JP2011500081A - シネコシスティス(Synechocystis)から単離されたSyFBP/SBPase遺伝子を過発現させることによって植物の耐塩性を向上させる方法及びその方法によって製造された植物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 植物の耐塩性を向上させる方法は、シネコシスティス(Synechocystis)から単離したSyFBP/SBPase遺伝子を過剰発現させる。上記組成物及び組み換えベクターは、SyFBP/SBPaseをコードする遺伝子を含んで成る。
【選択図】図5
Description
〔1. 葉緑体形質転換ベクターの作製〕
シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803のFBP/SBPase遺伝子をシネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803ゲノムDNAでプライマー5’−GAG CTC AGG AGG TAT ACA GTG GAC AGC ACC CTC GGT−3’(配列番号3:SacI 部位は下線を付した)及び5’−CTG CAG TTA ATG CAG TTG GAT TAC TTT GGG G−3’(配列番号4:PstI 部位は下線を付した)を利用してPCR法によって増幅させて得た。増幅して得られた遺伝子をpGEM−T Easy(Promega社、Madison, WI)にクローニングして塩基配列を確認した。塩基配列の確認されたFBP/SBPase遺伝子を制限酵素SacI及びPstIで消化切断しRclpADGHtにサブクローニングした。サブクローニング結果物はRclp−SyFBP/SBPと命名した。サブクローニングしたRclp−SyFBP/SBPを制限酵素XhoI及びEcoRIで消化切断し、葉緑体形質転換ベクターであるCtVGのPstI部位に平滑末端化(blunt)して付着連結(ligated)し、葉緑体形質転換ベクターであるCpFBPを得た。
タバコ(Nicotiana tabacum L. cv. Samsun)の葉緑体形質転換法は、韓国特許登録第468624号明細書を参照する。具体的には、野生型タバコ(Nicotiana tabacum, cv. Samsun)植物体の種子をインキュベーター内で8週間発芽させた。この後、幼植物体の葉を収穫して、1mg/LのBAP及び0.1mg/LのNAAが添加されたMS培地上に置床し、色素体形質転換に使用した。上述のように調製した色素体形質転換用ベクターを、塩化カルシウム(CaCl2)及びびスペルミジン(spermidine)を使用して直径0.6μmの金粒子にコーティングした後、遺伝子デリバリーシステム(gene delivery system、BioRad社製(Hercules, California)、PDH−1000/He 型)を利用して、1100psiの加速パワー(Acceleration Power)、9cmの標的行程(Target distance)、28 in/Hgの減圧条件にて色素体形質転換を行った。
タバコ葉からDNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社、Hilden, Germany)を用いて総ゲノムDNAを分離した。約4μgの上記ゲノムDNAをBamHI及びBglIIで消化切断して、1%のアガロースゲルで電気泳動した後、Zeta−Probe GT Blotting Membrane(Bio−Rad社、Hercules,CA)に移した。色素体ゲノム内のtrnIを含むBamHI−BglII DNA断片(0.6kb、P1プローブ)を放射線同位元素[32P]dCTPでラベルして、aadA及びgfpが挿入されたことを確認した。プレ−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション工程は、7%(w/v)のSDSを含む0.25Mのリン酸ナトリウム(pH7.2)バッファーで65℃、16時間行い、5%(w/v)のSDSを含む0.2Mのリン酸ナトリウム(pH7.2)バッファーで65℃で30分間ずつ二回洗浄した後、X線フィルム上、3時間反応させて確認した。
葉片(1.13cm2)を液体窒素中、すり鉢を用いて粉砕した。クロロフィルa及びクロロフィルbの量を、ジェオン(Jeong)らの方法(Jeong,S.W. et al.,2002,Mol.Cells,13,419−428)によって測定した。具体的に記載されていない実験方法は、当業界公知の一般的な分子生物学的な方法によって行うことができる。
葉緑体形質転換ベクターには相同組換え(homologous recombination)のための挿入塩基配列部位がある。選択マーカー(selective marker)の発現のためにPrrn プロモーター及びpsbA 3’UTRを用いた。シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803に見出されたFBP/SBPase(slr2094)遺伝子の発現のために、稲から単離されたClpプローモーターと大膓菌から単離されたrrnB1/B2ターミネーターを使用した(図1参照)。5個の独立的な形質転換タバコ植物体T0(CpFBP−1、CpFBP−2、CpFBP−5、CpFBP−7、及びCpFBP−8)について、サザンブロット分析を行って植物体内に外来遺伝子が挿入されたことを確認した。上記形質転換タバコ植物体T0の種子を選択抗生剤であるスペクチノマイシンを含んで成る選択培地で発芽させて選択したT1世代について、再びサザンブロット分析で確認した。この結果、T0植物体の場合と同様のバンドが観察され、外来遺伝子であるFBP/SBPase遺伝子が実際に次の世代にまで送達(delivered)されていることを示すものであった。全てのCpFBP T1植物体について、ノーザンブロット分析によって、幾つかの厚い(thick)バンドと共にFBP/SBPase(1.8kb)遺伝子が発現することを確認した。また同時に、ベクター対照区植物体であるCtVGでは発現しないことを確認した。サイズの異なる上述の厚いバンドは、おそらく葉緑体ゲノム内のrrn16又はベクターのPrrnプロモーターによって発現したものと考えられる。
〔1.葉緑体(葉緑素)の量〕
シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803由来のFBP(SyFBP/SBPase)遺伝子が葉緑体に形質転換されたCpFBP−5、CpFBP−7種子及びCtVGベクター対照区のT1種子を無菌化して、MSBM500Sp(MS基本培地+3%のスクロース+500mg/Lのスペクチノマイシン+0.6%のフィトアガー(phytoagar))が添加された培地に置床して、25℃、約40μmol・m−2・sec−1の冷陰極白色(cool−white)蛍光、明(lighting)条件で2週間インキュベートした。上述の種子は、0、250mMの塩化ナトリウムを含有するMS基本培地(液体培地)に移植した後、5日間インキュベートし、葉緑体の量を測定した。
シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803由来のFBP(SyFBP/SBPase)遺伝子が葉緑体に形質転換されたCpFBP−5、CpFBP−7及びCpFBP−8のT1種子、並びにCtVGベクター対照区のT1種子について、70%のエチルアルコールで30秒間、0.5%(v/v)の次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)溶液で15分間、表面の無菌化を行った後、0、100、200、及び300mMの塩化ナトリウムを添加したMS基本培地に置床して、25℃、約40μmol・m−2・sec−1の冷白色(cool−white)蛍光、明(lighting)条件で21日間インキュベートした後に発芽率を測定した。実験は、各ライン当たり種子150個ずつ3回繰り返して実施した(図3)。図3において、CtVGはベクター対照区を示し、CpFBP−5、CpFBP−7及びCpFBP−8はFBP葉緑体形質転換体を示す。
上述の発芽率試験と同様の条件で種子を無菌化した後、MS基本培地に置床した。21日インキュベーションの後、発芽した植物体を0、100、200、300mMの塩化ナトリウムを含有するMS基本培地(固体)に移植し、3週間培養した後、根の長さを測定した(図4)。図4において、CtVGはベクター対照区を示し、CpFBP−5、CpFBP−7及びCpFBP−8はFBP形質転換体を示す。
MS基本培地(固体)にて21日培養後の発芽した植物体を土壌で順化させた後、さらに8週間栽培した。続いてこの植物体を300mMの塩化ナトリウム溶液で14日間処理した後、植物体の回復を観察するために15日目に再び灌水した。光合成量は3日毎に測定した(図5参照)。図5において、CtVGはベクター対照区を示し、CpFBP−5、CpFBP−7及びCpFBP−8はFBP葉緑体形質転換体を示す。ETRは、電子伝達速度(Electron Transport Rate)を示す。
Claims (10)
- シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803から単離されたFBPタンパク質(SyFBP/SBPase)をコードする遺伝子を有する組み換え植物発現ベクターで植物の細胞を形質転換してSyFBP/SBPase遺伝子を過発現させる工程を備えることを特徴とする植物の耐塩性を向上させる方法。
- 前記FBPタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする請求項1に記載の植物の耐塩性を向上させる方法。
- 前記組み換え植物発現ベクターは、葉緑体形質転換ベクターであることを特徴とする請求項1に記載の植物の耐塩性を向上させる方法。
- 前記植物は、タバコ、シロイヌナズナ、ナス、唐辛子、トマト、ジャガイモ、ゴボウ、シュンギク、チサ、キキョウ、ホウレン草、フダンソウ、サツマイモ、サラリ、ニンジン、セリ、パセリ、白菜、キャベツ、カラシナ、ダイコン、スイカ、マクワウリ、キュウリ、カボチャ、フクベ、イチゴ、大豆、緑豆、インゲン豆及びエンドウからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の植物の耐塩性を向上させる方法。
- 請求項1乃至4の何れか1項に記載の植物の耐塩性を向上させる方法によって製造されたことを特徴とする耐塩性の向上した植物。
- 請求項5に記載の耐塩性の向上した植物の種子。
- シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803から単離されたFBPタンパク質(SyFBP/SBPase)をコードする遺伝子を有することを特徴とする植物の耐塩性を向上させるための組成物。
- 前記FBPタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- シネコシスティス(Synechocystis)PCC 6803から単離されたFBPタンパク質(SyFBP/SBPase)をコードする遺伝子を有することを特徴とする組み換え葉緑体形質転換ベクター。
- 前記ベクターは、図1に示す切断地図を有するCpFBPベクターであることを特徴とする請求項9に記載の組み換え葉緑体形質転換ベクター。
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