCl(thiamine HCl), 100 mg/L 미오이노시톨(myoinositol), 30g/L 수크로스(sucrose) 및 4 g/L 겔라이트(Gelrite)가 첨가된 배지(1/2MS 1BA 배지)에 치상하여 25℃ 명배양 (약 80 μmol m-2s-1 광주기 16/8시간)하면서 개체 증식을 유도하였다.
증식된 개구리밥의 엽상체에 칼로 상처를 준 후, 내염성 유전자가 도입된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 배양액을 넣어준 후 실온에서 20분간 감염시켰다. 감염 후 아그로박테리움 투머파시엔스 균을 제거한 다음, 건조시킨 잎은 100 μM 아세토시린곤(Acetosyringon)이 첨가된 식물배양용 고체배지로 옮겨 25℃에서 72시간 암실에서 공동 배양하였다. 공동 배양된 잎은 300 mg/L 카베니실린(Carbenicillin)이 첨가된 브로스(broth)를 이용하여 3-4회 세척하여 표면에 붙어있는 아그로박테리움을 충분히 제거한 다음 10-20분간 방치하여 건조시킨 후, 선발 마커로 250mg/L 카나마이신과 300mg/L 카베니실린이 첨가된 선발배지로 옮겨 잎을 선발하였다. 선별배지 치상 후 분화되는 잎은 3주 간격으로 계대 배양하였다.
2-4. 포플러 형질전환 및 생육조건
포플러 형질전환을 위하여 기내 증식된 포플러(Populus alba X P. tremula var. glandulosa 웅성불임 돌연변이주)의 절간조직을 분리하여 사용하였다. 구체적으로 LB 액체배지에서 배양한 아그로박테리움 투머파시엔스를 150 μM의 아세토시린곤(Acetosyringon)을 첨가한 후 4주령 포플러의 절간 조직에 20분간 감염시키고, 감염시킨 절간조직을 0.85% NaCl에 넣어 세척한 후 여과지(filter paper)에 올려 잔존한 아그로박테리움 투머파시엔스를 흡착시켰다. 세척과정을 3회 반복하고, 항생제가 없는 CIM 배지(MS, 1 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.01 mg/L BA, pH 5.8)에서 이틀간 24℃ 배양실에서 배양한 다음, 배양된 절간조직을 CIM 배지(MS, 50mg/L kanamycin, 300 mg/L cefotaxime, 1 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.01 mg/L BA, pH 5.8)에 치상하여 3~4주간 캘러스(callus)를 유도하였다. 절간조직에서 캘러스가 형성 되면 SIM 배지(WPM, 50mg/L kanamycin, 300 mg/L cefotaxime, 1 mg/L zeatin, 0.1 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, pH 5.5)에 이식하여 약 8주간 신초(shoot)를 유도하였다. 유도된 신초(shoot)를 RIM 배지(MS, 50mg/L kanamycin, 300 mg/L cefotaxime, 0.2 mg/L IBA)에 이식하여 발근을 유도하였다.
RIM 배지(MS, 50mg/L kanamycin, 300 mg/L cefotaxime, 0.2 mg/L IBA)에서 발근이 유도된 식물체의 잎조직으로부터 게놈(genomic) DNA를 추출하여 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 형질전환 식물체를 선별하였다.
발근이 유도되어 선별된 포플러를 배지에서 꺼내 증류수를 이용하여 뿌리에 묻어있는 배지를 씻어내 준 다음, 멸균된 토양을 밀폐된 용기에 담아 적당히 증류수로 적셔준 후, 뿌리가 상하지 않게 잘 심어주고, 다시 밀폐하여 24℃ 배양실 (16시간 명배양, 8시간 암배양)에서 약 20일간 생육시켰다.
3. 서던 분석
형질전환 식물체의 잎으로부터 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 총 게놈 DNA를 분리하였으며, 약 4 ㎍ 게놈 DNA를 EcoRV (담배 형질전환체의 경우)로 잘라 1 % 아가로스 겔에서 전기영동한 후 Zeta-Probe GT Blotting Membrane (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 시네코시스티스(Synechocystis) PCC6906 게놈으로부터 5'-TCGGTATTCCTGAAGCTGATCGCA-3' 프라이머 (서열번호 5)와 5'-ATCCGACGCTAAAGAAGTGGTGGA-3' 프라이머 (서열번호 6)를 이용하여 약 500bp의 단편을 PCR을 이용하여 증폭한 후 방사선 동위원소 [32P] dCTP로 라벨하여 SyDBSP 유전자가 삽입된 것을 확인하였다. 예비혼성화(prehybridization) 및 혼성화(hybridization) 는 7 % (w/v) SDS가 들어있는 0.25 M 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.2) 버퍼에서 65℃에서 16시간 동안 수행하였으며, 5 % (w/v) SDS가 들어있는 0.2 M 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.2) 버퍼에 65℃, 30분씩 두 번 씻어내고, X-ray 필름에 3시간 반응시켜 확인하였다.
4. 실시간 PCR(Real-time PCR)
Trizol Reagent (GIBCOBRL, N.Y., USA)를 이용하여 담배와 포플러 잎으로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 총 RNA 5 ㎍을 oligo dT15와 M-MLV Reverse Transcriptase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
애기장대 종자를 소독하여 MS 배지(1/2MS, 0.5g/L MES, 10g/L sucrose, 100 mg/L cefotaxime)에서 발아시켜 25℃에서 16시간의 광주기로 40 μmolm-2sec-1의 쿨-화이트(cool-white) 형광하에서 7일간 배양한 애기장대로부터 RNeasy Mini kit (QIAGEN, Hilden, Germany)와 RNase-Free DNase Set(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 6㎍을 oligo dT15와 M-MLV Reverse Transcriptase(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
합성된 담배, 애기장대, 포플러의 cDNA는 SolGent™ Real-time PCR kit (Solgent, Daejeon, Korea) 및 DNA Engine Opticon 2 (MJ Research, Waltham, USA)를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
실시간 PCR에 사용된 각각의 프라이머 서열은 하기 표1에 나타내었다.
번호 명명 염기서열 서열번호
1 SyDBSP 증폭 및 PCR 확인용 프라이머-F 5'-gctctagaATGACTTCAATTAATATCGGTATT-3' 3
2 SyDBSP 증폭 및 PCR 확인용 프라이머-R 5'-cgggatccCTATTTGTTCAGAACCCGGAGCAT-3' 4
3 SyDBSP 서던용-F 5'-TCGGTATTCCTGAAGCTGATCGCA-3’ 5
4 SyDBSP 서던용-R 5'-ATCCGACGCTAAAGAAGTGGTGGA-3’ 6
5 SyDBSP Real-Time PCR 프라이머-F 5'-TCGGTATTCCTGAAGCTGATCGCA -3’ 7
6 SyDBSP Real-Time PCR 프라이머-R 5'-TGGAAGTTGTGGGTCTGGAGGTAA - 3’ 8
7 담배 control Real-Time 프라이머-F 5'-AAGGAGTGTCCCAATGCTGAGTGT -3’ 9
8 담배 control Real-Time 프라이머-R 5'-TCACCACCAGCCTTCTGGTAAACA- 3’ 10
9 애기장대 control Real-Time 프라이머-F 5'-TTTGACCGGAAAGACCATCACCCT-3’ 11
10 애기장대 control Real-Time 프라이머-R 5'-AAGACGCAGGACCAAGTGAAGAGT-3’ 12
11 포플러 control Real-Time 프라이머-F 5'-TGCAGGCATCCACGAAACCACATA -3’ 13
12 포플러 control Real-Time 프라이머-R 5'-GGCTAGTGCTGAGATTTCCTTGCT -3’ 14
5. 엽록소 함량 측정
애기장대의 경우, 1% 수크로스(sucrose)를 함유한 MS 배지에서 16시간:8시간 광주기로 5일간 생장시킨 30개의 식물체에 500 ㎕의 95% 에탄올을 첨가하였으며, 포플러의 경우는 잎 조각 (1.13 cm2)에 2㎖의 95% 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 암조건으로 18시간 정치배양하여 엽록소를 추출하였다. 추출된 엽록소는 분광광도계를 이용하여 OD664 .2 및 OD648 .6의 값을 측정하여 클로로필 A 및 클로로필 B 함량을 측정하였다. 엽록소의 함량은 클로로필 A 및 클로로필 B의 합으로 나타내었다.
6. 내염성 조사
애기장대는 1% 수크로스를 함유한 MS 배지에서 멸균된 종자 50개를 치상하여 5일간 배양하여 발아시킨 다음, 특정한 농도의 NaCl 및 1% 수크로스를 함유한 MS 배지에 옮겨 7일간 16시간:8시간 (명:암) 광주기로 5일간 생장시켰다. 이중 30개의 식물체를 엽록소 측정 방법으로 엽록소의 함량 변화를 측정하여 형질전환 애기장대의 내염성을 조사하였다.
개구리밥은 형질전환 식물체를 3주 간격으로 계대 배양하며 분화시킨 식물체를 특정 농도의 NaCl을 함유한 MS 배지에 치상하여 생존여부 및 분화를 대조구와 비교하여 내염성의 특성을 조사하였다.
포플러는 특정농도의 NaCl을 함유한 신초(shoot) 재생 배지에서의 형질전환 식물체 및 대조구의 신초 형성 여부로 기내에서 1차 내염성을 조사하였다. 형질전환 식물체를 토양에서 순화시킨 3주 후 300mM의 NaCl 용액에 24시간 침지한 다음, 0.1% 하이포넥스 용액으로 회복시키며 Handy PEA (Hansa tech. USA) 장비를 이용하여 Fv/Fm값 및 엽록소 함량 변화를 측정하여 형질전환 식물체의 내염성을 조사하였다. 내염성 포플러 형질전환 식물체 중 내염성이 가장 우수한 식물체 선발을 위해서는 순화 8주 후 450mM의 NaCl을 24시간 처리한 다음 Fv/Fm 및 엽록소 함량 변화를 측정하여 대조구와 비교하였다.
기타 언급되지 않은 실험 방법은 일반적으로 사용되는 식물 생육, 종자선발, 분자생물학적 방법에 따라 수행하였다.
실시예
실시예 1: 시네코시스티스(Synechocystis) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자
시네코시스티스(Synechocystis) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자의 염기 서열은 시네코시스티스 PCC 6906의 게놈을 분리하여 GS-FLX(Roche, USA)를 이용하여 전체 염기서열정보를 획득한 후 분리, 결정하였다. SyDBSP 유전자는 471개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며 156개의 아미노산 서열을 암호화한다 (도 1 및 2). 시네코시스티스 PCC6906 유래 SyDBSP 유전자의 아미노산 서열은 담수산인 시네코시스티스 PCC6803 slr1894와 동일성(identity) 80%, 양성(positive) 91%를 보여 유연관계가 가장 가깝다. 그 외 시네코시스티스(Synechocystis) PCC7002 A0031 및 사이아노테세(Cyanothece) sp. PCC 8801 4066 유전자와 유연관계가 높은 것으로 나타났다 (도 3).
실시예 2: 시네코시스티스 ( Synechocystis ) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자 형질전환 벡터와 형질전환 식물체의 선발
형질 전환 식물체 제조를 위하여 PCC 6906 게놈으로부터 SyDBSP 유전자를 프라이머 5'-gctctagaATGACTTCAATTAATATCGGTATT-3'(서열번호 3, XbaI site는 밑줄로 표시함)와 프라이머 5'-cgggatccCTATTTGTTCAGAACCCGGAGCAT-3'(서열번호 4, BamHI site는 밑줄로 표시함)을 이용하여 증폭 후, 제한 효소로 절단하였다. pHC21B 벡터의 XbaI/BamHI 위치를 제한 효소를 이용하여 절단하고 여기에 SyDBSP 유전자 단편을 삽입하여 핵 형질전환 벡터를 제조하였다 (도 4). 이 형질전환 벡터가 도입된 식물체는 선발마커인 카나마이신이 함유된 배지에서 형질전환체를 선발하였으며, 선발된 형질전환 식물체는 SyDBSP 유전자의 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 SyDBSP 유전자의 삽입을 확인하였다. 또한 각각의 형질전환 식물체에서의 SyDBSP 유전자의 발현은 실시간 PCR(Real-time PCR) 방법으로 발현정도를 조사하였다.
실시예 3: 시네코시스티스 ( Synechocystis ) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자 형질전환 담배 제조
시네코시스티스(Synechocystis) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자가 도입된 담배 형질전환 식물체로부터 T0 세대의 종자를 확보 및 소독하여 3% 수크로스와 50mg/L 카나마이신 함유 MS 배지에서 저항성을 보이는 식물체를 선발하여 T1 세대의 종자를 확보하였다. 확보된 종자로부터 식물체를 얻어 게놈 DNA를 분리하여 PCR 및 서던 분석하여 SyDBSP가 도입되었음을 확인하고 총(total) RNA를 분리하여 실시간 PCR 방법으로 도입된 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 도 5 A에 나타낸 바와 같이, SyDBSP 유전자 형질전환 담배 식물체 8종 중 6종에서 유전자 도입이 확인되었으며, 이들 형질전환 식물체 중 5종에 한 카피의 유전자가 삽입되었음을 확인하였다 (도 5 B). 또한, 형질전환 담배 식물체에서 SyDBSP 유전자가 과발현되고 있음을 실시간 PCR(Real-time PCR) 결과 확인할 수 있었다 (도 5 C).
실시예 4: 시네코시스티스 ( Synechocystis ) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자 형질전환 애기장대의 내염성
SyDBSP 유전자 형질전환 애기장대의 T1 종자를 소독하여 1% 수크로스를 함유한 배지에 치상한 후 4℃ 암조건에서 4일간 저온 처리한 다음 25℃, 약 80 μmolm-2sec-1의 쿨-화이트(cool-white) 형광, 16시간 광주기 조건에서 5일간 배양하였다. 배양된 식물체로부터 총 RNA를 분리하여 실시간 PCR을 이용하여 SyDBSP 유전자의 발현 정도를 조사하였다. 두 개의 독립라인에서 SyDBSP 유전자가 과발현됨을 확인하였다 (도 6 A).
이들 독립라인을 1% 수크로스를 함유한 배지에 치상한 후 저온처리 및 상기의 조건하에서 5일간 배양한 다음, 100, 150, 150mM NaCl을 함유한 MS 배지에 옮겨 동일 조간으로 7일 배양하였다. 이 중 30개의 식물체로부터 엽록소를 추출하여 함량을 측정한 결과 100mM 및 150mM NaCl 첨가 배지에서 대조구인 Col-0 보다 형질전환 애기장대가 상대적으로 높은 엽록소 함량을 나타내었다 (도 6 B). 이는 SyDBSP 유전자가 과발현된 애기장대가 NaCl에 대한 저항성, 즉 내염성의 특성을 획득하였음을 나타낸다.
실시예 5: 시네코시스티스 ( Synechocystis ) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자 형질전환 개구리밥의 내염성
개구리밥 조직배양 방법으로 제조된 SyDBSP 유전자 형질전환 개구밥의 선발을 위하여 형질전환 개구리밥으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR 방법으로 확인하여 4종의 형질전환 식물체를 확보하였다 (도 7 A).
이들 형질전환 식물체를 3주 간격으로 계대배양하며 분화를 유도하였으며, 내염성 측정을 위하여 100mM NaCl 함유 MS 배지에서 치상하여 25℃, 약 80 μmolm-2sec-1의 쿨-화이트(cool-white) 형광 및 16시간 광주기 조건하에서 생존 및 분화를 관찰하였다. 그 결과 대조구는 NaCl 함유 배지에서 치사하였으나, SyDBSP 유전자가 도입된 형질전환 개구리밥은 생존 및 분화가 진행됨을 관찰하였다 (도 7 B, 패널의 왼쪽: 대조구(WT), 패널의 오른쪽: 형질전환 개구리밥(Mutant)).
실시예 6: 시네코시스티스 ( Synechocystis ) PCC 6906 유래 SyDBSP 유전자 형질전환 포플러의 내염성
SyDBSP 유전자가 도입된 형질전환 포플러를 선발하기 위하여 SyDBSP 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 확인하였다 (도 8 A). 선발된 형질전환 포플러로부터 게놈 DNA를 분리하여 실시간 PCR로 도입 유전자의 발현정도를 확인한 결과 형질전환 포플러에서 과발현되고 있음을 확인하였다 (도 8 B).
이들 형질 전환 포플러의 내염성을 확인하고자 각 형질전환 포플러의 잎을 50mM 및 100mM NaCl을 함유한 신초(shoot) 재생 SIM 배지(WPM, 50mg/L kanamycin, 300 mg/L cefotaxime, 1 mg/L zeatin, 0.1 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, pH 5.5)에 치상하여 25℃ 광조건 하에서 8주간 배양하며 생존 및 신초(shoot) 재생을 관찰하였다. 그 결과 형질전환 포플러의 잎은 100mM NaCl 함유 배지에서 생존하였으며, 50mM NaCl 함유 배지에서 신초(shoot)가 재생됨을 확인하였다. 반면 대조구는 두 NaCl 농도 모두에서 치사함을 관찰하였다 (도 9 A, B). 형질전환 포플러를 토양으로 순화한 8주 후 450mM의 NaCl 용액에 24시간 침지한 다음, 0.1% 하이포낵스 용액을 2일 간격으로 관수하며 Fv/Fm 값을 측정하였다. 측정 결과, 대조구인 BH 라인은 NaCl 용액 처리 5일 후부터 Fv/Fm 값이 급격히 저하되었으나, SyDBSP 유전자 형질전환 포플러는 지속적으로 0.8 정도의 정상값을 유지하였다 (도 9 C-2). 또한 순화 후 3주째 형질 전환 포플러의 잎으로부터 약 1.13cm2의 잎 디스크를 제조하여 50, 100, 150mM NaCl 용액에 담가 엽록소 함량의 변화를 측정한 결과, 각각의 농도 하에서 대조구는 엽록소 함량이 급격히 감소되었으나, SyDBSP 형질전환 포플러는 상대적으로 높은 엽록소 함량을 유지하였다 (도 10). 따라서, 시네코시스티스(Synechocystis) PCC6906 유래 SyDBSP 유전자가 도입된 형질전환 포플러는 대조구에 비해 우수한 내염성의 특징을 보였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 남세균(Synechocystis) PCC 6906 유래의 SyDBSP (Synechocystis putative DNA binding stress protein) 단백질.
  2. 제1항의 SyDBSP 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제4항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyDBSP 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법.
  7. 제6항의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽식물 또는 단자엽식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 담배, 애기장대, 개구리밥 또는 포플러인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  10. 제7항에 따른 식물체의 종자.
  11. 제4항에 따른 벡터로 형질전환되어 SyDBSP 유전자가 과발현되어 내염성이 증가된 형질전환 식물체.
  12. 제2항의 유전자를 포함하는, 식물체의 내염성 증가용 조성물.
  13. 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진, SyDBSP (Synechocystis putative DNA binding stress protein) 유전자 증폭용 프라이머 세트.
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