KR101341931B1 - 병 및 재해 저항성 전사인자 ＯｓＷＲＫＹ11 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병 또는 재해 저항성 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 병 또는 재해 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 병 또는 재해에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 병 또는 재해 저항성 품종으로 육성 가능하다.

Description

병 및 재해 저항성 전사인자 ＯｓＷＲＫＹ11 유전자 및 이의 용도{Gene encoding for transcription factor OsWRKY11 having resistance to pathogen and tolerance to abiotic stress and use thereof}

본 발명은 병 및/또는 재해 저항성 전사인자 OsWRKY11 유전자 및 이의 용도에 관한 발명이다. 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 조절하여 식물의 병 또는 재해 저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.

식물은 생활사 동안 다양한 환경 스트레스를 받게 되고, 이는 올바른 생육에 좋지 않은 영향을 준다. 식물은 변화하는 환경에 대응하기 위해 적극적인 저항성 반응을 유도하는데, 그중 가장 흥미로운 것은 다양한 방어-관련 유전자들의 발현을 유도하는 것이다. 특별히 전사인자들의 발현 변화는 스트레스 상황에 있는 식물에 많은 영향을 주게 된다.

식물체들은 병원균의 침입을 받거나, 또는 외부로부터 상처를 받아서 병원균의 침입을 받을 위험이 있을 때, 자체적으로 병방어 유전자군을 발현하여 병에 대한 저항성을 얻게 된다.

이에 당업계에서는 이러한 특이한 병방어 유전자를 식물체로부터 분리하여, 다른 식물체에 유전 공학적으로 적용하고자 하는 연구가 진행되어 왔다. 예를 들면, 대표적인 병방어 유전자이며 병원균의 세포벽분해효소로 알려진 글루카나제(glucanase), 키티나제(chitinase) 등도 개별적으로 담배나 벼에 도입되어 병 저항성을 증진시킨 보고가 있다.

또한, 식물들이 자체적으로 갖고 있는 병방어 유전자들을 개별적으로 발현시키는 것보다 생체내의 총체적인 병 방어기작처럼 병방어 유전자군을 동시에 발현시킬 수 있는 방법에 대해 많은 연구가 진행되었다. 특히, 이 방법 중에서, 병방어 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자 유전자에 대한 연구가 주목을 받고 있다. 이러한 예로, 내냉성 유전자 또는 내염성 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자 CBF 및 Alfin1에 대한 효능이 검증되어 있다.

한편, 병방어 유전자군의 발현을 조절하는 또 다른 전사인자 EREBP(Ethylene response element binding protein)는 프로모터(promoter)에 GCC 상자(GCC box)로 알려진 시스-작용 요소(cis-acting element)를 포함하는 여러 종류의 병저항성 유전자군의 발현을 조절한다고 알려져 있다. EREBP가 발현을 조절하는 병방어 유전자의 예로는, 담배의 PR1(basic type PR1) 및 클래스 Ⅰ 키티나제(class I chitinase), 오스모틴(osmotin)으로 알려진 PR5 및 글루타치온-S-트랜스퍼라제(glutathoine-S-transferase) 등이 알려져 있다. 또한, 토마토에서는 슈도모나스 시린재 pv.토마토(Pseudomonas syringae pv.tamato)에 대한 저항성 유전자로 알려진 Pto가 결합하여 병저항성 유전자군의 발현을 조절한다고 알려진 Pti 4,5,6이 EREBP계의 전사인자이며 이는 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid) 방법에 의해 분리된 바 있다.

한편, 벼는 종자 생산이 목적인 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나이나, 벼에는 60 여종 이상의 각종 병해가 발생하고 있고, 해에 따라서 그 피해가 극심할 경우 50 ~ 90%의 감수를 가져 오기도 한다. 이와 같은 피해는 인류의 안정적 식량 확보의 가장 큰 장애로 대두되어 왔고, 일례로 우리나라의 경우에도 1978년에 통일계 품종에 벼 질병이 발생하여 식량안보 차원에서 심각한 문제를 일으키고 그 결과로 대량의 쌀을 외국에서 도입하게 되는 등 한동안 사회문제가 된 바 있다.

벼 질병 중 벼 흰잎마름병(Bacterial Blight)은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae에 의해 발병하는 세균병으로 침관수가 많은 해안이나, 강 유역에서 상습적으로 발생하여 벼의 안정성 생산에 저해요인으로 작용하고 있다. 벼 흰잎마름병에 의한 피해는 지역, 기후조건, 품종, 재배법, 발병시기 및 발병정도에 따라 다양하게 나타나며, 중정도의 피해포장은 10~20%, 심한 포장은 50% 이상의 수량감소가 된다고 하였다(Choi et al., 1985; Mew, 1989).

벼 흰잎마름병은 겨풀 등에서 월동하므로 저수지나 수로에 월동잡초가 많은 경우에는 다양한 레이스의 병원균이 존재할 수 있다. 혼재된 병원균은 친화적 병원균만이 존재할 수도 있고, 친화적 병원균과 비친화적 병원균이 관개수를 따라 이동하여 벼의 잎으로 동시에 감염되면 복합적인 병변으로 나타날 것이다.

벼 흰잎마름병균은 벼 잎의 수공이나 기계적 상처로 침입하며 도관 속에서 증식 이동하여 발병되므로 육안으로 건전한 잎에서도 이미 발병이 시작된 경우가 많아 농약을 살포하여도 치료효과가 잘 나타나지 않는다. 또한 사용약제도 방제효과가 낮아 새로운 약제가 개발되기까지는 약제방제 효과를 기대하기 어렵다. 따라서, 벼 흰잎마름병의 방제는 저항성 품종의 재배가 가장 효과적인 방제방법이므로 본 병에 대한 연구는 주로 저항성 품종 육성에 필요한 저항성 유전자 분석과 균계 분화 및 분포에 관련한 연구가 많다.

벼를 비롯한 식물은 태풍, 호우, 가뭄 등과 같은 자연재해로 인한 피해가 막심하다. 특히 가뭄에 의해서는 벼를 포함하는 식물이 건조해져 고사해버리는 문제점이 있으나, 아직까지 효과가 우수한 방제 약제가 개발되지 않아 저항성 품종에 의한 방제에 의존하고 있는 실정이다.

현재 지구촌은 끊임없는 인구의 증가로 인해 더 많은 양의 식량 확보가 필요하게 되면서 이를 위한 대량재배는 병해충의 대량발생으로 이어지고, 이들의 방제를 위한 합성 농약의 남용으로 인해 자연 생태계의 파괴는 물론 잔류독성, 인축에 대한 독성, 약제 내성인 새로운 병해충의 출현 등의 문제가 야기되었다. 아울러, 이를 대체하기 위하여 신농약(저독성농약, 야생형물농약 또는 생물농약)의 개발을 위한 연구가 진행되고 있으나 그 개발속도가 수요를 충족시키지 못하고 있다. 또한, 환경보호운동과 오염되지 않은 청정농산물을 취하려는 인류의 성향은 인축에 해가 없고 잔류독성이나 자연생태계 파괴의 우려가 없는 새로운 방법을 절실히 요구하고 있다.

이에 따라 유전공학기술이 발달되면서 병 저항성 형질전환 식물이 농약을 적게 사용하면서도 안정적인 식량작물을 생산할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 식물의 병 저항성 기작을 연구하여 인축 및 환경에 독성이 없는 새로운 개념의 식물보호제를 개발하려는 시도가 선진국을 중심으로 이루어지고 있다.

한국공개특허 제2002-0015179호 미국 특허 제7351817호

Xiaolan Wu, et al., Plant Cell Reports Volume 28, Number 1, 21-30(2010)

이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 병과 재해 저항성 유전자를 이용하여 식물의 저항성을 향상시키는 방법, 이러한 유전자를 이용하여 병과 재해 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 병과 재해 저항성이 향상된 형질전환 식물을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는OsWRKY11 폴리펩티드의 세포내 수준을 조절하여 식물의 병과 재해 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 OsWRKY11 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 병과 재해 저항성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 식물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공한다.

즉, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포내 수준(level)을 증가시켜 병과 재해 저항성을 향상시키는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 식물의 병과 재해 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서는 벼 흰잎마름병 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 식물에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 병과 재해 저항성 식물 제조방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서는 벼 흰잎마름병 저항성 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터, 및 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 병과 재해 저항성이 향상된 형질전환체 및 이의 종자를 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서는 벼 흰잎마름병 저항성이 향상된 형질전환체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(이하, OsWRKY11 폴리펩티드도 동일한 의미로 칭한다)에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 병과 재해에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OsWRKY11 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsWRKY11 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 폴리펩티드와 융합으로 만들어진 융합 폴리펩티드 등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편(fragment)으로서 야생형의 OsWRKY11 폴리펩티드와 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩티드는 야생형 OsWRKY11 폴리펩티드의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 폴리펩티드의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 기전을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테아제를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

상기 OsWRKY11 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 상기 염기 서열은 야생형 폴리펩티드와 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 OsWRKY11 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 목적 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 목적 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 폴리펩티드 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 목적 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 목적 폴리펩티드의 안정성을 증진하는 방법 또는 폴리펩티드의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준 증가는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가를 위해서 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 이를 형질전환함으로써 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 116,718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 예컨대 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 유전체(genome)를 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기, 조건에 목적 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 RD29A 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게, 병 및 저해 병원균 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 감자 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 프로모터의 하류에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한 것이고, 더욱 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 연결한 것이며, 또는 바람직하게 상기 프로모터는 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터이다. 즉, 본 발명에서는 선발된 유전자를 식물 과발현 벡터인 pB2GW7을 이용하여 도입하여 재조합 벡터 pB2GW7-OsWRKY11을 제조할 수 있으며, 이러한 재조합 벡터는 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터를 가지므로 도입된 유전자가 식물체 전체에 걸쳐 상시 발현될 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 병과 재해 저항성이 향상된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.

또한 형질전환에 이용될 수 있는 균으로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 식물은 바람직하게는 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스 등의 식물일 수 있다.

본 발명에서는 OsWRKY11의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, OsWRKY11의 과발현이 병 및 재해에 대한 저항성을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공하여, 식물 종자를 수득하기 위한 재배 방법으로는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 병 및/또는 재해 저항성 유전자로 형질전환된 식물은 병 및/또는 재해 저항성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 농약사용절감과 함께 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 벼 흰잎마름 병원균 처리 시 유도되는 유전자의 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 OsWRKY11 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 pB2GW7-OsWRKY11의 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 OsWRKY11 유전자가 포함된 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체의 과발현을 검정한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 OsWRKY11 유전자에 의한 벼 흰잎마름병 저항성 변화를 평가한 사진 및 그래프이다.
도 5는 본 발명의 OsWRKY11 유전자에 의한 재해 저항성 변화를 평가한 사진이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 하기 실시예를 제시한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.

<실시예 1> 벼 유래 OsWRKY11 유전자의 분리

벼 흰잎마름병균을 처리한 벼 잎으로부터 총 RNA를 Trizol reagent kit (Invitrogen)를 이용하여 분리 한 후 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. OsWRKY11 특이적이며 게이트웨이 클로닝용 프라이머 A (5'-GAAGTGATGCTGCTGAAGAG-3'(서열번호 3))와 프라이머 B (5'-GATGGAGAGAACTCCAAGAAA-3'(서열번호 4))를 이용하여 PCR에 의해 분리하여 염기서열을 결정하였다.

이에 따라, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전사인자 OsWRKY11 및 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 전사인자 OsWRKY11을 암호화하는 유전자를 확보하였다.

<실시예 2> 벼 유래 OsWRKY11 유전자의 발현양상 분석

화청벼 종자를 3일간 발아시켜, 파종 후 3주가 된 벼를 온실에 확보하였다. 또한, 벼 흰잎마름병균을 PSA 배지에서 2일 간 키운 후, 1mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 분사(spray)로 접종한 후, 24시간 후에 시료를 채취하였다. 무처리 대조군과 병원균 처리된 잎을 채취하여 Trizol reagent kit (Invitrogen Co.)을 이용하여 총(total) RNA를 분리하였다. 상기 실시예 1에서와 같이 cDNA를 각각의 시료로 합성한 후 OsWRKY11 특이적인 프라이머 A와 프라이머 B를 이용하여 PCR을 수행한 후 아가로스겔에 전개하고 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1은 병원균 처리시 유도되는 유전자의 선발 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보는 바와 같이, OsWRKY11은 벼 흰잎마름병원균 처리에서 발현이 유도되어 증가하는 것을 볼 수 있었다.

<실시예 3> 형질 전환용 벡터 제조 및 벼로의 형질전환

도 1에서 나타난 바와 같이, OsWRKY11 유전자가 병원균에 의해 특이적으로 발현이 유도되는 효과를 확인하였으므로, 벼에서 과량으로 발현시키기 위하여 식물형질전환용 벡터를 다음과 같이 제조하였다.

먼저, OsWRKY11의 특이적인 5' 프라이머 A(5'-AA AAA GCA GGC TAC ATG GCG GCG GTG GAG AGC TCG-3'(서열번호 5))와 3' 프라이머 B (5'-AGA AAG CTG GGT ATC AGG TCT GGG GAT TAG CGG T-3'(서열번호 6))로 중합연쇄반응(PCR)(94℃ 5 분, 1 싸이클, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분, 30 싸이클, 72℃ 7 분)에 의해 증폭한 후, AttB1 (5'-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3'(서열번호 7))과 AttB2 (5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3'(서열번호 8))로 다시 PCR(94℃ 5 분, 1 싸이클, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분, 30 싸이클, 72℃ 7 분)로 증폭한 후, 인비트로젠(Invitrogen)의 게이트웨이 클로닝 시스템을 이용하여 pDONOR221에 BP 반응을 수행하여 엔트리 클론(entry clone)을 만들었다. 이 엔트리 클론으로부터 식물 발현벡터인 pB2GW7에 LR 반응을 수행하여 식물발현용 벡터 pB2GW7-OsWRKY11을 제조하였다. 상기 벡터의 개열지도는 도 2에 나타내었다.

OsWRKY11 형질전환용 벡터 pB2GW7-OsWRKY11을 아그로박테리움(Agrobacterium)에 일렉트로포레이션(electrophoration)으로 도입시키고, 그 균을 이용하여 니뽄바레벼(Orysativa sativa cv. Nipponbare)에서 유도된 캘러스(callus)에 다음과 같이 형질전환하였다.

껍질을 벗긴 니뽄바레벼(Orysativa sativa cv. Nipponbare)종자를 70% EtOH에서 1분, 50% 클로락스 용액(Clorox solution)에서 15분씩 2회 소독하고, 멸균수로 10분씩 3회 세척하였다. 소독한 종자는 2N6 배지(Hiei, Y. 등, 1994)에 치상하고, 28℃, 암 상태에서 4주간 배양하여, 엠브리오제닉 캘러스(embryogenic callus)를 형성시켰다. 다음으로, 이를 새로운 2N6 배지에 옮겨 4일간 더 배양하였다. 형질전환을 위해 pB2GW7-OsWRKY11이 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 50㎎/ℓ 스펙티노마이신(spectinomycin)과 10㎎/ℓ 테트라사이클린(tetracycline)을 포함하는 AB 아가(agar) 배지 전체에 고루 퍼지도록 접종하여, 28℃에서 2일간 배양한 후, 50mg/ℓ 스펙티노마이신, 10㎎/ℓ 테트라사이클린을 포함하는 AAM 배지(Hiei, Y. 등, 1994)에 현탁하여, OD₆₀₀이 1.8~2.0이 되도록 준비하였다. 새로운 배지에서 4일간 배양한 캘러스와 상기 아그로박테리움 LBA4404 종의 현탁액을 10분간 동시배양(co-culture)한 후 2N6-AS 배지(Hiei, Y. 등, 1994)에 옮겨 23-25℃, 암 상태에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 캘러스를 250㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime)을 포함한 멸균수로 수차례 세척하여 250㎎/ℓ 세포탁심과 6㎎/ℓ PPT(L-phosphinothricin)가 첨가된 2N6-CP 배지로 옮겨 28℃, 암 상태에서 3주간 배양하였다. 3주 후, 갈변되지 않은 캘러스를 새로운 2N6-CP로 옮겨 2주간 더 배양하였다. 2주 후, 살아남은 캘러스를 30g/ℓ 수크로오스(sucrose), 2㎎/ℓ 키네틴(kinetine), 0.5㎎/ℓ NAA, 250mg/ℓ 세포탁심 및 3㎎/ℓ PPT를 포함하는 MSR-CP(pH 5.8)로 옮겨 26℃, 항시 빛이 비치는 조건에서 한 달간 배양하였다. 한 달 후, 새로운 MSR-CP로 옮겨 더 배양한 후 형성된 슈트(shoot)를 30g/ℓ 수크로오스를 포함하는 MS0(pH 5.8)에 옮겨 뿌리를 형성시켰다. 8일 후, 뿌리가 잘 형성되면 순화과정을 거쳐 흙에 이식한 후, 온실로 옮겼다. 식물체가 어느 정도 적응하면 제초제(0.1% 바스타) 저항성을 확인하였다.

<실시예 4> 벼의 형질전환체 과발현 검정

0.1% 바스타에 저항성을 보이는 형질전환벼(1~14)에서 게놈(genomic) DNA를 분리하여 BAR 유전자의 존재 유무를 BAR 유전자에 특이적인 5' 프라이머 C (5'-ACA GCG ACC ACG CTG TTG AA-3'(서열번호 9))와 3' 프라이머 D (5'-TGC ACC ATC GTC AAC CAC TA-3'(서열번호 10)를 사용하여 55℃, 30 사이클의 PCR을 수행하여 검정하였다.

검정된 벼의 잎으로부터 총 RNA를 분리하여 역전사효소(reverse transcriptase) 반응을 통하여 cDNA를 만들고, OsWRKY11 특이적 프라이머인 A와 B를 이용하여 PCR을 수행하고, 대조군(control)으로서 액틴(actin)의 5' 특이적 프라이머 E (5'-GTC TGC GAT AAT GGA ACT GGT ATG GTC AAG GCT-3(서열번호 11))와 3' 특이적 프라이머 F (5'-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3'(서열번호 12))를 이용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 본 발명의 OsWRKY11 유전자가 포함된 발현 벡터로 각각 형질전환된 형질전환체의 과발현을 검정한 결과이다. 여기에서 보듯이, 벼 유래 OsWRKY11 유전자가 벼의 염색체에 안정적으로 도입되어 과발현된 것을 확인할 수 있었다. 여기에서 NT는 형질전환되지 않은 대조군으로서 니폰바래벼(wt)에서는 OsWRKY11 유전자가 거의 발현되지 않았음을 알 수 있었다.

<실시예 5> 벼 유래 OsWRKY11 형질전환체의 벼 흰잎마름병 저항성 증진 확인

전사인자는 유전자군의 발현을 조절하는 기작으로 광역의 병원균이나 광역의 스트레스에 대해 저항성을 보이는 특징이 있다고 보고되어 있다. OsWRKY11 형질전환벼를 벼에서의 대표적인 병중의 하나인 벼 흰잎마름병에 대해 저항성을 보이는지 여부를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

벼 흰잎마름병균을 PSA 배지에서 2일간 키운 후, 1mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하였다. 이를 대조군으로서 일반벼 및 OsWRKY11 형질전환벼(#79 과 #80)의 잎의 끝에 가위로 자르는 방법에 의해 접종하였다. 접종을 하고 난 17일 후, 병원균이 진전되는 정도를 자로 재었고, 잎길이로 나누어 주어 보정하였다. 그 결과는 도 4a 및 도 4b에 각각 나타내었다. 도 4a 및 4b는 OsWRKY11 유전자에 의한 벼 흰잎마름병 저항성 변화를 평가한 사진 및 그래프이다.

도 4a 및 4b에서 나타난 바와 같이, 형질전환벼는 대조군으로서의 일반벼에 비해 병의 진전이 매우 적음을 알 수 있었다.

<실시예 6> 벼 유래 OsWRKY11 형질전환체의 재해 저항성 증진 확인

벼 유래 OsWRKY11 형질전환체가 재해 저항성과 관련이 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 벼를 온실에서 3주 키운 후에 도 5에 나타낸 화분으로 옮겨 심은 후 8일 동안 물을 주지 않은 상태로 관찰하였다. 도 5는 OsWRKY11 유전자에 의한 재해 저항성 변화를 평가한 사진이다. 여기에서, 가뭄 후 8일 경과 후 좌측의 비 형질전환체는 심한 건조현상이 나타난 것을 볼 수 있으며, 우측의 벼 유래 OsWRKY11 형질전환체는 건조 저항성을 나타내는 것이 확인되었다. 또한 물을 주지 않은 지 10일후에 물을 준 후 5일후 관찰한 것이 도 5에서 왼쪽사진이다. 건조현상이 비 형질전환체에서는 전혀 개선되지 않고 오히려 더 악화되어 식물이 고사된 것을 확인할 수 있었으며, 이에 반해 우측의 벼 유래 OsWRKY11 형질전환체는 재해(건조) 저항성을 뚜렷이 나타낸 바, 벼 유래 OsWRKY11 형질전환체는 비 형질전환체에 비해 월등한 재해 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면 병 및 재해 저항성을 갖는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있으며, 이로부터 보다 안전한 형질전환 식물체 및 농산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 병 및 재해 저항성 품종육성으로 개발 가능하며 이로 인한 농약사용절감과 함께 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 삭제
2. 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 벼의 병 및 재해 저항성을 향상시키는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 벼에 형질전환하거나, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 벼세포에 도입하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것에 특징이 있는 방법.
5. 삭제
6. 제 2항에 있어서, 상기 병이 벼 흰잎마름병인 것에 특징이 있는 방법.
7. 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 벼에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 병 및 재해 저항성 벼 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 병이 벼 흰잎마름병인 것에 특징이 있는 제조방법.
9. 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터.
10. 제 9항의 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 병 및 재해 저항성이 향상된 벼의 형질전환체.
11. 제 10항에 있어서, 상기 병이 벼 흰잎마름병인 것에 특징이 있는 벼의 형질전환체.
12. 제 10항의 벼의 형질전환체에서 수득한 벼 종자(seed).

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