KR20160039171A - 오이 유래의 CsGolS1 유전자를 이용한 고온 또는 염에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오이 유래의 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용한 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법; 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체의 제조 방법; 이를 통해 제조된 고온 내성 및 내염성을 갖는 형질전환 수박 식물체와 이의 종자; 및 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자가 도입된 형질전환 공대수박의 경우, 고온 환경에 따른 환경스트레스에서 고온 단백질인 HSP70(heatshcok protein 70)의 발현 증대 효과와 더불어 엽록소에서의 클로로필 파괴가 감소됨으로 인해 고온내성을 가지며; 고농도의 염(salt) 조건하에서 내성이 증가될 뿐만 아니라; 식물 병원균 및 진균에 대한 항균활성을 갖는다. 따라서 본 발명에 따른 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용하는 경우 고온 내성, 내염성 및 내병성을 갖는 공대수박 형질전환체 개발이 가능함으로써 농업 산업에 있어서 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오이 유래의 CsGolS1 유전자를 이용한 고온 또는 염에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 용도{Transgenic plant with enhanced tolerance to heat stress and salt stress by introducing CsGolS1 gene and use thereof}

본 발명은 오이 유래의 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용한 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법; 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체의 제조 방법; 이를 통해 제조된 고온 내성 및 내염성을 갖는 형질전환 수박 식물체와 이의 종자; 및 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

지구온난화 및 이상기후에 따른 극심한 가뭄 혹은 저온 스트레스에 의해 농작물의 피해가 점점 증대할 뿐만 아니라, 수자원(물)의 확보 및 작물 재배에 있어서 관수 방법 개발이 세계 모든 국가가 갖고 있는 앞으로의 사회적ㆍ산업적인 문제점으로 대두되어지고 있다.

특히 수박은 연작의 피해가 심한 작물이기 때문에 수박에 치명적인 토양전염성 병의 회피 및 품질향상 그리고 수량증대를 위해 내건성, 내습성 및 저온신장성 등과 같은 불량환경에 내성이 강한 대목을 이용한 접목재배가 이루어지고 있는 실정이다. 그러한 이유로 접목친화성이 좋고 토양전염성 병에 강하며 동시에 극심한 가뭄 혹은 저온 스트레스와 같은 불량환경에 내성이 강한 대목이 필요하나 현재 수박 대목으로 많이 이용되고 있는 참박과 공대수박은 각각 대목으로써 단점을 가지고 있으므로, 이를 보강해 주기 위해서는 노력의 일환으로 내병성과 내재해성이 강화된 형질전환 대목의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 라피노스 (raffinose), 스타키요스 (stachyose), 버바스코스 (vervascose) 등과 같은 라피노스계 올리고당류(raffinose family oligosaccharides; 이하 간략하게 ‘RFOs’라 약칭함)는 주로 여러 가지 식물 종의 종자에 풍부히 존재하지만, 식물이 스트레스를 받게 되면 종자 이외에 식물의 다른 조직에서도 이들 물질이 집적된다. 이들 RFOs 생합성회로에 열쇠 역할을 하는 갈락티놀 합성효소(galactinol synthase: 이하 간략하게 ‘GolS’라 약칭함)는 유디피 갈락토스(UDP-Gal)와 묘이노시톨(myoinositol)로부터 갈락티놀을 합성하며 이 갈락티놀은 RFOs의 형성에 필요한 갈락토실 제공자(galactosyl donor) 역할을 수행하게 된다.

특히, 박과작물인 멜론에서 갈락티놀 합성효소 유전자는 고온에 노출되었을 때 유전자 발현이 증가될 뿐만 아니라 거대세포바이러스(Cytomegalovirus, CMV)에 감염시켰을 때도 갈락티놀 합성효소 활성이 증가된다고 보고되었다(Lidor et al., 2012). 또한 브라시카 나푸스(Brassica napus) 종자에 건물중(dry weight)의 퇴적(deposition)과 건조내성을 획득하는데도 갈락티놀 합성효소 활성이 중요하다고 알려져 있다(Li et al., 2011).

그러나 이러한 갈락티놀 유전자가 박과작물에 도입되어 고온이나 염에 대한 환경스트레에 내성을 가져오는 형질전환체에 관한 연구는 진행된 바가 없다.

이에 본 발명자는 오이 유래의 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 과다 발현할 수 있는 벡터를 공대수박에 도입하여 형질전환체를 제조한 후, 이들 형질전환 수박에서의 고온내성 증진효과 및 내염성 증진효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-1209219호 한국등록특허 제10-1293453호 한국공개특허 제10-2014-0063309호 한국공개특허 제10-2014-0063310호 한국공개특허 제10-2014-0050218호

본 발명의 목적은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용하여 수박에서 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용하여 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 수박 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 수박 식물세포에서 과발현시켜 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박 식물세포에 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기에 따른 수박 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는, 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자는 식물 발현용 재조합 벡터에 포함된 형태일 수 있다.

본 발명의 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자가 도입된 형질전환 공대수박의 경우, 고온 환경에 따른 환경스트레스에서 고온 단백질인 HSP70(heatshcok protein 70)의 발현 증대 효과와 더불어 엽록소에서의 클로로필 파괴가 감소됨으로 인해 고온내성을 가지며; 고농도의 염(salt) 조건하에서 내성이 증가될 뿐만 아니라; 식물 병원균 및 진균에 대한 항균활성을 갖는다. 따라서 본 발명에 따른 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 이용하는 경우 고온 내성, 내염성 및 내병성을 갖는 공대수박 형질전환체 개발이 가능함으로써 농업 산업에 있어서 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 공대수박에서의 CsGolS1 유전자의 게놈 내 유전자 삽입 여부를 알아보기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 1A는 공대수박의 형질전환체로부터 35S 전신발현 프로모터의 삽입 여부를 분석한 결과이다. 도 1B는 공대수박의 형질전환체로부터 35S 전신발현 프로모터와 CsGolS1 유전자의 삽입여부를 PCR을 통해 분석한 결과이다. NC: 음성 대조군 (Negative control, 야생형(Wild type)), PC: 양성 대조군 (Positive control, 플라스미드(plasmid)), GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환체 라인.
도 2는 CsGolS1 유전자의 RNA 수준에서 발현여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다. WT:야생형(Wild type), GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환체 라인.
도 3은 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 공대수박 식물체 잎에서 클로로필 함량 측정을 통해 고온에 대한 내성을 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이다. Wild type: 야생형 공대수박, GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환 공대수박 라인.
도 4는 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 공대수박 식물체 잎에서 고온내성에 표지마커 유전자인 Citrullus lanatus heat shock protein 70 precursor (Clhsp70)에서 프라이머를 제작하여 이들 유전자의 발현 정도를 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이다. Wild type: 야생형 공대수박, GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환 공대수박 라인.
도 5는 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 공대수박 식물체 잎에서 클로로필 함량 측정을 통해 고염에 대한 내성을 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 5A는 각 식물체 잎을 250mM의 NaCl이 첨가된 물에 담가 5일 후에 클로로필 함량을 측정한 것이며, 도 5B는 각 식물체 잎을 250mM의 만니톨이 첨가된 물에 담가 5일 후에 클로로필 함량을 측정한 결과이다. Wild type: 야생형 공대수박, GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환 공대수박 라인.
도 6은 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 공대수박의 병원성 곰팡이 덩굴마름병원균(Didymella bryoniae KACC40669)에 대한 저항성 유도를 대조구와 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 병원성 곰팡이 덩굴쪼김병원균(Fusarium oxysporum)에 대한 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 공대수박 단백질의 시험관내(in vitro) 항진균 활성을 나타낸다. 도 7a는 덩굴쪼김병원균(F. oxysporium) KACC40901 R1, 도 7b는 덩굴쪼김병원균(F. oxysporium) KACC40901 R2, 그리고 도 7c는 덩굴쪼김병원균(F. oxysporium) KACC40905에 대한 항진균 활성을 나타낸 것이다. Wild type: 야생형 공대수박, GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3: 형질전환 공대수박 라인.

본 발명은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자의 식물에 있어서 고온 내성, 내염성 및 내병성의 용도를 그 특징으로 한다.

본 발명에서 CsGolS1 유전자는 서열번호 1의 염기서열(핵산서열)을 가지며, 이에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다.

바람직하게, 본 발명에서 CsGolS1 유전자는 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 유전자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명에서 개시하는 서열번호 1의 핵산서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 배열 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명자는, 상기와 같은 핵산서열을 갖는 본 발명의 오이 유래 CsGolS1 유전자를 수박에 도입 하는 경우, 고온 내성 증진 효과, 내염성 및 내병성에 대한 효과를 최초로 규명하였다. 그러므로 CsGolS1 유전자를 이용하여 고온에서 내성을 가지면서 또한 고염 조건 하에서 저항성이 월등하게 증진된 수박을 제조할 수 있다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 재조합 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입 시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 재조합 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제 가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 방법은 오이 유래 CsGolS1 유전자를 수박 식물세포에 과발현시켜 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시킬 수 있다.

식물체 내에 CsGolS1 유전자의 도입은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 식물 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다. 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB(blue copper binding protein) 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 실제로 공대수박에 CsGolS1 유전자 도입을 위해 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 이용하였다.

또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 또는 제초제(예: 바스타) 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt) 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.

상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며(Agrobacterium- mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens ) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes )를 사용할 수 있다. 그밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.

본원에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 임의의 식물세포가 이용가능하다. 식물세포는 배양세포, 배양조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양세포, 배양조직 또는 배양기관 및 더욱 바람직하게는 배양세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 줄기, 잎, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.

한편, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물의 종류는 수박이 바람직하다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박에 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 방법에 의해 제조된 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1 유전자를 포함하는, 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 CsGolS1 유전자는 식물 발현용 재조합 벡터에 포함된 형태일 수 있으며, 이때 사용될 수 있는 식물 발현용 재조합 벡터는 상기에서 설시한 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될수 있도록 디자인된 일반 벡터일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

CsGolS1 유전자를 발현하는 발현벡터를 이용한 형질전환체 제조

<1-1> 공대수박 유묘의 자엽절편 준비

본 실험의 재료인 공대수박 inbred line 수박시험장에서 분양받아 사용하였다. 종자는 종피를 제거하고 70% 에탄올에 1분간 침지 후 2% NaOCl에 5분간 멸균하여 표면 살균하였다. 이를 멸균 증류수로 5회 세척한 후 10분간 멸균한 필터페이퍼(110mmDia, Whatman, USA) 위에서 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 종자를 MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본배지에 3% su-crose와 0.5g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid(MES), 그리고 3g/L의 phytagel(Sigma, USA)을 첨가하여 26℃ 배양기 내암 조건 하에서 발아를 유도하였다. 발아 후 5~7일된 유묘의 자엽은1×0.5cm 정도로 2등분 횡절단하여 절편체로 재분화에 사용하였다. 절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 petri-dish(SPL, South Korea)당 15개씩 각각 치상하였고 26±2℃, 16시간 광주기, 2000 Lux광도의 배양실에서 배양하였다.

<1-2> CsGolS1 유전자를 발현하는 발현벡터의 제조

오이(Cucumis sativus L., cv. Baekseong)에서 포워드 프라이머: 5‘ GCTCTAGAAAGTTAATATGTCTCC-3' 리버스 프라이머: 5' GGGGTACCATATACTTAAGCAGCAGA-3'로 이용하여 서열번호 1의 핵산서열(하기 표 1 참조)로 이루어진 CsGolS1 유전자를 합성하였고 이 산물을 KpnI과 Xba I 제한효소로 처리한 후 동일한 효소로 처리된 바이너리 벡터(binary vector)에 재조합하였다. 상기 식물세포형질전환용 바이너리 벡터는 항상 발현 CaMV 35S 프로모터와 항생제 카나마이신을 선별마커로 쓸 수 있는 NPTII 유전자를 포함하고 있는 pBI121을 사용하였다. 공대수박 형질전환에 사용할 아그로박테리움은 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 아그로박테리움 튜머파시언스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404) 균주를 사용하였다. pBI121에 재조합된 CsGolS1 아그로박테리움 튜머파시언스 LBA4404 균주에 도입한 후 공대수박 형질전환에 이용하였다.

CsGolS1의 유전자 핵산서열 및 단백질 아미노산 서열

서열번호 1

atg tct cca gca gct gcc cca gaa agt gcc att gag tca acc gac gct ccc aag agg gcg tac gtg acg ttc ttg gct ggt aat ggt gac tat tgg aaa ggt gta gtt gga ttg gca aag ggt ctc aga aag gtc aaa gcc gcc tac cct ctc att gta gct gtc ctt cct gat gtt cct gaa gat cat cgg caa atc ctc gag tat cag ggt tgt atc gtc cgt gag atc gaa cct gtt tac cct cca gca aac cag acc caa ttt gcc atg gct tac tat gtt atc aac tac tca aag ctt agg atc tgg gag ttt gtg gag tat gag aag ctg ata tat ttg gac gga gac atc caa gtg ttt gaa aac ata gac cat ttg ttt gaa atg cca agt gga tac ttc tat gca gtg atg gat tgc ttt tgt gag aag aca tgg agt aac tct cca caa tac aaa att ggg tat tgc caa caa tgc cct gac aaa gtg aaa tgg cct gtg gag gaa atg gga aac cca cca cca ctt tac ttc aat gct gga ttc ttt gtg tat gaa cct gat ctt ttc act tac aag gat ctt ctt gag act tgc aag gcc acc act cca act ttg ttt gct gag cag gac ttt ttg aac atg tac ttc aac gac ata tac aag ccc att cct cca att tac aac ctc gtc atg gcc atg ttg tgg cgt cat ccc gag aac att gac gtc gac aaa gtc aaa gtt gtc cat tat tgt gca gcg gga tcg aaa cca tgg agg tac acg gga aaa gaa gag aac atg gag agg gaa gac ata aaa atg ctg gtg aag aaa tgg tgg gaa gtt tat gaa gat gaa tct ttg gat tac caa aat gtc ctc aaa tct gaa act aaa caa gaa act aac ctc aca cct ttg atc tct gtt ctg tcc gag gct gaa gtt gtc aac cac atc aca gct cct tct gct gct taa

서열번호 2

MSPAAAPESAIESTDAPKRAYVTFLAGNGDYWKGVVGLAKGLRKVKAAYPLIVAVLPDVPEDHRQILEYQGCIVREIEPVYPPANQTQFAMAYYVINYSKLRIWEFVEYEKLIYLDGDIQVFENIDHLFEMPSGYFYAVMDCFCEKTWSNSPQYKIGYCQQCPDKVKWPVEEMGNPPPLYFNAGFFVYEPDLFTYKDLLETCKATTPTLFAEQDFLNMYFNDIYKPIPPIYNLVMAMLWRHPENIDVDKVKVVHYCAAGSKPWRYTGKEENMEREDIKMLVKKWWEVYEDESLDYQNVLKSETKQETNLTPLISVLSEAEVVNHITAPSAA

<1-3> 형질전환체 제조

공대수박의 형질전환을 유도하기 위해서 상기 실시예 <1-2>를 통해 제조된 CsGolS1 유전자를 포함한 pBI121 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜머파시언스 LBA4404 균주를 25μg/ml 리팜피신(rifampicin)과 50μg/ml 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 YEP(10g of yeast extract and 20g of Bacto peptone) 액체배지에서 2일간 배양한 후, 상기 실시예 <1-1>을 통해 준비된 5~7일된 공대수박 유묘의 자엽절편과 공동배양하였다. 식물 생장조절체가 첨가되지 않은 MS배지에서 2일간 공동배양된 공대수박의 자엽절편을 250μg/ml 세포탁심(cefotaxime)과 다양한 농도의 생장조절제를 첨가한배지에 옮겨 배양하였다. 오이 유래 갈락티놀 합성효소 CsGolS1 유전자가 형질전환된 공대수박은 50μg/ml 카나마이신 배지에서 생장이 가능하였고 이러한 형질전환체의 genomic DNA 및 total RNA를 분리하여 PCR 분석을 통해 유전자 도입 여부를 확인하였다.

< 실시예 2>

형질전환체 내 CsGolS1 유전자 삽입 여부를 검증

<2-1> PCR 분석

CsGolS1 유전자 삽입 여부를 확인하기 위하여 공대수박 야생형 및 형질전환체들의 잎을 채취하여 DNeasy plant mini kit(Qiagen)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였고 PCR 분석에 의해 유전자 도입여부를 확인하였다. 35S 전신발현 프로모터와 CsGolS1 유전자 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다. CaMV 35S-F (5’-GAC CTA ACA GAA CTC GCC G-3’) 및 CaMV 35S-R (5'-ATA TAG AGG AAG GGT CTT GCG-3’), CaMV 35S-F2 (5'-GAA GGT GGC TCC TAC AAA TGC CAT-3') 및 CsGolS1-R (5'-TCG ATC TCA CGG ACG ATA CAA CCC-3’)이다. PCR 수행조건은 Taq polymerase 가 첨가된 PCR premix (Bioneer, Korea)를 이용하여 최초 95℃ 에서 5분간 pre-denaturation 후 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초간 35회 반응시킨 후 최종적으로 72℃에서 7분간 post-extension시켜 PCR를 종료하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 형질전환체 라인 GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3에서 각각 CsGolS1 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<2-2> Semi- quantative RT- PCR 분석

CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환체의 발현양상을 조사하기 위해 형질전환체들의 잎을 채취하여 액체 질소로 급속 냉동한 후 80℃에 보관하여 RNA 분리에 사용하였다 100mg의 조직을 액체질소에 급속 냉동시켜 아주 미세하게 파쇄하여 분말화 한 후, RNeasy plant mini kit(Qiagen)을 이용하여 공대수박 야생형 및 형질전환체의 잎에서 총 RNA를 추출하였다. 본 실험을 수행하기 위해 cDNA 합성은 amfiRivertII cDNA synthesis master mix (GenDepot)을 이용하였고, 총 RNA는 0.5ug을 정량화하여 사용하였다. Semi-quantative RT-PCR은 CsGolS1 유전자의 특정부위에서 CsGolS1-F(RT) (5’-ACTTGCAAGGCCACCACTCC-3’) 및 CsGolS1-R(RT) (5’-GACAAC TTC AGCCTCGGAC-3’)를 제작하여 사용하였으며, 수박 액틴 유전자의 프라이머 actin-F(RT) (5’-CATTCTCCGTTGGACCTTGCT-3’) 및 actin-R(RT) (5’-TCGTAGTTTTTC TCAATGGAGGAACTG-3’)를 제작하여 내부표준물질(internal standard)로 이용하였다. cDNA 합성 후 유전자의 증폭반응은 25㎕의 반응액을 94℃에서 40초 동안 변성(denaturation)을 하였고, 60℃에서 40초 동안 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 동안 신장(extension)을 하였으며 35회를 계속해서 PCR을 시행하였다. 이후 PCR 산물을 1.2% 아가로스 젤에서 EtBr 염색을 통해 UV하에서 확인하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 형질전환체 라인 GolS1-3, GolS9-4, GolS10-1, GolS13-1, GolS45-1, GolS45-3에서 각각 CsGolS1 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 1>

CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환 수박에서의 고온내성 증진 효과

본 실험에서 사용된 식물은 공대수박 야생형 및 상기 실시예 1을 통해 제조된 CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환 수박을 사용하였다. 공대수박과 형질전환 계통은 발아를 위해 미지근한 물에서 6~8시간 침종한 후 물기를 닦아내고 젖은 타월에 싸서 3일간 25℃ 항온기에서 발아시켜 바이오상토에 파종하였다. 식물체는 28℃의 장일조건(16시간 명조건/8시간 암조건 주기)에서 배양하였다.

<1-1> 클로로필 함량측정

CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 수박의 고온에 대한 내성을 알아보기 위하여 공대수박 야생형 및 형질전환체들의 본엽이 4~5개 전개된 식물체를 배양기에서 55℃로 3시간 고온 처리를 하고 25℃의 배양실로 옮겨 3일간 배양하였다. 그리고 잎을 채취하여 cork-borer로 천공하고 무게를 측정한 후 클로로필을 추출하여 정량함으로써 식물의 고온내성 정도를 분석하였다. 상기 식물체 잎들을 95% 에탄올 1ml에 넣고 80℃에서 20분간 가열 반응시킨 후 상등액은 분광광도계를 이용하여 A664 및 A648에서 측정하였다. 총 클로로필 함량은 Lichtenthaler H.K. (1987, Methods in Enzymol, 148, 350-382)의 방법으로 수행하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 야생형과 비교하여 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환체 라인에서 클로로필의 함량이 증대되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환체에서 고온 환경에 따른 클로로필의 파괴가 감소됨을 의미하는 것이다.

<1-2> Heatshock protein 발현 양 측정

고온 단백질 heatshcok protein 70 (HSP70)은 분자샤페론으로써 환경스트레스와 발달단계 동안 단백질을 보호하고 합성하는 다양한 과정에 관여하는 기본적인 단백질이다. 이에 본 발명자는 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 수박의 고온에 대한 내성을 알아보기 위하여 공대수박 야생형 및 형질전환체들의 본엽이 4~5개 전개된 식물체를 배양기에서 55℃로 3시간 고온 처리를 하고 25℃의 배양실로 옮겨 3일간 배양하였다. 고온 스트레스를 받은 식물체의 잎을 채취하여 액체질소에 얼리고 -70℃에서 보관하였다. 이로부터 총 RNA를 추출하였으며, Plant Rneasy extraction kit (Qiagen, USA)를 사용하였다. RNA농도를 분광광도계로 정확히 정량하고, absorbance ratio (A260/A280)가 1.8～2.0 사이인지 확인하였다. 약 0.5 ug의 총 RNA를 amfiRivertII cDNA synthesis Master mix kit (GenDEPOT, USA)에서 제공하는 방법에 따라 25℃에서 5분간, 50℃에서 60분간 반응시키고, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 RT-PCR은 AccuPower PCR PreMix Kit (BioNEER, KOR)를 사용하였다. 94℃에서 30초간 변성(denaturation)을 실시하였고 55℃에서 30초간 어닐링(annealing) 반응을, 72℃에서 30초간 신장(extension) 반응을 실시하여 최종 30회 반응을 수행하였다. PCR 반응은 1.2% 아가로스 젤 전기영동을 통하여 분석하였다. 이 실험에 사용된 프라이머는 고온내성 표지마커 유전자인 HSP70 (Clhsp70-F : 5‘-GCA ATT CTT CTG CTT TTC CT-3’, Clhsp70-R : 5’-CCT GTC TCC GAT TTT TGT GT-3’)과 내부표준물질로서 액틴(Clactin-F : 5’-CAT TCT CCG TTT GGA CCT TGC T-3’, Clactin-R : 5’-TCG TAG TTT TTC TCA ATG GAG GAA CTG-3’)를 BioNEER사에서 주문하여 사용하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 야생형과 비교하여 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환체 라인에서 HSP70 발현량이 증대되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 CsGolS1 유전자가 고온 환경에 따른 환경스트레스에서 HSP70 발현 증대에 관여함으로서 수박의 고온내성에 기여함을 의미하는 것이다.

< 실험예 2>

CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환 수박에서의 내염성 증진 효과

CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 수박의 고염에 대한 내성을 알아보기 위하여 공대수박 야생형 및 형질전환체들 파종 4~34주 후 전개된 본엽을 채취하여 cork-borer로 천공하여 250mM NaCl과 만니톨 용액이 각각 5㎖씩 포함된 6-웰 마이크로 플레이트에 넣고 엽록소의 누출정도를 관찰하고 5일 경과 후 총 클로로필을 추출하였다. 상기 식물체 잎들을 95% 에탄올 1ml에 넣고 80℃에서 20분간 가열 반응시킨 후 상등액은 분광광도계를 이용하여 A664 및 A648에서 측정하였다. 총 클로로필 함량은 Lichtenthaler H.K. (1987, Methods in Enzymol, 148, 350-382)의 방법으로 수행하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 야생형은 NaCl 용액(도 5A 참조) 또는 만니톨 용액(도 5B 참조)을 처리한 후 5일이 경과된 시점에 엽록소의 급격히 감소되어 총 클로로필의 함량이 매우 저조한 것으로 확인되었으나, 본 발명의 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환체 라인에서에는 야생형 대비 비교적 높은 클로로필 함량이 측정됨에 따라, CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환체가 상대적으로 높은 엽록소 함량을 유지하는 것으로 나타났다.

따라서 이와 같은 실험 결과를 통해, CsGolS1 유전자가 수박의 내염성 증진에 기여함을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3>

CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환 수박에서의 식물 병원균 저항성 효과

CsGolS1 유전자가 과다발현되는 형질전환 수박의 내병성 여부를 확인하기 위하여 식물체에 수박덩굴마름병을 일으키는 덩굴마름병원균(Didymella bryoniae KACC40669)를 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 25℃에서 7일 이상 배양한 후 PDB(potato dextrose broth)를 이용하여 배지 위에서 균체를 회수하고 멸균된 거즈를 이용하여 균사를 걸러낸 다음 포자만을 회수하였다. Haemacytometer(Marienfeld co, LAUDA-KOENIGSHOFEN, Germany)를 이용하여 접종원의 농도를 맞추었으며, 식물체 감염 시 Didymela bryoniae (KACC40669)의 경우 5×10⁵ cfu/㎖의 농도로 포자 현탁액을 만들었다. 파종 후 본엽이 2~3매 전개하기 시작할 때 각 식물체 잎에 각 포자현탁액을 20ul씩 drop 접종하여 병원균을 감염시켰다. 이후 습실 처리된 플라스틱 용기에 넣고 발병 여부를 접종 3일 후 병반의 크기를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 야생형은 덩굴마름병원균 감염에 따라 병반의 크기가 매우 큰 반면, 본 발명의 CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환체 라인에서에는 야생형 대비 덩굴마름병원균 감염에 따른 병반의 크기가 거의 없거나 매우 작게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이와 같은 실험 결과를 통해, CsGolS1 유전자는 고온 내성 및 내염성과 더불어 식물 병원균에 대한 저항성도 증진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

< 실험예 4>

CsGolS1 유전자가 도입된 형질전환 수박에서의 항진균 활성 효과

CsGolS1 유전자가 과다 발현되는 형질전환 수박의 항진균 활성 여부를 확인하기 위하여 식물체에 수박덩굴쪼김병을 일으키는 Fusarium oxysporum KACC40901 R1과 R2, 및 KACC40905를 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 25℃에서 7일 이상 배양한 후 PDB (potato dextrose broth)를 이용하여 배지 위에서 균체를 회수하고 멸균된 거즈를 이용하여 균사를 걸러낸 다음 포자만을 회수하였다. Haemacytometer (Marienfeld co, LAUDA-KOENIGSHOFEN, Germany)를 이용하여 접종원의 농도를 맞추었으며, 항진균 활성 분석 시 F. oxysporum의 경우 1×10⁴ cfu/㎖의 농도로 포자 현탁액을 만들었다.

공대수박 야생형 및 형질전환체들의 잎을 채취하여 액체 질소로 급속 냉동한 후 80℃에 보관하여 총 단백질 분리에 사용하였다 0.5g의 조직을 액체질소에 급속 냉동시켜 아주 미세하게 파쇄하여 분말화 한 후, 1㎖의 PBS buffer(pH 7.0)를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시키고 총 단백질을 추출하였다. 상기 상등액은 Bio-rad protein assay를 이용하여 단백질을 100ug/ul로 정량한 후 상기 병원성 곰팡이 포자 현탁액을 96 웰 플레이트에 100ul씩 분주한 후 추출한 식물체 총 단백질을 100ul씩 분주하여 25℃ shaking incubator에서 배양하였다. 분광광도계를 이용하여 OD 595nm에서 0, 24, 48시간에 측정하였다.

그 결과는 도 7에서 나타내었다. 다양한 진균에 대한 항균활성은 형질전환체인 라인마다 각각 차이가 있었으나, GolS10-1 및 GolS45-3 라인을 제외하고는 거의 대부분의 형질전환체인 라인에서 야생형 대비 항진균 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

CsGolS1: 오이 유래 갈락티놀 합성효소 유전자

<110> CHUNNAM TECHNO UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMY COOPERRATION FOUNDATION <120> Transgenic plant with enhanced tolerance to heat stress and salt stress by introducing CsGolS1 gene and use thereof <130> KP3118 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 996 <212> DNA <213> Cucumis sativus <400> 1 atgtctccag cagctgcccc agaaagtgcc attgagtcaa ccgacgctcc caagagggcg 60 tacgtgacgt tcttggctgg taatggtgac tattggaaag gtgtagttgg attggcaaag 120 ggtctcagaa aggtcaaagc cgcctaccct ctcattgtag ctgtccttcc tgatgttcct 180 gaagatcatc ggcaaatcct cgagtatcag ggttgtatcg tccgtgagat cgaacctgtt 240 taccctccag caaaccagac ccaatttgcc atggcttact atgttatcaa ctactcaaag 300 cttaggatct gggagtttgt ggagtatgag aagctgatat atttggacgg agacatccaa 360 gtgtttgaaa acatagacca tttgtttgaa atgccaagtg gatacttcta tgcagtgatg 420 gattgctttt gtgagaagac atggagtaac tctccacaat acaaaattgg gtattgccaa 480 caatgccctg acaaagtgaa atggcctgtg gaggaaatgg gaaacccacc accactttac 540 ttcaatgctg gattctttgt gtatgaacct gatcttttca cttacaagga tcttcttgag 600 acttgcaagg ccaccactcc aactttgttt gctgagcagg actttttgaa catgtacttc 660 aacgacatat acaagcccat tcctccaatt tacaacctcg tcatggccat gttgtggcgt 720 catcccgaga acattgacgt cgacaaagtc aaagttgtcc attattgtgc agcgggatcg 780 aaaccatgga ggtacacggg aaaagaagag aacatggaga gggaagacat aaaaatgctg 840 gtgaagaaat ggtgggaagt ttatgaagat gaatctttgg attaccaaaa tgtcctcaaa 900 tctgaaacta aacaagaaac taacctcaca cctttgatct ctgttctgtc cgaggctgaa 960 gttgtcaacc acatcacagc tccttctgct gcttaa 996 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Cucumis sativus <400> 2 Met Ser Pro Ala Ala Ala Pro Glu Ser Ala Ile Glu Ser Thr Asp Ala 1 5 10 15 Pro Lys Arg Ala Tyr Val Thr Phe Leu Ala Gly Asn Gly Asp Tyr Trp 20 25 30 Lys Gly Val Val Gly Leu Ala Lys Gly Leu Arg Lys Val Lys Ala Ala 35 40 45 Tyr Pro Leu Ile Val Ala Val Leu Pro Asp Val Pro Glu Asp His Arg 50 55 60 Gln Ile Leu Glu Tyr Gln Gly Cys Ile Val Arg Glu Ile Glu Pro Val 65 70 75 80 Tyr Pro Pro Ala Asn Gln Thr Gln Phe Ala Met Ala Tyr Tyr Val Ile 85 90 95 Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Ile Trp Glu Phe Val Glu Tyr Glu Lys Leu 100 105 110 Ile Tyr Leu Asp Gly Asp Ile Gln Val Phe Glu Asn Ile Asp His Leu 115 120 125 Phe Glu Met Pro Ser Gly Tyr Phe Tyr Ala Val Met Asp Cys Phe Cys 130 135 140 Glu Lys Thr Trp Ser Asn Ser Pro Gln Tyr Lys Ile Gly Tyr Cys Gln 145 150 155 160 Gln Cys Pro Asp Lys Val Lys Trp Pro Val Glu Glu Met Gly Asn Pro 165 170 175 Pro Pro Leu Tyr Phe Asn Ala Gly Phe Phe Val Tyr Glu Pro Asp Leu 180 185 190 Phe Thr Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Thr Cys Lys Ala Thr Thr Pro Thr 195 200 205 Leu Phe Ala Glu Gln Asp Phe Leu Asn Met Tyr Phe Asn Asp Ile Tyr 210 215 220 Lys Pro Ile Pro Pro Ile Tyr Asn Leu Val Met Ala Met Leu Trp Arg 225 230 235 240 His Pro Glu Asn Ile Asp Val Asp Lys Val Lys Val Val His Tyr Cys 245 250 255 Ala Ala Gly Ser Lys Pro Trp Arg Tyr Thr Gly Lys Glu Glu Asn Met 260 265 270 Glu Arg Glu Asp Ile Lys Met Leu Val Lys Lys Trp Trp Glu Val Tyr 275 280 285 Glu Asp Glu Ser Leu Asp Tyr Gln Asn Val Leu Lys Ser Glu Thr Lys 290 295 300 Gln Glu Thr Asn Leu Thr Pro Leu Ile Ser Val Leu Ser Glu Ala Glu 305 310 315 320 Val Val Asn His Ile Thr Ala Pro Ser Ala Ala 325 330

Claims (7)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 방법은 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 수박 식물세포에 과발현시켜 수박 식물의 고온 및 고염에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수박 식물세포에 형질전환시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체의 제조 방법.
4. 제3항의 방법에 의해 제조된 고온 및 고염에 대한 내성이 증가된 형질전환 수박 식물체.
5. 제4항에 따른 형질전환된 수박 식물체의 종자.
6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 오이 유래 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자를 포함하는, 수박 식물체의 고온 및 고염에 대한 내성 증진용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 CsGolS1(Cucumis sativus galactinol synthase) 유전자는 식물 발현용 재조합 벡터에 포함된 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.

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