KR101360542B1 - 벼 유래의 ＯｓＳＥＲＫ１ 유전자 및 그에 의해서 형질전환된 벼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는, 벼 유래의 OsSERK1 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질 전환된 식물에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 벼의 생장과 발달 기작을 밝히고, 생산성 및 질병 내성이 향상된 벼 식물의 개발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

벼 유래의 ＯｓＳＥＲＫ１ 유전자 및 그에 의해서 형질전환된 벼{RICE OsSERK1 GENE AND TRANSGENIC RICE TRANSFORMED WITH THE SAME}

본 발명은 벼 유래의 OsSERK1 유전자 및 그에 의해서 형질전환된 식물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼의 생장과 잎 성장에 영향을 미치는 OsBAK1을 포함하는 OsSERK 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질 전환된 벼에 관한 것이다.

벼는 화본과에 속하는 1년생 초본식물로, 생산량이 밀 다음으로 많아 세계 인구의 약 50%가 주식으로 이용하고 있다. 오늘날 재배 식물 품종은 곡립만 크고 많이 수확할 수 있도록 계속적으로 품종을 개량하여 신품종 식물을 보급해 왔기 때문에 이로 인한 단위당 수량은 대단히 많아진 반면, 각종 병충해에 대한 저항성은 일반적으로 감소하였다. 한편, 야생 벼에는 도열병과 같은 곰팡이병 저항성과 벼멸구와 같은 충해 저항성 유전자가 다수 존재하는 것으로 알려져 있어 재배 벼로 유용 유전자를 도입할 수 있는 중요한 유전자원의 보고라 할 수 있다. 따라서 야생 벼에서 벼의 생장과 질병 내성 등의 특수한 기능을 담당하는 유전자를 발굴하여 이를 재배 벼에 도입하는 것은 더 많은 생산량 증가뿐만 아니라 식물체의 성장과 발육에도 유리할 것이다.

류신 풍부-반복 수용체-유사 키나제 (leucine rich-repeat receptor-like kinases (LRR-RLKs))의 서브패밀리 중 하나인 체세포 배형성 수용체 키나제(Somatic Embryogenesis Receptor Kinase; SERK) 단백질은 체세포 배형성 및 자연적인 배형성의 인위적인 자극에 관여한다. 애기장대(Arabidopsis ) SERK 단백질은 다섯 개의 유사체(AtSERK1 -5)로 구성되는 유전자군에 의해 코드화되고, 체세포 배형성에 있어서 중요한 역할을 할뿐만 아니라 식물 발달에 있어서의 다면발현성 역할 때문에 중요하다. BAK1은, 체세포 배형성과 독립적인 원형질막에 국소적으로 존재하는 brassinosteoroid (BR) 수용체의 일부인 BRI1의 co-receptor로 확인되었기 때문에 많은 주목을 받고 있다. 식물의 스테로이드 호르몬인 brassinosteoroid (BR)은 주로 발아, 광형태형성 반응(photomorphogenesis reaction), 세포 신장, 물관 분화, 및 수술생식력을 포함하는 세포의 길이 생장과 줄기의 성장에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

SERK 단백질들은 식물 선천면역 및 노화에 있어서 역할을 하는 것으로 보고되었다. PAMP(Pathogen Associated Molecular Pattern)는 병원균이 가지고 있는 특이한 펩타이드나 글루코오스를 인식하여 이를 통해 병저항성을 유도하는 반응이다. BAK1은 다른 LPR-RLK인 flagellin을 인식하는 수용체인 FLS2와 복합체를 형성하여, PAMP triggered immunity (PTI)를 개시시킬 수 있다. 다양한 세트의 유전자들이 BAK1-매개 BR 시그널링 및 선천면역에 관여하는 것으로 보이고, brassinolide (BL)에 의해서 유도되는 유전자들은 감염에 의해서 유도되는 유전자들과 중복되지 않는다.

BAK1과 같은 단일의 유전자의 조작에 의해서 생산성이 높고 질병에 대해 향상된 내성을 갖는 식물이 결과 될 수 있기 때문에, BAK1의 다면발현성 기능은 유전자 조작의 가능성을 열어준다. BAK1에 대한 대부분의 연구들은 애기장대에서 이루어져왔고, AtBAK1의 이종상동성 유전자를 포함하는 SERK 유전자에 대한 연구들은 단자엽 식물로 확대되고 있다. 벼에서의 SERK 유전자인, OsSERK1 , OsSERK2 , OsSERK3 및 OsSERK4는 BAK1/AtSERK3와 상동성인 것으로 밝혀졌고, OsSERK1은 벼에서의 애기장대 BAK1 / AtSERK3 이종상동성 유전자인 것으로 추정되지만, 계통발생 분석결과에 의하면 OsSERK1 / OsBAK1는 BAK1 / AtSERK3의 이종상동성 유전자가 아니고 AtSERK1의 이종상동성 유전자로 확인되며, 최근의 서열 분석 결과에 의하면 벼에는 SERK -유사 (SERL) 유전자들이 9개나 더 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한 벼에서 OsSERK들 및 OsSERL들의 키나제 도메인과 매우 유사한 키나제 도메인만을 코드화하는 부분 cDNA들이 매우 많기 때문에, 아직까지 OsSERK 유전자의 기능은 밝혀지지 않고 있다.

따라서 본 발명의 목적은 벼 생장 및 잎 발달에 관여하는 벼 유래의 체세포적 배형성 수용체 키나제(Somatic Embryogenesis Receptor Kinase; SERK) 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 플라즈미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 플라즈미드로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물의 성장 억제 또는 병 저항성이 강화된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 벼 유래의 OsSERK1 유전자 및 그 염기서열이 제공된다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 벼 유래의 OsSERK1 유전자를 포함하는 식물 발현 플라즈미드가 제공된다.

본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 식물 발현 플라즈미드를 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 벼 유래의 OsSERK1 유전자를 포함하는 발현 플라즈미드로 형질전환된 형질전환체(transformants) 및 유전자조작된 벼(transgenic rice)가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면 형질전환 벼 식물의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 벼 유래의 OsSERK1 유전자는 벼의 생장, 잎의 발달 및 병원균에 대한 감수성에 매우 중요하게 관여하고 있기 때문에, 벼의 생장과 발달 기작을 밝히고, 생산성 및 질병 내성이 향상된 벼 식물의 개발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1a는 벼 및 애기장대에서의 SERK 단백질의 계통발생 분석 결과를 도시한 것이고, 도 1b는 OsSERK1/OsBAK1에 대한 RNA 간섭 OsSERK에 의해서 코드화되는 부분 키나제 도메인의 염기서열을 나타내고, 도 1c는 아미노산 서열을 도시한 것이며, 도 1d는 몇 개의 독립적인 형질전환 식물주에서의 OsBAK1RNAi에 의한 OsBAK1의 감소된 발현을 보여주는 RT-PCR 분석 결과이고, 도 1e는 OsBAK1RNAi #5 및 OsBAK1RNAi #11 형질전환 벼 식물에서의 ORK1의 감소된 발현을 보여주는 RT-PCR 분석 결과이다.
도 1f는 본 발명의 OsSERK1 / OsBAK1 RNAi 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 바이너리 벡터의 유전자 지도를 나타내는 모식도이다.
도 2a-l은 본 발명의 OsBAK1RNAi 구조체를 발현하는 형질전환 식물의 형태 분석 결과로서, 도 2a는 온실에서 6주간 성장시킨 형질전환식물의 전체 형태 사진이고, 도 2b는 4주 및 6주 성장 시점에서 측정된 키를 나타낸 그래프이고, 도 2c는 4주간 성장시킨 후에 측정된 잎의 길이와 폭을 나타낸 그래프이다.
도 2d 내지 도 2l은 OSBAK1RNAi #5 식물에서 관찰된 비정상적인 잎의 사진이다.
도 3a-b는 OsBAK1RNAi 형질전환 식물의 BL 반응성을 나타낸 것으로, 도 3A는 각각의 형질전환식물의 라미나 조인트에 표시된 양의 BL을 적용하는 라미나 조인트 분석 결과를 보여주는 사진이고, 도 3b는 상기 라미나 조인트 분석 결과를 정량하여 그래프로 도시한 것이다.
도 4a는 4주간 성장시킨 OsBAK1RNAi #5 식물(우측) 및 대조군 식물(좌측)의 잎의 표면의 사진으로, 아래에 일부를 확대하여 도시하였다.
도 4b는 5주간 성장시킨 OsBAK1RNAi #5 식물(우측) 및 야생형 식물(좌측)의 잎의 내부의 현미경 관찰 결과이다.
도 5a-c는 OsBAK1RNAi #5 식물들의 바이오틱 스트레스(biotic stress)에 대한 높은 감수성을 보여 주는 것으로, 도 5a는 2주간 성장시킨 후의 좌측의 대조군 식물에 비해서 우측의 OsBAK1RNAi #5의 잎의 외양이 많이 상한 것을 보여 주는 사진이고, 도 5b는 OsBAK1RNAi 형질전환주에서 PR -1a의 발현이 증가된 것을 보여주는 RT-PCR 분석결과를 나타내며, 도 5c는 7주 성장시킨 이후의 좌측의 야생형 식물과 비교하여 벼 도열병균 (Magnaporthe oryzae)에 의해 감염된 OsBAK1RNAi #5 식물주의 사진으로, 아래에 확대된 사진을 함께 나타내었다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 간략화하거나 생략하기로 한다.

본원에서 용어 " 유전자" 는 암호화 서열 및 연관된 조절 서열을 의미한다. 암호화 서열은 특정 유전자에 따라 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA일 수 있는 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예로는 프로모터 서열, 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열이 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 벼 유래의 생장 및 질병 내성 관련 OsSERK1 유전자를 제공한다. 본 발명의 OsSERK1 유전자는 벼에서 전혀 기능이 불분명하고, 식물 생육 관련 기작에 대해서도 알려져 있지 않다. 따라서 벼에서 우량 종자 또는 품종의 개발을 위해 OsSERK1 유전자를 이용할 수 있다. 이러한 유전자는 벼의 생육 및 발달에 관여하여 식물체 전반의 생장에 관여하는 유전자이다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명에서 “유도체”라는 용어는, 이러한 분자의 염기 서열이 본 발명의 유전자의 염기서열과 1개 또는 복수의 위치에 있어 상이하고, 상기 유전자와 고도의 상동성을 나타내는 것을 의미한다. 상동성이란 뉴클레오티드 레벨로 90% 이상, 특히 93% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 의미한다. 바람직하게는 상동성의 정도는, 서열번호 1의 코드 영역의 뉴클레오티드 배열과 각각의 서열을 비교하는 것에 의해서 결정된다. 소위 유도체의 서열을 본 발명의 상기 유전자와 비교할 경우에 나타나는 변화는 예를 들어, 부가, 결실, 치환, 삽입 등이 있다. 이러한 서열번호 1의 유전자 변이체들의 염기서열을 도 1b에 나타내었고, 이러한 유전자에 의해 코드화되는 SERK 단백질의 아미노산 서열을 도 1c에 나타내었다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 벼 유래의 OsSERK 유전자를 포함하는 식물 발현 플라즈미드를 제공한다. 본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 식물 발현 플라즈미드를 얻을 수 있다.

본원에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 의미하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다.

본원에서 용어 "발현 플라즈미드"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 벼 유래의 OsSERK1 유전자를 포함하는 발현플라즈미드로 형질전환된 형질전환체(transformants)를 제공한다. 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 식물 체내로의 형질전환, 세포배양 및 구입의 용이성 등의 측면에서 특히 아그로박테리움(Agrobacterium)이 바람직하다. 여기서, "형질전환체"란 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조체에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.

본 발명자들은 본 발명의 유전자를 포함하는 발현플라즈미드 pSB505 - OsBAK1RNAi을 제작한 후, 이를 아그로박테리움에 형질전환시켜 안정적인 아그로박테리움 형질전환체를 확립하였다.

또한, 상기 아그로박테리움 형질전환체인 pSB505 - OsBAK1RNAi를 벼 등의 식물세포에 형질전환시켜 안정적인 형질전환 벼(transgenic rice)를 확립할 수 있다. 본 발명의 OsBAK1를 포함하는 다수의 OsSERK 유전자들을 발현하는 형질전환 식물들에서는 OsBAK1의 농도는 감소되고 BL에 대한 감수성이 저하되어, 전체 성장에 있어 왜소증이 나타나고, 비정상적인 성장 패턴을 보이는데 특히 잎의 발달에 있어서 그러하다. 대부분의 OsBAK1RNAi 형질전환 벼 식물은 잎 표피층 내의 기동세포의 발달에 장애가 발생하고, 병발생 관련 유전자의 농도가 증가되고 벼 도열병균 Magnaporthe oryzae에 대한 감수성이 향상된다. 이러한 사항으로 보아, OsBAK1와 같은 OsSERK 유전자들은 벼의 생장과 발달에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면, 벼 유래의 OsSERK 유전자를 대량 제공함으로써 벼의 개량 종자 및 품종을 개발하기 위한 유전 자원을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 OsSERK1 유전자에 의해서 형질전환된 벼 식물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서는 먼저 본 발명의 OsSERK1를 포함하는 식물 발현 벡터로 벼(Oryza sativa L.) 식물 세포를 형질전환하고, 이어서 상기 형질전환된 벼 식물 세포로부터 형질전환 벼 식물을 재분화하여 형질전환 벼 식물을 제조할 수 있다.

본 발명의 OsSERK1를 포함하는 식물 발현 벡터로 벼 세포를 형질전환하는 단계는 구체적으로 다음의 세 과정으로 진행될 수 있다.

(1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 구성되는 OsSERK1 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

(2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

(3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.

상기 발현 플라즈미드를 제조하는 단계 1)에 있어서, 벼에서 특이적으로 발현되는 유전자 풀을 얻기 위하여, cDNA 라이브러리(cDNA library)를 제작한 후, ESTs 분석을 실시하고, 이를 통하여 벼 유래 OsSERK 유전자의 부분 단편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이러한 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장 하므로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 식물 발현벡터인 pSB505에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pSB505 -OsBAK1RNAi을 제작할 수 있다.

상기 발현 플라즈미드를 상기 숙주세포에 도입하는 형질전환 방법으로는 아그로박테리움과 같은 생물 운반체를 이용하여 DNA를 도입하는 방법, DNA 함유 미세입자를 고압 분사하는 방법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 미세주사법(microinjection) 등이 알려져 있지만(Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4:226-231), 최근 가장 일반적으로 활용되고 있는 식물 형질전환 방법은 식물 병원균인 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 운반체로 이용하는 것이다. 이들 세균은 그들의 Ti(tumor-inducing) 또는 Ri(root-inducing) 플라스미드 DNA중 일부인 T-DNA를 감염된 식물 세포내로 전이시키는 능력을 갖고 있다. 따라서, 목적 유전자를 T-DNA내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동배양하면 식물세포의 형질전환이 가능해진다(Binns et al., 1988, Ann Rev Microbiol., 42: 575-606).

또한, 상기 단계 2)에 있어서, 얻어진 pSB505 - OsBAK1RNAi을 식물에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 진공을 이용한 형질전환법(Vacuum infiltration method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 등이 있으며, 화아 침지법(Floral meristem dipping method)이 가장 바람직하다. 이와 같은 형질전환 기술은 조직배양을 거치지 않고 식물이 생장하는 상태 그대로 생장점 부위에 위치하는 세포들을 형질전환시킨후, 형질전환된 세포로부터 재분화하는 줄기에서 형질전환된 종자를 획득하여, 유전적으로 안정된 형질전환 식물체를 획득할 수 있는 기술이다.

상기 발현 플라즈미드가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 3)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 항생제 저항성을 이용하여 선별할 수 있는 데, 일례로 선별마커로서 포스피노피로신 내성 유전자를 포함하는 상기 발현벡터 pSB505가 도입된 숙주 세포만이 포스피노트리신 첨가 배지에서 생존함을 이용하여 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 유전자 또는 식물 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 이러한 세포는 바람직하게는 식물 세포이지만, 세균 세포와 같은 원핵세포이어도 좋고, 또는 진핵세포이어도 좋다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기의 식물 세포를 포함하는 유전자 조작 식물에 관한 것으로, 당업자에게 알려진 기존의 방법을 이용하여 유전자 조작 식물세포(transgenic plant cell)를 식물체 전체로 재생시켜 제조될 수 있다.

이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

식물 재료 및 성장 조건( Plant materials and growth conditions )

벼 종자들 (Oryza sativa , japonica cv. Nakdong)을 모든 유전자를 형질전환하는데 이용하였다. 형질전환 벼 식물을 포스피노트리신 선별 조건의 유무 하에서 28℃/25℃ 및 80% 상대습도의 조건 하에서 16 h/8 h (L/D) 광주기로 설정된 성장 쳄버 내에서 Murashige 및 Skoog (Duchefa) 아가 배지에 의해서 사각 용기 내에서 성장시켰다. 이어서 15일 성장된 식물들을 벼 논 토양이 담긴 큰 용기로 옮겨 동일한 조건과 햇빛하에서 성장시켰다.

플라스미드 제조 및 벼의 형질전환

OsBAK1RNAi 구조체를 제조하기 위해서, OsSERK1의 키나제 도메인을 코드화하는 250 염기쌍의 유전자 단편을 RNA 간섭 카세트 pHannibal에 맞추기 위해서 RBAK1CF / RBAK1BR 및 RBAK1KF / RBAK1XR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭시켰다. 그 결과로 얻어진 증폭된 서열번호 1의 250-bp 영역은 OsSERK1 및 OsSERK2의 대응하는 영역과 동일하였다 (도 1B). 다른 세 개의 유전자들 OsBISERK1 , Os08g0176200 , 및 ORK1는 OsSERK1 및 OsSERK2의 대응하는 영역에 대해서 각각 99%, 93%, 및 93%의 상동성을 보였다 (도 1C).

프라이머를 디자인 함에 있어서, 이후 pSB505 바이너리 벡터 내로 클로닝하기 위해서 RBAK1BR 및 RBAK1XR에 각각 NotI and XmaI를 부가하였고, 그 결과로 수득된 플라스미드, pHannibal - OsBAK1RNAi를 NotI and XmaI로 절단하여 pSB505 바이너리 벡터에 연결하여 pSB505 - OsBAK1RNAi를 제작하였다. PCR에 의해 생성된 모든 분획들을 시퀀싱하여 확인하였다.

도 1f에 도시된 바와 같이, 증폭된 서열번호 1의 250-bp 영역을 inverted 위치로 pSB505 바이너리 벡터 내에 삽입하여 pSB505-OSBAK1RNAi를 제작하여 벼에 형질전환시켰다. pSB505 벡터 플라스미드만을 포함하는 모든 구조체들을 Hiei 등(1994)에 의해 기술된 방법에 따라서 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해서 야생형 벼(Oryza sativa, japonica cv. Nakdong)에 주입하였다.

RT - PCR 분석에 의한 발현

형질전환된 벼의 냉동 조직에 추출 버퍼(0.2 M Tris-Cl, pH 9.0, 0.4 M LiCl, 25 mM EDTA, 1% SDS) 및 아쿠아 페놀(Q-biogene)를 처리하여 RNA를 정제한 후, RNase-free RQ1 DNase (Promega)로 처리하였다. 제1가닥-cDNA 합성을 프라이머로서 oligo d(T₁₅)를 이용하여 SuperscriptⅢ-MMLV 역전사 효소 (Invitrogen)로 수행하였다. 이어서 동일한 분취량의 제1가닥 cDNA를 Real Taq polymerase (RBC)를 이용한 2차 PCR을 위한 주형으로 이용하였다.

본 발명의 OsSERK1 유전자를 벼 (Oryza sativa , japonica cv. Nakdong) 세포에 형질전환시킨 후, TO 세대에서 43개의 형질전환체를 수득하였다. T0 세대에서 조차 영양생식 및 생식생장기 모두에서 비정상적인 성장 패턴을 나타내었다. 몇 종류의 T1 세대의 형질전환된 식물의 RNA를 가지고 RT-PCR 분석을 행하였다. OsBAK1RNAi #11에서의 OsBAK1 발현농도는 empty vector plasmid를 포함하는 대조군 식물과 유사하였으나, OsBAK1RNAi #5, #7, and #14 식물들의 OsBAK1 발현농도는 급격하게 감소하였다(도 1D 참조). 형질전환된 벼(transgenic rice plant)에서는 ORK1의 발현이 억제되었다(도 1E 참조).

라미나 조인트 분석( lamina joint assay )

물에 불린 벼 종자를 1/2 MS 배지 (100 mg/L myo-inositol, 125 mg/L cefotaxime, 0.6% agar, pH 5.6)를 포함하는 플레이트에 파종하고나서, 6일간 배양하였다. 이어서 0, 1, 10, 또는 100 ng의 BL을 포함하는 1 ㎕의 70% 에탄올을 두 번째 잎의 라미나 조인트에 적용하였다. 3일간 인큐베이션한 후, 엽신(leaf blade)과 엽초(leaf sheath) 사이의 굽은 각도를 측정하여 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

OsBAK1RNAi #11 식물은 BL 농도를 높일 때, 대조군 식물들에 비해서 약간 적은 라미나 편향 각도를 나타낸 반면에, OsBAK1RNAi #5 식물의 경우에는 높은 농도의 BL에서도 각도에 거의 변화가 나타나지 않았는데, 이것은 이들 식물들이 BL에 대해서 극히 낮은 감수성을 갖는다는 것을 시사한다. 이러한 결과를 종합해 보면, OsBAK1 의 발현이 감소되면 부적절한 잎의 발생, 식물 전생활주기 동안의 성장 억제 및 BL 불감성을 포함하는 표현형 변화를 초래한다는 것을 확인할 수 있다.

벼 도열병균 처리 실험( Treatment of rice blast fungus )

본 실시예에서 수득된 형질전환된 벼에 Fungal Genetic Resources 센터로부터 수득한 벼 도열병균( Magnaporthe oryzae ) 균주 KJ201을 접종하였다((Park et al., 2009).

분생자(Conidia)를 25℃의 일정한 형광 조건 하에서 7일간 V8 아가 배지 (V8 80 ml/L, agar 15 g/L, pH 6.5)에서 배양된 진균 배양물로부터 회수하였다. 헤모사이토미터를 이용하여 적은 분취량의 분생자 현탁액으로부터 분생자의 수를 카운팅한 후, 농도를 4x10⁴ spores/ml로 조정하였다. 최종 분생자 현탁액을 7주간 성장시킨 형질전환 식물의 새로운 잎에 분무하였다. 감염된 식물들을 100%의 습도의 어두운 쳄버 내에서 24시간 동안 인큐베이션하고나서, 정상 조건의 성장 쳄버로 옮기고 4일 후, 잎 샘플을 분석하였다.

OsBAK1RNAi #5 형질전환식물의 잎들은 정상적인 성장 조건 하에서도 감염된 것처럼 보이는 몇 군데 괴사 반점을 포함하였다(도 5A). 한편, 형질전환된 벼의 잎들에 대해서, 벼 및 애기장대에서 병발생에 대한 방어를 위한 마커 유전자 가운데 하나로 알려진 PR -1a의 기초 발현 농도를 시험하였다. OsBAK1RNAi #5 형질전환 식물의 잎에서의 PR -1a의 발현은 현저하게 증가하였으나, OsBAK1RNAi #11 형질전환 식물의 잎들에서의 PR -1a의 발현은 야생형에서와 유사하게 나타났다(도 5B). OsBAK1RNAi #5 형질전환 벼 식물에서는 PR -1a의 농도가 증가되었고, M. oryzae KJ201에 의한 감염에 대하여 증가된 감수성을 나타내었다(도 5C).

시험관 내에서 질병 유발 병원균에 대한 벼의 방어 능력을 조사하기 위해, OsBAK1RNAi #5 형질전환 벼 및 대조균 벼에 도열병균인 Magnaporthe oryzae의 분생자 현탁액을 분무하였다. 감염후 5일이 경과한 후에, 대조군 식물들에 비해서 OsBAK1RNAi #5 식물의 잎들 및 줄기 전체에 벼 도열병이 심각하게 확산된 것을 발견하였다. 이것은 OsBAK1 가 식물의 면역에 영향을 미친다는 것을 시사하고, 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 감소된 OsBAK1 발현이 벼에 있어서의 biotic stress는 물론 잎 발달에 있어서의 장애에 대한 감수성을 증가시키는 것을 알 수 있다.

현미경 관찰

입체현미경(Leica MZ 12.5) 및 Image Manager 5.0 소프트웨어를 이용하여 형질전환식물의 잎의 표면 및 내부구조를 관찰하였다.

식물 성장에 편차는 있지만, 대부분의 OsBAK1RNAi #11 식물은 전체 키 및 잎의 길이를 포함하는 몇 가지 기준에서 감소를 보이지 않았다(도 2A-C). 그러나 OsBAK1RNAi #5 식물은 약하거나 심한 광범위한 성장 장애를 보였다(도 2A). 영양생장기에도 OsBAK1RNAi #5 형질전환 식물은 본 발명의 유전자를 삽입하지 않은 벡터(empty vector)를 포함하는 대조군 식물들(EV) 보다 키가 작고 절간(internodes)이 적었다. 잎의 길이는 OsBAK1RNAi #5 형질전환 식물에서 확연하게 감소되었다. 그러나 OsBAK1RNAi #5 잎의 폭은 대조군 식물에 비해서 현저한 감소가 나타나지 않았지만, OsBAK1RNAi #11 식물 보다는 넓었다 (도 2C). 또한 본 실험에서는 OsBAK1RNAi #5 식물주에서 성장 초기 단계에서 잎이 굽는 현상(도 2D, L)을 포함하는 몇 가지 비정상적인 표현형이 나타나는 것이 관찰되었다. 다른 대부분의 OsBAK1RNAi #5 식물은 마르고 비틀리거나 (도 2E, F), 잎들이 쉽게 구부러졌다 (도 2H). 때로는 전체 잎의 엽신(blade)의 일부분이 벌어져서 잎의 측면 에지가 마주치거나 융합되었다 (도 2G, I). 또한 줄기에서도 꼬인 것 같은 덩어리가 관찰되었는데, 이는 새로운 잎 발달이 이루어지지 못했다는 것을 가리킨다 (도 2J, K). 이러한 잎에 있어서의 외관 상의 비정상적인 표현형들은 OsBAK1RNAi #5 식물에만 국한된 것은 아니다. OsBAK1RNAi #5 식물과 정도의 차이는 있지만, OsBAK1RNAi #11 식물의 많은 잎들도 마르고 비틀리거나 모양이 쉽게 구부러지는 현상을 보였다.

비정삭적인 외관을 나타내는 OsBAK1RNAi #5 잎의 표면을 입체현미경으로 관찰해 본 결과, 잎의 색이 연녹색이었고, 마르고 누런 부분과 대조군 잎의 표면에서는 관찰되지 않는 괴사 반점이 관찰되었다 (도 4A). 야생형 잎 및 OsBAK1RNAi #5 식물의 잎을 잘라서 잎의 내부 구조를 조사하였다. OsBAK1RNAi # 5이 잎들은 훨씬 두꺼웠고 배측으로 확장된 더 많은 엽육세포들을 포함하였다. OsBAK1RNAi 형질전환 식물의 잎의 통기조직은 야생형에 비해서 컸고, 야생형 잎의 엽신(blade)에서는 세로맥에 측접하는 측면들은 편평한 반면에, OsBAK1RNAi #5 잎의 잎들은 완전히 개방되지 않았다. 흥미롭게도 OsBAK1RNAi #5 잎들의 향축면에는 야생형 잎과 달리 기동세포들이 없었다 (도 4B).

OsBAK1의 농도가 감소된 본 발명의 OsBAK1RNAi 형질전환 벼 식물은 brd1 -1 and brd1 -2와 같은 강한 BR-생합성 돌연변이체에 비해서 중간 정도의 성장 지연을 보였는데, 이것은 OsSERK 유전자의 서브셋(subset)이 BR-시그널링에 의해서 매개되는 벼의 적절한 생장에 있어서 중요하다는 것을 시사한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 OsBAK1RNAi 형질전환 식물에서는 성장 저해 뿐만 아니라, 몇 가지 잎의 발달에 있어서의 문제도 초래된다(도 2E-L). 이러한 잎에 있어서의 결함은 부분적으로 도 4B에 도시된 바와 같이, 기동세포의 결여에 기인할 수도 있다. 성숙한 잎에서는 기동세포가 환경 스트레스에 대한 저항성에 기여하기 때문에, OsBAK1RNAi 형질전환 식물에서 잎이 시드는 것은 기동세포가 제대로 기능하지 못하는 것에 원인이 있을 수 있다.

또한 OsBAK1RNAi #5 형질전환 식물이 잎에서의 괴사 반점(도 5A)들은 RNA 간섭 중에 OsBAK1 및 그의 상동체들의 감소된 발현으로 인해서 PR -1a 발현의 기초 발현 농도가 높아진데 기인하는 것일 수 있다(도 5B).

이상에서 본 발명을 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 정신이나 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변경될 수 있다는 것을 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자는 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 보호범위는 후술하는 특허청구범위 및 그와 균등한 범위에 의해서 정해져야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 250 bp 크기의 OsSERK1 유전자 서브셋이 pSB505 바이너리 벡터에 인버티드 위치로 클로닝되어 있는 재조합 식물 발현 플라즈미드.
   
4. 제 3항에 따른 재조합 식물 발현 플라즈미드로 형질전환된 벼(Oryza sativa L.) 식물.
   
5. 제3항의 식물 발현 플라즈미드에 의해서 유전자 조작된 숙주세포(transgenic host cell).
   
6. 제5항에 따른 숙주 세포를 포함하는 유전자 조작된 벼 식물.
   
7. (1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 OsSERK1 DNA 서열을 pSB505 바이너리 벡터에 인버티드 위치로 연결하여 발현벡터를 제조하는 단계;
   (2) 벼 숙주세포(Oryza sativa L.)에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;
   (3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환된 벼 세포를 선별하는 단계; 및
   (4) 상기 형질전환된 벼 세포로부터 형질전환 벼 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 향상된 형질전환 벼 식물의 제조 방법.
   

Images