KR100895611B1

KR100895611B1 - 남세균 유래 ＳｙＦＢＰ/ＳＢＰａｓｅ 유전자를과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR100895611B1
Application number: KR1020070107271A
Authority: KR
Inventors: 유장렬; 민성란; 정화지; 정원중; 김현태; 박주영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2009-05-06
Also published as: JP5273624B2; US20100218275A1; JP2011500081A; EP2215235A2; KR20090041648A; WO2009054660A2; WO2009054660A3; EP2215235A4

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 남세균(Synechocystis) PCC 6803 유래 FBP 단백질(SyFBP/SBPase)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyFBP/SBPase를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체 및 그의 종자에 관한 것이다.

SyFBP/SBPase, 식물 발현 벡터, 내염성, 종자

Description

남세균 유래 ＳｙＦＢＰ/ＳＢＰａｓｅ 유전자를 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시키는 방법{Method for increasing salt tolerance of plant by overexpressing SyFBP/SBPase gene isolated from Synechocystis}

본 발명은 남세균 유래 FBP/SBPase 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체 및 그의 종자에 관한 것이다.

남세균은 지구 생성 초기에 출현한 최초의 광독립 영양 생물로서 무산소상태의 원시 대기환경을 오늘날 유산소 대기 환경으로 전환시킨 중요한 생물체이다. 이 남세균은 고등식물의 엽록체의 기원으로 생각되며 광합성 기작을 통해서 태양빛을 에너지원으로 사용하여 물과 이산화탄소와 소량의 무기염으로부터 유기 물질을 생합성하여 독립 영양적으로 다량 증식할 수 있다. 또한 많은 남세균 종들은 질소를 고정할 수 있는 능력을 보유하고 있어서 다른 생물체들의 질소 동화작용을 돕고 있는 생태계의 중요 위치를 차지하고 있다.

재래 육종법과 분자육종법을 이용하여 바이오매스와 작물 생산량 증가를 위한 노력이 지속적으로 진행되고 있다. 엽록체는 엽록체를 구성하는 단백질과 광합 성 관련 단백질 합성 유전자를 자체적으로 생산하고 합성을 함으로서 식물에 필요한 영양분을 공급한다 (Sinclair, T.R. et al., 2004, Trends Plant Sci. 9, 70-75; Sharma-Natu P. and Ghildiyal, M.C. 2005, Current Science 88, 1918-1928). 지구상의 조류와 식물들의 광합성은 엽록체에서 일어나며 명반응 과정에서 생성된 ATP와 NADPH를 소비하여 Calvin cycle 을 이용하여 대기 중의 CO₂를 식물이 이용하는 초기 탄수화물로 고정하는 것이다. 이러한 Calvin cycle 과정에 많은 효소들이 사용이 되는데 주요 효소로서 phosphoribulokinase (PRK), ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), chloroplastic fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) 및 sedoheptulose 1,7-bisphosphatase (SBPase) 들이 있다. 이러한 효소들은 형질전환 식물체들을 이용해서 많은 조사와 검증이 되어있는 상태이다 (Raines, C.A. 2003, Photosynth. Res. 75, 1-10).

Calvin cycle내의 효소인 FBPase과 SBPase 주요 기능은 ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) 의 재합성과 전분의 생산이다. FBPase의 활성이 감소되면 광합성 효율의 감소와 식물의 생장을 지연시키며, 감자의 괴경 생산, Arabidopsis의 질소 대사 및 수크로스의 생산 감소, 토마토의 생산을 저해 시킨다는 보고가 있다 (Koㅯmann, J. et al., 1994, Plant J. 6, 637-650; Obiadalla-Ali, H. et al., 2004, Planta 219, 533-540; Sahrawy, M. et al., 2004, J. Exp. Bot. 55, 2495-2503). 비슷한 예로, SBPase 활성을 감소시켰을 경우 식물체 잎의 탄소동화작용에 변화를 주어 식물의 생장의 감소를 유도한다고 알려져 있다 (Harrison, E.P. et al., 1998, Planta 204, 27-36; Olcer, H. et al., 2001, Plant Physiol. 125, 982-989; Lawson, T. et al., 2006, Plant Cell Environ. 29, 48-58). Arabidopsis 나 Chlamydomonas의 SBPase 유전자를 과 발현시킨 형질전환 담배의 경우 광합성효율이 증가되었으며, 수크로스와 전분의 생합성량이 증가되어 식물체의 전체적인 바이오매스가 증가됨이 알려져 있다 (Lefebvre, S. et al., 2005, Plant Physiol. 138, 451-460; Tamoi, M. et al., 2006, Plant Cell Physiol. 47, 380-390). 더욱이, 남세균 Synechococcus PCC7942 의 fructose-1,6-/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (FBP/SBPase) 및 FBPase-II 유전자를 엽록체에서 발현시킨 형질전환 담배의 경우 정상적인 대기상태에서 광합성량과 생장량이 증가됨을 보였다 (Miyagawa, Y. et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 965-969; Tamoi, M. et al., 2006, Plant Cell Physiol. 47, 380-390).

FBPase와 SBPase는 Calvin cycle의 조절과 탄소 분할과 결합에 중요한 효소임이 밝혀지고 있다. 그러므로 이들 두 유전자는 바이오매스의 증가와 작물의 생산량 증가를 목적으로 하는 유전자 조작 식물체를 만들 때 매우 좋은 유전자원이 된다.

작물 재배를 위해 관개를 하면 농경지 내의 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 황산염, 염소 같은 수용성 염의 농도가 증가하게 된다. 이 같은 염이 일정 수준 이상 토양에 축적되면 작물이 뿌리를 통해 수분을 흡수하는 기능이 타격을 입고 식물 세포가 정상적인 대사활동을 할 수 없게 된다. 염의 농도가 높으면 높을수록 식물 로 흡수되는 수분의 양이 감소하기 때문에 작물의 생산량이 감소할 뿐만 아니라 작물 자체가 아예 사멸하는 지경까지 이를 수도 있다.

이와 같은 염에 의한 피해는 작물의 생산성을 심각하게 제약하는 요인 가운데 하나로 해결이 어려운 농학 분야의 난제에 속한다. 미국 농무성(U.S. Dept. of Agriculture)에 따르면, 전 세계적으로 농경지 가운데 1,000만 헥타르에 이르는 면적이 매년 관개(irrigation)에 따른 염화로 인해 사라지는 것으로 보고되었다. 농경지의 염화 문제를 해결하기 위해 많은 학자들이 교배와 같은 품종 개량법을 통해 내염성 작물을 개발하려는 연구를 시도해 왔지만 뚜렷한 성과를 얻지는 못했다.

따라서 주요 식/작물에 대하여 내염성을 유도하는 새롭고 획기적인 기술이 요구되고 있다. 많은 연구자들이 외래유전자를 식/작물에 형질전환하여 내염성을 높이는 연구를 수행하고 있다. 그러나, 아직 남세균 유래의 FBP/SBPase 유전자를 식물체에서 과발현시켰을 때, 식물체의 내염성이 증가된다는 보고는 없다.

본 발명에서는 남세균 유래의 FBP/SBPase 유전자를 식물체에서 과발현시켰을 때, 식물체의 내염성이 증가되는지를 확인하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 남세균 유래 FBP/SBPase 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체 및 그의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 SyFBP/SBPase 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 남세균(Synechocystis) PCC 6803 유래 FBP 단백질(SyFBP/SBPase)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyFBP/SBPase를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 FBPase와 SBPase 효소의 고발현 식물체를 얻기 위해 엽록체에 직접 발현하는 형질전환을 수행하였다. 엽록체 형질전환 기술은 핵 형질전환 기술보다 발현효율이 높으며 여러 유전자를 같이 발현시킬 수 있는 장점이 있다. 이 를 위해, 본 발명가는 남세균(Synechocystis) PCC 6803으로부터 FBP 단백질(SyFBP/SBPase)을 코딩하는 유전자를 분리하였으며, 분리된 유전자를 기초로 재조합 식물 발현 벡터를 제조하였다. 분리된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 상기 분리된 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터 내에 도입된 SyFBP/SBPase 유전자는 서열번호 1의 염기 서열 외에도 SyFBP/SBPase 활성을 나타내는 단백질을 코딩하면서 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 및 99% 이상 상동성인 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 식물 발현 벡터를 이용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1에 기재된 개열지도를 갖는 엽록체 형질전환 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 벼 유래 Clp 프로모터와 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터를 가지고 있으며, 식물 엽록체 게놈의 해당 영역에 삽입된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 터미네이터는 공지되어 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 스펙티노마이신(Spectinomycin), 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터, 벼 유래 Clp 프로모터일 수 있으나, 바람직하게는 엽록체 형질전환용 벼 유래 Clp 프로모터이다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환 경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.

터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 바람직하게는 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 금 입자에 본 발명의 재조합 벡터를 코팅한 후 입자 충격법을 통해 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 담배, 애기장대, 가지, 고추, 토마토, 감자, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓, 무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등이 있으며, 바람직하게는 담배이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 내염성 식물체는 SyFBP/SBPase 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 신초의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, SyFBP/SBPase 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 신초의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 내염성 식물체를 수득할 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물은 담배이다.

본 발명은 또한, 내염성이 증가된 식물체의 종자를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

1. 엽록체 형질전환 벡터 제작

Synechocystis PCC6803의 FBP/SBPase 유전자를 Synechocystis PCC6803 게놈 DNA에서 프라이머 5'-GAG CTC AGG AGG TAT ACA GTG GAC AGC ACC CTC GGT-3'(서열번호 3) (SacI site는 밑줄로 표시함)와 5'-CTG CAG TTA ATG CAG TTG GAT TAC TTT GGG G-3'(서열번호 4) (PstI site는 밑줄로 표시함)를 이용하여 PCR 기법을 이용하여 증폭시켜 얻었다. 증폭하여 얻어진 유전자를 pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI)에 클로닝하여 염기 서열을 확인하였다. 염기 서열이 확인된 FBP/SBPase 유전자를 SacI/PstI로 잘라서 RclpADGHt에 서브클로닝하여 Rclp-SyFBP/SBP라 명명하였다. 서브클로닝한 Rclp-SyFBP/SBP를 XhoI/EcoRI로 자르고 엽록체 형질전환 벡터인 CtVG의 PstI 부분에 블런트로 붙여 넣어 엽록체 형질전환 벡터인 CpFBP를 만들었다.

2. 식물 형질전환과 생육조건

담배 (Nicotiana tabacum L. cv Samsun)의 엽록체 형질전환 방법은 한국특허등록 제468624호를 참고한다. 구체적으로, 야생형 담배(Nicotiana tabacum, Samsun) 식물체의 종자를 기내에서 8주간 발아시킨 후 유식물체의 잎을 분리하여 1 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA이 첨가된 MS 배지에서 치상하여 색소체 형질전환에 사용하였다. 상기에서 제작한 색소체 형질전환용 벡터를 CaCl₂와 스퍼미딘(spermidine)을 사용하여 0.6 ㎛ 지름의 금입자(gold particle)에 코팅(coating)한 후 BioRad사의 PDH-1000/He gene delivery system 기기를 이용하고 1,100 psi의 Acceleration Power, 9 cm의 Target distance, 28 in/Hg의 압력(Vacuum)조건으로 색소체 형질전환을 수행하였다.

모든 분석법은 형질전환 T₁ 식물로 수행하였으며, 대조구 식물체와 형질전환체는 MS 기본배지에 2 % 수크로스가 들어있는 배지에서 치상하여 16 h light/8 h dark 광주기에서 발아시키고, 5주 후 흙으로 옮겼으며, 여름철 야외 온실(800-1600 mmol m^-2 s^-1, 25-35 ℃)에서 생육하였다.

3. 서던과 노던 분석

담배 잎을 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 총 게놈 DNA를 분리하였으며, 약 4 μg 게놈 DNA 를 BamHI 과 BglII로 잘라 1 % 아가로스 겔에서 전기영동한 후 Zeta-Probe GT Blotting Membrane (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 색소체 게놈안의 trnI 를 포함하는 BamHI-BglII DNA 단편 (0.6 kb, P1 프로브)를 방사선 동위원소 [³²P] dCTP-라벨하여 aadA 와 gfp 의 삽입된 것을 확인하였다. 예비혼성화(prehybridization) 및 혼성화(hybridization) 는 7 % (w/v) SDS가 들어가 있는 0.25 M sodium phosphate (pH 7.2) 버퍼에서 65℃에서 16시간 동안 수행하였으며, 5 % (w/v) SDS가 들어있는 0.2 M sodium phosphate (pH 7.2) 버퍼에 65℃ 30분씩 두 번 씻어내고 X-ray 필름 3시간 반응시켜 확인하였다.

Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 담배 잎에서 총 RNA 추출하였다. 총 RNA (2 μg)을 5.1 % (v/v) 포름알데히드가 들어간 1.2 % 아가로스 겔에 전기영동 후 Zeta-Probe GT Blotting Membrane (Bio-Rad, Hercules, CA) 에 RNA를 옮긴 후 FBP/SBP 유전자 단편 (P2 프로브)에 [³²P] dCTP 라벨하여 혼성화를 수행하였다.

4. 엽록소 양 측정

잎 조각 (1.13 cm²)을 액체 질소에서 막자사발을 이용해서 분쇄하였다. Chlorophyll a 와 b 의 함량은 Jeong et al (Jeong, S. W. et al., 2002, Mol. Cells, 13, 419-428)의 방법으로 수행하였다.

구체적으로 기재되지 않은 실험 방법은 당업계에 공지된 일반적인 분자생물학적 방법에 따라 수행할 수 있다.

실시예 1: 엽록체 형질전환 벡터와 형질전환 담배 식물의 선발

엽록체 형질전환 벡터에는 동형재조합을 위한 삽입 염기서열 부위가 있으며, 선발 마커의 발현을 위하여 Prrn promoter 와 psbA 3' UTR를 이용하였다. Synechocystis sp. PCC 6803에서 찾아낸 FBP/SBPase (slr2094) 유전자의 발현을 위해 벼에서 찾아낸 Clp promoter 와 대장균의 rrnB1/B2 terminator를 사용하였다 (도 1 참고). 5개의 독립적인 형질전환 담배 식물체 T₀(CpFBP-1, -2, -5, -7, -8)를 서든 블롯 분석을 하여 식물체 내로 외래 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. T₀ 종자를 선발 항생제인 스펙티노마이신이 함유된 선발 배지에서 발아시켜 선발한 T1 세대를 다시 서든 블롯 분석법으로 확인한 결과 T₀ 식물체에서와 같은 양상의 밴드를 확인함으로써 외래 유전자인 FBP/SBPase가 다음 세대로까지 유전됨을 확인할 수 있었다. 모든 CpFBP T₁ 식물체들을 노던 블롯 분석법을 이용하여 FBP/SBPase(1.8 kb) 유전자가 발현하는 것을 몇몇의 큰 밴드와 함께 확인하였으며 벡터 대조구 식물체인 CtVG에서는 발현하지 않음을 확인하였다. 크기가 다른 큰 밴드들은 아마 엽록체 게놈 내의 rrn16 이나 벡터의 Prrn 프로모터에 의해서 발현되어 나온 것으로 생각이 된다.

실시예 2: 엽록체 SyFBP 형질전환 담배의 내염성 조사

Synechocystis PCC 6803 유래 FBP (SyFBP/SBPase) 유전자가 엽록체 형질전환된 CtVG/FBP5, CtVG/FBP7 종자 및 CtVG 벡터 대조구의 T1 종자를 소독하여 MSBM500Sp (MS basal medium + 3% 수크로스 + 500 mg/L 스펙티노마이신 + 0.6% phytoagar)가 첨가된 배지에 치상하여 25℃, 약 40 ㅅmol·m^-2·sec^-1의 cool-white 형광, 16시간 광주기 조건에서 2주 동안 배양하였다. 0, 250 mM NaCl이 들어있는 MSBM 액체 배지에 이식하여 위 조건에서 5일 동안 배양한 후 엽록소의 양을 측정하였다.

Salt 처리 후 엽록소 함량을 측정한 결과, SyFBP/SBPase 형질전환 담배 식물체가 CtVG 벡터 대조구 식물에 비해서 salt에 대해 더 강한 내성을 보임을 알 수 있었다 (도 2). 도 2에서 CtVG는 벡터 대조구를 나타내며, CpFBP-5 및 CpFBP-7은 FBP 형질전환체를 나타낸다. 도 2의 우측 그래프에서 검정색 막대는 salt 처리전 엽록소의 상대적인 양을 나타내며, 회색 막대는 salt 처리 후의 엽록소의 상대적인 양을 나타낸다. 상기 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, salt 처리 후 벡터 대조구에서는 엽록소의 양이 많이 감소된 반면, 형질전환체에서는 엽록소의 양이 상대적으로 더 적게 감소되었다는 것을 알 수 있다.

따라서, 상기 결과로부터 SyFBP/SBPase 형질전환 담배 식물체는 벡터 대조구에 비해 내염성이 증가함을 알 수 있는 것이다.

도 1은 본 발명의 엽록체 형질전환 벡터를 나타내는 그림이다.

도 2는 본 발명의 SyFBP/SBPase 형질전환 담배 식물체의 내염성 결과를 나타내는 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for increasing salt tolerance of plant by overexpressing SyFBP/SBPase gene isolated from Synechocystis <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1038 <212> DNA <213> Synechocystis <400> 1 gtggacagca ccctcggttt agaaattatt gaagtcgtag aacaagcggc gatcgcctcg 60 gcaaaatgga tgggcaaagg tgaaaaaaac accgctgacc aagtagccgt agaagccatg 120 cgggaacgga tgaataaaat ccacatgcgg ggccgcatcg tcattggcga gggggaaagg 180 gatgatgcac ccatgctcta catcggcgaa gaagtaggca tttgcaccag agaagatgcc 240 aaatccttct gcaatcccga cgaattggta gaaattgaca ttgctgttga cccctgtgaa 300 ggtaccaacc tagtagccta tggtcaaaac ggttccatgg ccgtgttggc aatttctgaa 360 aaaggtggtt tgtttgccgc tcccgacttc tacatgaaaa aactggcggc tcccccagcg 420 gccaaaggtc atgtggacat cgacaaatcg gccaccgaaa acctgaaaat cctctccgat 480 tgcctcaacc gcagcattga agaattggtg gtagtggtca tggatcgtcc ccgccacaaa 540 gaattgatcc aagaaatccg caatgccggt gctcgggtac gtctaatcag tgatggagac 600 gtttccgccg ccatttcctg tgctttttcc ggcaccaaca tccacgctct gatgggcatc 660 ggggctgctc ctgaaggggt aatttccgct gctgccatgc gctgtctggg gggtcacttc 720 caaggtcagt taatctacga tcccgaagtg gttaaaaccg gcctaatcgg tgaaagtcgg 780 gaaggcaacc tagagcgtct cgcttccatg ggcatcaaaa atcctgacca ggtttataac 840 tgcgaagaat tggcctgtgg cgaaaccgta ttatttgccg cctgtggtat cacccctggc 900 actttgatgg aaggagtccg cttcttccat ggtggggtac ggacccaaag cttggttatt 960 tctagccagt ccagcaccgc ccgctttgta gacactgtcc atatgaagga aagccccaaa 1020 gtaatccaac tgcattaa 1038 <210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Synechocystis <400> 2 Met Asp Ser Thr Leu Gly Leu Glu Ile Ile Glu Val Val Glu Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Ala Lys Trp Met Gly Lys Gly Glu Lys Asn Thr Ala 20 25 30 Asp Gln Val Ala Val Glu Ala Met Arg Glu Arg Met Asn Lys Ile His 35 40 45 Met Arg Gly Arg Ile Val Ile Gly Glu Gly Glu Arg Asp Asp Ala Pro 50 55 60 Met Leu Tyr Ile Gly Glu Glu Val Gly Ile Cys Thr Arg Glu Asp Ala 65 70 75 80 Lys Ser Phe Cys Asn Pro Asp Glu Leu Val Glu Ile Asp Ile Ala Val 85 90 95 Asp Pro Cys Glu Gly Thr Asn Leu Val Ala Tyr Gly Gln Asn Gly Ser 100 105 110 Met Ala Val Leu Ala Ile Ser Glu Lys Gly Gly Leu Phe Ala Ala Pro 115 120 125 Asp Phe Tyr Met Lys Lys Leu Ala Ala Pro Pro Ala Ala Lys Gly His 130 135 140 Val Asp Ile Asp Lys Ser Ala Thr Glu Asn Leu Lys Ile Leu Ser Asp 145 150 155 160 Cys Leu Asn Arg Ser Ile Glu Glu Leu Val Val Val Val Met Asp Arg 165 170 175 Pro Arg His Lys Glu Leu Ile Gln Glu Ile Arg Asn Ala Gly Ala Arg 180 185 190 Val Arg Leu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ser Ala Ala Ile Ser Cys Ala 195 200 205 Phe Ser Gly Thr Asn Ile His Ala Leu Met Gly Ile Gly Ala Ala Pro 210 215 220 Glu Gly Val Ile Ser Ala Ala Ala Met Arg Cys Leu Gly Gly His Phe 225 230 235 240 Gln Gly Gln Leu Ile Tyr Asp Pro Glu Val Val Lys Thr Gly Leu Ile 245 250 255 Gly Glu Ser Arg Glu Gly Asn Leu Glu Arg Leu Ala Ser Met Gly Ile 260 265 270 Lys Asn Pro Asp Gln Val Tyr Asn Cys Glu Glu Leu Ala Cys Gly Glu 275 280 285 Thr Val Leu Phe Ala Ala Cys Gly Ile Thr Pro Gly Thr Leu Met Glu 290 295 300 Gly Val Arg Phe Phe His Gly Gly Val Arg Thr Gln Ser Leu Val Ile 305 310 315 320 Ser Ser Gln Ser Ser Thr Ala Arg Phe Val Asp Thr Val His Met Lys 325 330 335 Glu Ser Pro Lys Val Ile Gln Leu His 340 345 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gagctcagga ggtatacagt ggacagcacc ctcggt 36 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ctgcagttaa tgcagttgga ttactttggg g 31

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 남세균(Synechocystis) PCC 6803 유래 FBP 단백질(SyFBP/SBPase)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 SyFBP/SBPase를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 개열지도를 갖는 엽록체 형질전환 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 식물은 담배, 애기장대, 가지, 고추, 토마토, 감자, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓, 무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물은 담배인 것을 특징으로 하는 식물체.
제6항에 따른 식물체의 종자.