KR100654958B1

KR100654958B1 - 고친화성 인산운반체 유전자(ＯｓＰＴ8) 및 상기 유전자로형질전환된 인산결핍 스트레스 저항성 식물

Info

Publication number: KR100654958B1
Application number: KR1020040111623A
Authority: KR
Inventors: 김도훈; 정순재; 남재성; 이재헌; 정영수; 김경태; 은무영; 이명철; 남민희; 이기환; 박순기
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2006-12-08
Also published as: KR20060072866A

Abstract

본 발명은 벼에서 유래된 고친화성 인산운반체 유전자(OsPT8)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 벼에서 유래된 고친화성 인산운반체(OsPT8), 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 인산결핍 스트레스 저항성 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 인산 결핍 스트레스를 보다 효율적으로 극복하는 새로운 식물체의 개발이 가능하여, 식물 자체의 양분흡수 및 수송능력을 향상시킴으로서 화학비료의 다량 사용으로 인한 토양과 수자원의 오염을 감소시켜서 생태계의 복원과 쾌적한 친환경적 농업의 발전과 나아가 작물의 생산량과 생산의 질을 높이는데 기여할 수 있다.

벼(Oryza sativa L.), 고친화성 인산운반체 유전자, 무기인산

Description

고친화성 인산운반체 유전자(ＯｓＰＴ8) 및 상기 유전자로 형질전환된 인산결핍 스트레스 저항성 식물{High-affinity Phosphate Transporter Gene OsPT8 and Phosphate Deficiency Stress Resistant Transgenic Plant Transformed by Thereof}

도 1은 벼의 캘러스 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서의 OsPT8 유전자 발현양상 나타낸 RNA 블러팅 결과이다.

도 2는 인산 충분조건과 결핍조건에서 벼 식물체의 조직 특이적인 OsPT8 유전자의 발현 양상을 조사한 RNA 블러팅 결과를 나타낸 것이다. S+는 인산 충분조건에서의 줄기부위를 나타내며, S-는 인산 결핍조건에서의 줄기부위를 나타내고, R+는 인산 충분조건에서의 뿌리부위를 나타내며, R-는 인산결핍상태에서의 뿌리부위를 나타낸 것이다.

도 3은 OsPT8 유전자가 형질전환된 애기장대와 야생종 (wild-type) 애기장대의 성장을 비교한 결과를 나타낸 것이다. A 및 B는 인산 결핍조건에서 애기장대 형질전화체와 야생종의 성장을 정성, 정량적으로 비교한 것이고, (C) 애기장대 형질전환체에서의 OsPT8 유전자 발현을 RNA 블러팅으로 확인한 것이다.

도 4는 애기장대의 고친화성 인산운반체 유전자(AtPT1)를 분자마커로 이용하 여 인산 결핍조건에서 OsPT8 유전자로 형질전환된 애기장대와 야생형 애기장대에서의 AtPT1 발현 정도를 확인한 것이다.

본 발명은 벼에서 유래된 고친화성 인산운반체 유전자(OsPT8)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 벼에서 유래된 고친화성 인산운반체(OsPT8), 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 인산결핍 스트레스 저항성 식물체에 관한 것이다.

미래의 생명과학 발전과 산업화는 유용한 유전자원의 확보, 유용유전자들의 분리 및 기능해석, 그리고 이들 유전자들의 응용기술개발에 의존할 수밖에 없다. 이미 인간을 포함한 30 여종의 생물들에 대한 전체 유전체의 염기서열이 밝혀짐으로서 수없이 많은 유용한 유전자들이 분리되고 기능분석 후에 특허권이 인정되고 있다. 특히 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나인 벼의 경우 최근 몇 년간 전체 유전체 염기서열이 밝혀짐으로서 유용유전자를 대량으로 확보하고 이를 선점하고자 많은 노력을 기울이고 있다. 식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물생리학적 측면의 연구가 오랜 전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자수준의 기초연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련한 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고 극도로 양분이 제한된 조건 에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

인산은 식물이 필요로 하는 필수 영양소 중의 하나로서 에너지 전달, 신호전달, 대사산물의 생합성, 광합성 그리고 호흡 등의 식물세포 내에서 물질 대사과정에 중요한 기능을 할 뿐 아니라 DNA와 RNA의 중요한 구성성분으로 질소와 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다. 식물체의 성장에 필요한 많은 양의 인산은 주로 비료의 형태로 식물체에게 공급되고 있으나 대부분의 인산은 토양에서 식물이 이용할 수 없는 유기물 또는 금속이온들과 결합한 형태로 고정화 된다. 따라서 실제 식물이 이용할 수 있는 유효인산의 양은 토양 속에 극히 적은 양으로 존재하고 있다.

특히 산성 토양의 경우, 과다하게 축적된 알루미늄 이온에 의한 인산의 고정화로 토양의 인산 유효성을 더욱 낮추고 있다. 매년 전체 영농비용의 상당부분이 토양의 유효인산 농도를 증가시키기 위한 비료 구입비용으로 사용되고 있다. 또한, 농업 환경오염원 중에서 비료의 과다 사용으로 인한 토양의 산성화와 염의 직접 등의 토양오염은 작물의 생육에 나쁜 영향을 미칠 뿐 아니라 지표수에 침투하여 수자원의 주 오염원인 부영양화를 초래한다. 농업 환경오염은 농업 생산의 질적 저하를 가져올 뿐 만 아니라 환경파괴에 의한 국민건강을 위협하므로 오염원의 제거는 매운 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 화학비료의 양을 줄임으로서 해결할 수 있다. 현재 화학 비료를 대처하기 위한 여러 가지 유기질 비료가 개발되어 사용되고 있으나 화학비료를 대체하기에는 아직 많은 문제점이 있다. 따라서 보다 근원 적인 문제 해결방안은 식물의 토양인산의 이용성을 향상시킴으로서 비료의 사용량을 줄이는 것이다.

종래의 연구 경향은 주로 재배, 생리학을 중심으로 하는 인산결핍 스트레스에 관한 연구였다. 1990년대 들면서 인산결핍에 대한 식물체의 반응을 분자수준에서 이해하고 응용하려는 새로운 경향의 연구들이 시작되었다. 현재 인산 운반체 유전자들은 애기장대, 토마토, 감자, 담배, 벼, 보리 등에서 분리되어 이들 유전자들의 구조와 발현 조절 특성들이 밝혀지고 있다. 그러나 아직 인산 흡수와 관련한 유전자들의 발현유도 기작이나 인산 운반체 대한 분자세포생물학적 이해가 부족하여 유전자 조작에 의한 식물의 인산흡수 체계를 변화시켜서 기대하는 만큼의 인산흡수 능력이 향상된 새로운 식물체는 개발이 되지 않고 있다. 다만, 담배 현탁세포에 애기장대의 고친화성 인산 운반체를 대량 발현시키면 인산 결핍조건에서 세포성장률이 증가된다는 보고는 고친화성 인산 운반체를 이용한 인산 흡수력 개선의 필요성을 제시하고 있다.

이에, 본 발명자들은 벼에서 분리한 고친화성 인산운반체 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 애기장대에 형질전환시켰을 때, 인산이 결핍된 조건에서 인산 이용성이 향상된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고친화성 인산운반체 유전자(OsPT8)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 OsPT8 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 OsPT8 유전자로 형질전환된 식물 및 상기 OsPT8 유전자로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 인산결핍 스트레스 저항성 식물체의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 고친화성 인산운반체(OsPT8)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 고친화성 인산운반체(OsPT8)를 코딩하는 OsPT8 유전자를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 OsPT8 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 OsPT8 유전자는 벼(Oriza sativa) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 OsPT8 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 본 발명에 있어서 상기 형질전환된 미생물은 아그로박테리움 속인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 투메파시앙스와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있 다. 또한, 효모 및 곰팡이와 같은 진핵세포를 숙주로 사용하는 것도 가능하다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 OsPT8 유전자로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 항 인산결핍성 변이 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되고, 조직배양을 통해 반복생식이 가능한 항 인산결핍성 변이 식물체을 제공한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 도입시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 구체적으로 제한되지 않는다는 것은, 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 형진전환 식물로 애기장대를 사용하였으나 배추, 무 및 다른 화훼류 작물 등 재배식물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1: OsPT8 유전자의 클로닝 및 염기서열 결정

본 발명에서는 고친화성 인 운반체 유전자를 분리하기 위하여, 우리나라 재배 품종인 동진벼를 사용하였다. 동진벼의 게놈 DNA를 분리하여 벼의 게놈서열(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Genome/PlantBlast.shtml?7)을 토대로 각 벼 유래의 고친화성 인산 운반체 유전자(OsPT)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각 제작 하였다 (표 1). 상기 프라이머와 동진벼 게놈 DNA를 사용하여 PCR 을 수행하여 각 유전자의 코딩영역을 증폭하였다.

OsPT유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머

	정방향 프라이머 (5' --> 3')	역방향 프라이머 (5' --> 3')
OsPT1	ATTCTAGACATGGCCGGCGAGCTCAAGG (서열번호 3)	TTTCTAGATTGCCGCGGGGTATCAAGCT (서열번호 4)
OsPT2	CGTCTAGACATGGCGCGGCAGGAGCAGC (서열번호 5)	AGTCTAGAACTACGCCGTCTGCGGCCGC (서열번호 6)
OsPT3	AATCTAGACATGGCGGGATCGCAGCTC (서열번호 7)	TTTCTAGAATCACGCTTGGGCGATCGC (서열번호 8)
OsPT4	TGTCTAGACATGGCGGGAGGGCAGCTC (서열번호 9)	GCTCTAGAATTACTTCGGGTAGGCCGCC (서열번호 10)
OsPT5	TCTCTAGAATCATCGGAGATGGCGGACG (서열번호 11)	ATTCTAGAATCATGCGTGCATGGATGTC (서열번호 12)
OsPT6	GCTCTAGACAATGGCGGACGGGCAGCTC (서열번호 13)	TCTCTAGAGCTACGCCGTCGCCTCCTCG (서열번호 14)
OsPT7	CATCTAGAAGCAAGCAATTAAGCTGGC (서열번호 15)	GCTCTAGACGACAGCGCTACAGTACAG (서열번호 16)
OsPT8	GTTCTAGACATGGCGGGCGATCAGATGC (서열번호 17)	ACTCTAGAATCACGGCTGGCCGACCTCG (서열번호 18)
OsPT9	GGTCTAGACATGGTTCAGGATCGCAAGG (서열번호 19)	TATCTAGATTTACTCGGACTGTCCGCTG (서열번호 20)
OsPT10	CGTCTAGACATGGGAAGGCAGGACCAGC (서열번호 21)	CCTCTAGAATTACACCATTCTAACTCCG (서열번호 22)

증폭된 산물을 pBluescript 클로닝 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 후, 분리된 유전자의 염기서열을 확인하였다. 이중 OsPT8 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다. OsPT8 유전자는 기존에 밝혀지지 않은 새로운 유전자로, 전체 1581 bp의 염기서열을 가지고 있으며, 526 아미노산을 암호화하고 있었다.

본 실시예에서 분리된 10종의 고친화성 인산 운반체 유전자들간의 상동성을 비교하고 애기장대(Arabidopsis thaliana), 감자(Solanum tuberosum), 토마토(Lycoperisicon esculentum) 등의 식물체의 고친화성인산 운반체와의 진화적인 근연관계를 계통발생학적 방법을 이용하여 조사한 결과, 상기 고친화성 인산 운반체 유전자 간에는 70% 이상의 아미노산 염기서열이 같았으며, 이로써 계통발생학적으로 외떡잎식물인 벼에서 분리된 이들 유전자는 쌍떡잎식물에서 분리된 유사 유전자들과는 별도로 진화하여 왔음을 알 수 있다.

실시예 2: 인산결핍조건에서 OsPT8 유전자의 발현조사

일반적으로 유사기능을 하는 유전자들이 패밀리로 존재하는 경우에는 각각의 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도인자 특이적으로 조절되므로 분리된 고친화성 인산 운반체 유전자의 발현 양식을 RNA 블러팅 방법을 이용하여 조사하였다.

이때 각 유전자를 선택적으로 구분하기 위해서 유전자 특이적인 염기서열을 가진 3′ UTR DNA 단편만을 프로브(서열번호 23)로 사용하였다. 동진벼 종자에서 유도된 캘러스를 인산이 충분한 배지[CHU N6 배지(Duchefa, 네델란드), 1 mM 인산]와 인산이 결핍된 배지(CHU N6 배지, 10 μM 인산)에서 25℃, 암조건으로 각각 2일간 배양한 후, Trizol 용액 (Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 분리 하였다. 10㎍의 RNA를 1.2% (W/V) 변성용 포름알데히드 아가로스 겔에서 전기 영동한 후, 나일론 멤브레인 (Amersham pharmacia, USA)에 RNA를 부착시켰다. RNA가 부착된 나일론 멤브레인에 [³²P] dATP로 표지된 프로브 및 혼성화용액[20% (W/V) SDS, 20X SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린, 및 10ml/L 히어링 스펌 DNA (10 mg/ml)]을 첨가하고 65℃에서 하룻밤 혼성화시켰다.

도 1A에 나타난 바와 같이, 고친화성 인산 운반체 유전자 OsPT8는 인산 결핍 조건에서 발현양이 증가하는 양상을 보였다. 또한, 도 1A 및 도 1B에 나타난 바와 같이 벼 캘러스의 OsPT8 유전자의 발현은 인산의 농도와 인산 결핍 시간에 따라 발현량에 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: OsPT8 유전자의 조직특이적 발현

벼 캘러스의 발현 양상을 기초로 하여 OsPT8 유전자의 식물체 내에서 조직 특이적인 발현을 조사한 결과, OsPT8 유전자는 인산농도에 관계없이 벼의 줄기와 잎에서는 발현되지 않음을 확인하였으며, 인산이 결핍된 뿌리에서는 특이적으로 대량 발현되는 것을 확인하였다 (도 2). 이러한 결과는 식물체가 인산 결핍 환경에서는 인산에 대한 친화도가 높은 고친화성 인산 운반체를 뿌리에 대량 발현시켜 토양으로부터 보다 효율적으로 인산을 흡수한다는 연구와 일치한다. 인산이 결핍된 환경에서 식물체의 뿌리는 수많은 뿌리털을 만들어 표면적을 넓혀주어 토양에서 인산을 최대로 흡수하고 체관부를 통해서 식물체 전체로 이동되어 이용된다는 기존의 연구결과를 미루어 볼 때, 본 발명의 고친화성 인산운반체인 OsPT8은 토양 속의 인산이 뿌리털로 흡수되는 데에 중요한 역할을 할 것으로 생각 되어진다.

실시예 4: OsPT8 유전자로 형질전환된 애기장대의 제조

벼는 대부분 물속에서 생활하기 때문에 다른 밭작물에 비해 상대적으로 약한 인산 결핍 스트레스를 받는다. 벼에서 분리한 고친화성 인산 운반체 유전자의 밭작물에서의 응용가능성을 증명하고 식물체내에서 그 기능을 조사하기 위해 쌍떡잎식 물의 대표적인 모델 식물체인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 OsPT8을 대량발현하는 형질전환체를 제조하였다.

형질전환 애기장대는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

OsPT8 유전자의 코딩영역을 식물발현용 비너리 벡터(binary vector)인 pCAMBIA1300-35S(CAMBIA, Australia)의 XbaI 사이트에 클로닝하여 CaMV 35S 프로모터에 의해 OsPT8 유전자를 항상 강하게 발현하는 재조합벡터를 제작하였다.

상기 재조합벡터를 트리페어런탈 메이팅(triparental mating)방법으로 아그로박테리움 투메파시앙스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시앙스 EHA105를 사용하여 애기장대 야생형 (wild-type) 식물체를 OsPT8 유전자로 형질전환하였다.

상기 형질전환 애기장대의 T1 식물체에서 수확한 씨앗을 무균 살균처리한 후, 칼베니실린(carbenicillin) (100 mg/L) 과 하이그로마이신(hygromycin) (20 mg/L)이 첨가된 B5 배지(Duchefa, 네델란드)에서 발아시켜서 형질전환 된 식물체를 선택하고 OsPT8 유전자의 발현량을 RNA 블러팅 방법으로 확인 한 후, 다음 세대에서 순종 식물체를 얻었다 (도 3C). 순종 식물체를 각각 50μM 및 1mM의 인산이 첨가된 B5 액체배지에서 배양하면서 식물생육 상태를 야생형과 비교 조사 하였다. 인산 결핍 조건에서 형질전환 애기장대의 생육이 대조군인 야생형 애기장대와 비교하여 더 좋은 것을 육안으로 확인하였으며, 무게 칭량에 의한 정량적인 조사 결과에서도 야생형 식물체와 비교하여 형질전환체에서 생장이 좋은 것을 확인하였다(도 3A 및 도 3B). 특히 조사한 형질전환체 라인 중에서도 가장 OsPT8 유전자의 발현이 높았던 형질전환체(T4)에서는 생장이 약 40% 증가하는 것을 확인하였다 (도 3). 또한 인산결핍에 특이적으로 발현하는 애기장대의 고친화성 인산운반체 유전자(AtPT1)를 분자마커로 이용하여 인산 결핍조건에서 OsPT8 유전자가 대량 발현하는 애기장대 형질전화체가 야생종보다 인산결핍 스트레스를 적게 받고 있음을 확인하였다 (도 4).

본 발명은 고친화성 인산운반체 유전자(OsPT8)를 제공하는 효과가 있으며, 상기 OsPT8 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한, 상기 OsPT8 유전자로 형질전환된 식물 및 상기 OsPT8 유전자로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 인산결핍 스트레스 저항성 식물체의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 의하면, 인산 결핍 스트레스를 보다 효율적으로 극복하는 새로운 식물체의 개발이 가능하여, 식물 자체 양분 흡수 및 수송능력을 향상시킴으로서 화학비료의 다량 사용으로 인한 토양과 수자원의 오염을 감소시켜서 생태계의 복원과 쾌적한 친환경적 농업의 발전과 나아가 작물의 생산량과 생산의 질을 높이는데 기여할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 고친화성 인산운반체(OsPT8).
제1항의 고친화성 인산운반체를 코딩하는 OsPT8 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 OsPT8 유전자.
제2항에 있어서, 상기 OsPT8 유전자는 벼(Oriza sativa) 유래인 것을 특징으로 하는 OsPT8 유전자.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 OsPT8 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
제6항에 있어서, 아그로박테리움 속인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 OsPT8 유전자로 식물체를 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 인산결핍 스트레스 저항성 식물체의 제조방법.
제8항의 방법에 의해 제조되고, 조직배양을 통해 반복생식이 가능한 인산결핍 스트레스 저항성 식물체.