KR100861717B1 - ＡｔＣＰＬ５유전자와 ＡｔＣＰＬ５유전자가 과발현되는형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AtCPL5 유전자와 AtCPL5 유전자가 과발현되는 형질전환 식물체에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 전사과정의 종료단계에서 RNAP II CTD의 Ser-2 position을 탈인산화 시킴으로서 식물체가 외부환경의 스트레스를 받았을 때 RNAP II 가 스트레스 반응 유전자들의 프로모터 부위에 공급되는 것을 촉진함으로써 이런 유전자들의 mRNA 발현양을 조절하여 식물이 다양한 환경스트레스에 적응할 수 있게 작용할 것으로 추정되는 AtCPL5 유전자와 이 유전자가 과발현됨으로써 식물호르몬인 ABA나 비생물학적 스트레스인 NaCl 및 가뭄 스트레스에 내성을 갖는 AtCPL5 형질전환 식물체에 관한 것이다.

RNAP II CTD, positive 조절자, ABA 신호전달, Ser-2 특이적 phosphatase

Description

ＡｔＣＰＬ５유전자와 ＡｔＣＰＬ５유전자가 과발현되는 형질전환 식물체{AtCPL5 gene and AtCPL5 overexpression transgenic plants}

도1은 At3g19600 유전자의 구조와 At3g19600 유전자와 애기장대의 CPD를 포함하는 다른 단백질간의 계통수, 유연관계가 가장 가까운 단백질간의 아미노산 서열 유사성을 나타내는 그림이고,

도2는 다양한 스트레스 조건하에서 AtCPL5의 mRNA 발현 패턴을 나타내는 그림이고,

도3은 P_{AtCPL5 -745}::GUS 형질전환 식물체의 조직화학적 GUS염색을 나타내는 그림이고,

도4은 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체의 게놈상에서의 T-DNA 삽입위치와 단일카피가 삽입된 35S:: AtCPL5 과발현 식물체임을 확인하는 그림이고,

도5은 유묘시기의 gabi -4, 야생형, OE #5 과 OE #2가 ABA처리 하에서의 표현형의 변화를 나타내는 그림이고,

도6은 gabi -4, 야생형, OE #5 과 OE #2의 가뭄 스트레스 처리하에서의 표현형을 나타내는 그림이고,

도7은 AtCPL5 유전자의 조절을 받는 하위단계의 몇 개의 스트레스 반응 유전자들의 mRNA 발현패턴을 나타내는 그림이고,

도8은 재조합 His₆-AtCPL5 단백질의 Ser-2 특이적인 RNAPII CTD phosphatase activity를 나타내는 그림이다.

본 발명은 AtCPL5 유전자와 AtCPL5 유전자가 과발현되는 형질전환 식물체에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 전사과정의 종료단계에서 RNAP II CTD 의 Ser-2 position 을 탈인산화 시킴으로서 식물체가 외부환경의 스트레스를 받았을 때 RNAP II 가 스트레스 반응 유전자들의 프로모터 부위에 공급되는 것을 촉진함으로써 이런 유전자들의 mRNA 발현양을 조절하여 식물이 다양한 환경스트레스에 적응할 수 있게 작용할 것으로 추정되는 AtCPL5 유전자와 이 유전자가 과발현됨으로써 식물호르몬인 ABA에 과민반응을 보이고 비생물학적 스트레스인 가뭄 스트레스에 내성을 갖는 AtCPL5 형질전환 식물체에 관한 것이다.

환경은 식물의 성장과 발달에서 가장 중요하다. 다른 생물적 혹은 비생물적 스트레스는 각 성장 단계를 통하여 농작물의 발달에 영향을 미치는데, 더욱이 농작물의 생산성을 떨어뜨릴 수 있다. 진화된 식물은 한파, 가뭄, 염 스트레스와 같은 다양한 환경 조건에 알맞게 견디기 위한 적절한 전략을 가지고 있다 (Xiong, L. et al. (2001) Genes Dev . 15, 1971-1984). 환경 스트레스에 반응하는 식물의 발달 프로그램에서 가장 중요한 조절자는 식물 호르몬인 abscisic acid (ABA) 이다(Xiong, L. et al. (2001) Genes Dev . 15, 1971-1984). ABA는 식물 성장과 발달에서 가장 중요한 배발생, 씨앗 형성, 휴면, 뿌리와 어린 싹의 성장, 증산작용 뿐만 아니라 다양한 환경 스트레스에 내성을 갖게 하는 많은 기능을 가지고 있다 (Xiong, L. et al. (2001) Developmental Cell, 1, 771-781). 가뭄 스트레스 동안에, 증가된 ABA 생합성은 공변세포에서 기공을 닫게 하여 수분의 손실을 막는다 (Merlot, S. et al. (2001) Plant J. 25, 295-303.; Xiong, L. et al. (2006) Plant Physiol . 142, 1065-1074; Yamaguchi-Shinozaki, K. et al. (2006) Annu . Rev . Plant Biol . 57, 781-803).

지금까지 ABA와 가뭄에 반응하는 많은 유전자가 밝혀졌다. 이러한 유전자들에는 CRT/DRE 계열의 스트레스 반응 유전자들인 RD29A / COR78 / LTI78와 COR47 / RD17, ABRE binding factor 인 AREB1 / ABF2, AREB2/ABF4와 ABF3, Ca^{2 +} binding protein인 RD20, MYC 과 MYB 전사인자 binding 단백질인 RD22, NAC 단백질인 RD26, LEA 계열 단백질인 RD29B 와 RAB18, protein phosphatase 2C 단백질인 ABI1 과 ABI2, protein kinase들인 SnRK2 와 OsRK1 등이 있다 (Abe, H. et al. (1997) Plant Cell, 9, 1859-1868; Boudsocq, M. et al. (2004) J. Biol . Chem . 279, 41758-41766.; Chae, M. et al. (2007) Plant Mol . Biol . 63, 151-169; Fujita, M. et al. (2004) Plant J. 39, 863-876.; Jeannette, E. et al. (1999) Plant J. 18, 13-22; Merlot, S. et al. (2001) Plant J. 25, 295-303; Takahashi, S. et al. (2000) Plant Cell Physiol . 41, 898-903; Uno, Y. et al. (2000) Pro . Natl . Acad . Sci . USA , 97, 11632-11637; Yamaguchi-Shinozaki, K. et al. (1994) Plant Cell, 6, 251-264). 스트레스 신호전달경로와 연관된 다양한 인자들이 밝혀졌지만, mRNA 대사와 연관된 단지 몇몇의 조절자만이 식물계에서 동정되었다. 최근에, 삼투압과 ABA에 민감하게 반응하는 RNA polymerase II (RNAP II) carboxyl-terminal domain (CTD) phosphatase-like genes (CPL), CPL1/FRY2, CPL2 , CPL3 , CPL4가 애기장대에서 동정되었다(Koiwa, H. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 99, 10893-10898; Koiwa, H. et al. (2004) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 14539-14544; Xiong, L. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA , 99, 10899-10904). CBF/DREB 전사인자의 상단에서 작용하는 전사 억제자를 암호화하는 FRY2 / CPL1 은 스트레스 저항성을 나타내고 종자발아시 ABA 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다 (Xiong, L. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA , 99, 10899-10904). CPL3와 CPL4는 FCP1 (TFIIF-interacting CTD phosphatase) family phosphatases에 속하며 CPL3는 삼투스트레스와 ABA 신호전달에서 조절자역할을 한다 (Bang, W. et al.(2006) Plant Physio . 142, 586-594; Hausmann, S. et al.(2002) J. Biol . Chem . 277, 21213-21220; Lin, P. S. et al.(2002) J. Biol . Chem . 277, 45949-45956). RNAP II CTD phosphatase는 효모, 곰팡이, 인간에서도 동정이 되었다. RNAP II 의 가장 큰 subunit의 CTD는 Y¹S²P³T⁴S⁵P⁶S⁷ heptapeptide 반복서열로 구성이 되었으며 이런 CTD의 가역적인 인산화 (kinases 와 CTD phosphatases에 의한)는 유전자 발현의 조절에서 중요한 역할을 수행한다 (Hirose, Y. et al. (2000) Genes Dev . 14, 1415-1429; Lin, P. S. et al. (2002) J. Biol . Chem . 277, 45949-45956).

애기장대 유래의 RNAP II CTD phosphatase 유전자는 20개 이상이 존재하고 다른 진핵생물의 같은 종류의 단백질들과 동일한 영역(domain)의 구조에 따라 세 개의 그룹으로 분류된다(Koiwa, 2006; Koiwa et al ., 2002). AtCPL1과 AtCPL2 는 RNAP II CTD phosphatase domain (CPD)과 이중가닥 RNA binding motifs (DRM)를 갖는 Group 1 CPL에 속하고, 이는 애기장대 RNAP II의 Ser-2 position이 아닌 CTD의 Ser-5를 특이적으로 탈인산화시킨다 (Koiwa, H. et al.(2004) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 14539-14544.). AtCPL3 와 AtCPL4는 CPD와 BRCT domain (BRCA1 C-말단)을 갖는 Group 2 CPL에 속하고, 시험관에서 BRCT domain을 통하여 AtRAP74 와 상호작용 한다 (Bang, W. et al. (2006) Plant Physio . 142, 586-594; Koiwa, H. et al. (2004) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 14539-14544; Yu, X. et al. (2003) Science, 302, 639-642). 단지 CPD(s)만을 가진, 인간의 SCP와 유사한 구조를 가지고 있는 유전자들은 Group3 CPL에 속하며 애기장대에서는 아직 이 그룹에 속하는 유전자들이 동정이 되지 않았다 (Zhang, Y. et al. (2006) Molecular Cell, 24, 759-770).

본 발명에서는 Group 3 CPL family에 속하는 RNAP II CTD phosphatase을 암호화하는 AtCPL5 유전자를 클로닝 하였고, 이는 애기장대에서 두 개의 CPDs를 갖는 유일한 유전자이고, DRM motif 또는 BRCT domains과 같은 추가적인 영역을 갖지 않는 것으로 분석되었다. 또한 본 발명의 AtCPL5 유전자는 ABA, NaCl, 저온 스트레스, 가뭄 스트레스에 의하여 유도되고, AtCPL5 유전자가 과발현되는 식물체는 스트레스 반응 유전자들인 RD22와 RD26을 유도하는 것으로 밝혀졌으며, RNAP II CTD phosphatase인 AtCPL5은 환경 스트레스 반응유전자들의 전사 작용 과정에서 양성 조절자로 작용하는 것으로 분석되었다. 따라서, 본 발명은 AtCPL5 유전자가 과발현되는 식물체는 식물호르몬인 ABA나 비생물학적 스트레스인 가뭄 스트레스에 내성을 가지므로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 발달 및 환경 스트레스 조절자 작용하는 애기장대 유래의 AtCPL5 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 AtCPL5 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AtCPL5 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AtCPL5 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 환경 스트레스에 내성을 갖는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물체로 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담 배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 환경 스트레스에 내성을 갖는 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명은 AtCPL5 유전자와 AtCPL5 유전자가 과발현되는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 AtCPL5 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 AtCPL5 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 AtCPL5 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부 터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 AtCPL5 유전자를 식물체에서 발현시킴으로써 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용하는 방법을 제공한다.

식물체에서 AtCPL5 유전자를 발현시키는 방법으로는 AtCPL5 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 AtCPL5 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 AtCPL5 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 식물체 내로 AtCPL5 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 AtCPL5 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 AtCPL5 유전자를 발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 식물의 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용할 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용하 는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용하는 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 AtCPL5 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　즉, AtCPL5 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 발달 및 환경 스트레스 조절자로 작용하는 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 발달 및 환경 스트레스 조절자 작용하는 애기장대 유래의 AtCPL5 단백질을 포함한다.

본 발명은 상기의 AtCPL5 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명은 AtCPL5 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 포함한다.

본 발명은 AtCPL5 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 환경 스트레스에 내성을 갖는 방법을 포함한다.

본 발명은 상기 식물체로 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

본 발명은 상기의 방법에 의해 환경 스트레스에 내성을 갖는 식물체를 포함한다.

본 발명은 상기의 방법에 의해 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체의 종자를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

1. AtCPL5 유전자 구조분석과 AtCPL5 cDNA 분리

애기장대 RNAP II CTD phophatases을 분리하기 위해, NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 이미 알려진 CTD phosphatases을 이용하여 아미노산 시퀀스를 정열하였고, NCBI의 CDART (Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)을 이용하여 보존된 영역의 구조를 분석하였다. 정열된 아미노산 시퀀스 분석결과에 따르면, 애기장대에서 CPD(s)을 포함하는 단백질은 26개가 존재하였다. 이러한 단백질 사이에서 20개의 단백질은 CPD(s)뿐만 아니라, CPD의 N-말단에 보존된 DXDX(T/V) acylphosphatase motif(s)이 있는 것으로 분석되었다. DXDX(T/V) 모티브는 phosphohydrolase activity을 갖는, 박테리아와 진핵생물체에 많은 acid phosphatases로 보존되어 있는 것으로 분석되는 phosphoryl acceptor의 중간산물이 다(Collet, J.-F. et al.(1998) J. Biol . Chem. 273, 14107-14112; Thaller, M. C. et al. (1998) Protein Science, 7, 1647-1652). 다른 6개의 단백질은 비록, CPD를 갖고 있더라도, DXDX(T/V) motif가 없어 phosphatase activity가 없을 수도 있을 것이다. CPD(s)을 포함하는 것 뿐 만 아니라 DXDX(T/V) motif(s)을 포함하는 20개의 단백질 사이에서 4개의 단백질(AtCPL1~AtCPL4) 모두는 추가적인 부분을 포함하는 반면에 다른 단백질들은 가지고 있지 않다. At3g19600은 두 개의 CPDs를 가지고 있는 유일한 유전자이다. 그러나 BRCT 또는 DRM와 같이 추가적인 영역(additional domains)이 없다. 이것은 At3g19600 유전자는 특이한 기능을 갖을 것이라는 것을 함축한다. Hisashi Koiwa (Koiwa, H. (2006) Springer Publishers, The Netherlands, pp. 47-57) 는 애기장대에서 CTD phosphatases의 폴리펩타이드의 동족체(homologous) 20개의 유전자가 밝혔고, 차이가 있는 영역을 중심으로 3개의 그룹으로 분류하였다. At3g19600 유전자는 Group III CPL family으로 분류하고 SSP7 또는 SSP8으로 명명하였다. At3g19600 유전자의 ORF(open reading frame)는 601 아미노산(GenBank: NM_112850; predicted MW 69 kDa; pI 7)의 폴리펩타이드로 구성되고, 두 개의 CPDs (CPD1, 113~243aa; CPD2, 410~538 aa), 핵 타겟팅 신호 (NLS; KRRK, 308~311aa,), 두 개의 DXDX(T/V) acylphosphatase motifs (motif 1, 94~98aa; motif 2, 391~395aa)가 CPD의 아미노-말단 부분에 각각 존재한다(도1a). CPDs를 포함한 25개의 단백질과 AtCPL5를 코딩하는 CPD 부위의 계통발생 분석(Phylogenetic analysis)은 CLUSTAL W (1.81) in Biology WorkBench 3.2 (http://workbench.sdsc/edu)으로 수행하였고, AtCPL5가 the Group III CPL family 에 속하는 것을 확인하였다(도1b). 아미노산 시퀀스 정열은 At3g19600의 두개의 CPDs(CPD1와 CPD2)가 서로 높은 아미노산 상동성(64%)을 갖는 것을 보여주고, 각각은 At2g04930 (SSP10)와 58~71% identity을 갖고, At3g17550 (SSP9)은 57~67% identity을 갖는 것을 보여준다 (도1c).

At3g19600 cDNA를 클로닝하기 위하여 두 단계의 RT-PCR을 수행하였다. Full-length cDNA는 2주된 식물체에서 추출한 1㎍의 total RNA로 증폭하였다. 클로닝한 cDNA는 Genbank의 full-length At3g19600 cDNA와 일치하였고, AtCPL5 ( A rabidopsis t haliana C-terminal domain phosphatase like 5)로 명명하였다.

2. 피토호르몬과 생물학적 스트레스에 반응한 AtCPL5 전사체의 발현 분석

AtCPL5 유전자의 발현이 환경 스트레스에 의해 조절 받는지 조사하기 위하여, 2주된 애기장대의 식물체를 가지고 ABA, GA, SA와 JA와 같은 여러 피토호르몬과 삼투스트레스, 가뭄, 냉해와 같은 생물학 및 비생물적인 스트레스를 모방한 조건에서 조사하였다. ABA, NaCl, 가뭄 스트레스 및 저온스트레스에 의해 AtCPL5 전사체의 발현이 유도되는 것을 RT-PCR 분석으로 조사하였다 (도2). AtCPL5 전사체 발현은 0.1 mM ABA 처리 6시간 이후에, 300 mM NaCl 처리 3시간 이후에, 가뭄 스트레스 처리 30분 후에, 저온 스트레스 처리후 3시간 이후에 유도되었다. 그러나 mock (대조구), mannitol 처리 (도2) 및 다른 스트레스 처리에서는 유도되지 않았다 (data not shown). 이러한 AtCPL5 mRNA 발현의 정도는 매우 낮고, 37사이클을 러닝한 RT-PCR에 의해서만 검출되었다.

3. 조직화학적 GUS 염색을 통한 AtCPL5발현 패턴 분석

AtCPL5 프로모터의 조직특이적인 발현패턴을 조사하기 위해, AtCPL5 프로모터의 조절하에 GUS protein의 발현을 P_AtCPL5::GUS 형질전환 식물체에서 조사하였다. AtCPL5 개시코돈의 상단(upstream)의 745 bps와 3955 bps의 두 개의 프로모터 영역에서 GUS 발현을 각각 조사하였다. 형질전환 식물체의 두 개의 프로모터 영역, P_{AtCPL5 -745}::GUS와 P_{AtCPL5 -3955}::GUS 에서의 발현패턴은 유사하였고, 본 발명에서는 단지P_{AtCPL5 -745}::GUS 형질전환 식물체만을 보여준다(도3). 조직 화학적 GUS 염색 후에, GUS 활성은 1일 동안 발아시킨 어린 씨앗의 껍질 표면과 3일된 어린 씨앗의 배축에서 검출되었다. 2주된 씨앗에서, GUS 단백질은 뿌리, 배축, 로제트 잎과 코틸레돈에서 관찰되었다. 뿌리에서는 GUS 단백질은 수염뿌리보다 원뿌리에서 더 짙게 염색되었다. 로제트 잎에서, GUS 단백질은 주엽맥의 관다발에서 짙게 염색이 됨이 관찰되었고, 특이하게도 잎의 돌기 꼴 구조(trichomes)와 공변세포(guard cells)에서 진하게 염색되였다. 성숙한 식물체에서, GUS 단백질은 꽃, 줄기, 장각과의 주병(funiculuses of siliques), 수술(stamens) 및 암술(carpels)에서 검출되었다. 게다가, GUS는 줄기 잎(cauline leaves)에서 약하게 염색되었다. GUS단백질은 식물체의 거의 모든 기관에서 모두 발현이 되었고, 특히 잎의 돌기 꼴 구조(trichomes) 와 공변세포(guard cells)에서 많이 축적되었다. 본 발명자는 AtCPL5 유전자가 식물이 외부환경의 스트레스에 적응하는기작에 관여할것이라고 추측할 수 있었다. 게다가, 다양한 스트레스 처리후 7일된 P_{AtCPL5 -745}::GUS 형질전환 식물체에서 GUS 단백질의 발현 패턴을 조사하였다. H₂O 처리(대조구)와 비교하여 ABA을 처리한 로제트 잎에서 GUS 활성은 두드러지게 증가하는 반면(도3), NaCl, 가뭄 및 다른 스트레스 처리에서는 변화가 없다(data not shown). 이러한 결과는 AtCPL5 전사체가 ABA 처리 하에서 유도되는 것과 일치하였다(도2).

4. T-DNA 삽입 돌연변이 식물체와 과발현 식물체의 특징

AtCPL5 유전자의 분자적 기능을 밝히기 위하여, T-DNA 삽입 돌연변이 식물체와 35S:: AtCPL5 과발현 식물체를 준비하였다. T-DNA 삽입 돌연변이체 532E08 (GABI-Kat, Germany)은 T-DNA (pAC161 벡터)가 AtCPL5의 첫 번째 액손의 개시코돈으로부터 275bp 하단(down stream)에 삽입되였다(도4a). 하나의 동족 돌연변이체(homozygous mutant)는 세 개의 프라이머, 두 개의 유전자 특이 프라이머 및 T-DNA 특이 프라이머를 이용하여 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 선별하였다(도4a). 도4b에서 보여주는 바와 같이 같은 PCR 반응 튜브에서 세 개의 프라이머를 가지고 PCR을 수행한 결과, 동족 돌연변이체 gabi -4(homozygous mutant gabi -4)은 T-DNA left border 프라이머와 유전자 특이 역방향 프라이머에 의한 예상 크기 인 PCR 밴드(~480 bp)을 나타내었다(data not shown). AtCPL5 mRNA가 동족 돌연변이체 gabi -4에서 존재하지 않는 것을 RT-PCR 결과로 확인하였다(도4c). 이어서, CaMV 35S 프로모터 조절하에서 과발현되는 AtCPL5 형질전환 식물체를 제작하였다. T₁ 세대의 15개의 독립된 계통으로부터 두 개의 T₃ 세대의 독립된 동족 과발현 계통인 OE #5 과 OE # 2 를 하이그로마이신 저항성 분리비율에 의해 분리하였다. AtCPL5 전사체의 발현은 야생형과 비교하여 OE #5 와 OE #2에서 과발현된다는 것을 RT-PCR결과를 통하여 확인할 수 있었다(도 4c). T-DNA가 OE#5와 OE #2 식물체에의 염색체에 단일 카피로 삽입되었음을 p35S::AtCPL5 의 T-DNA 영역에서 유일한 제한효소 자리(BamHI, BglII)를 절단한 염색체 DNA를 이용한 서던블럿 분석을 통하여 확인하였다(도4b). T-DNA 삽입 돌연변이 식물체 gabi -4, 과발현 식물체 OE #5와 OE #2 는 야생형과 비교하여 영양생장기와 생식생장기에서 표현형의 차이가 없는 것으로 나타났다(data not shown).

5. T-DNA 삽입 돌연변이 식물체 gabi -4, 과발현 식물체 OE #5와 OE # 2 의 ABA에 대한 반응 분석

피토호르몬 ABA는 씨앗 발아와 식물 뿌리 성장에 있어 저해자일 뿐만 아니라 씨앗 성숙과 형성의 조절자로 알려져 있다. AtCPL1 / FRY2와 AtCPL3은 ABA 신호와 삼투스트레스에 대한 조절자이다(Bang, W. et al.(2006) Plant Physio . 142, 586-594; Koiwa, H. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 99, 10893-10898; Xiong, L. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA , 99, 10899-10904.). ABA, NaCl, 가뭄 스트레스 및 저온 스트레스 조건에서 2~3 주된 식물체는 AtCPL5 mRNA가 유도된다(도2). 또한 GUS는 로제트 잎의 돌기 꼴 구조와 공변세포에서 강하게 염색된다(도3). 따라서, AtCPL5 유전자는 ABA에 연관된 스트레스 반응에 연관되어 있는 것을 추측할 수 있다. 외부의 ABA에 반응하는 AtCPL5 유전자의 기능을 조사하기 위해, 다른 ABA농도에서 gabi -4, 야생형, OE #5 및 OE # 2식물체들의 식물 뿌리 성장 분석을 수행하였다. abi4는 외부의 ABA에 민감하지 않은 양성 대조구로 사용되었다. 모든 식물체는 0 (대조구), 0.5, 1.0, 1.5 μM ABA가 포함된 1/2 MS배지에 심었다. 도5C에서 보는 바와 같이 대조구 배지에서 abi4, gabi -4, 야생형, OE #5 및 OE #2의 원뿌리의 길이는 대조구와 비슷한 패턴을 보였고, 반면에, 1.5 μM ABA에서 OE #5 와 OE #2 은 gabi -4와 야생형은 심각하게 저해되었다. OE#5 와 OE#2 식물체의 원뿌리 길이의 감소율은 ABA 농도에 따라 달라진다. ABA 농도를 증가시키면, OE#5와 OE#2 식물체의 원뿌리의 길이는 야생형보다 짧고, 반면에 gabi -4와 abi4의 원뿌리의 길이는 야생형보다 길다. 발아(sowing) 8일째, 0, 0.5 μM ABA 농도에서 abi4, gabi -4, 야생형, OE #5 및 OE #2의 원뿌리의 길이는 비슷하였고, 1.0, 1.5 μM ABA에서 OE #5와 OE #2의 원뿌리의 길이는 야생형보다 심각하게 저해되었다. 그러나, gabi -4 은 야생형보다 덜 저해되었는데 이는 abi4 와 유사하였다(도5a). 1.5 μM ABA가 존재시 OE #5 와 OE #2 식물체의 상대적인 감소율은 대조구(0 μM)와 비교하여 78.8%와 75.8%로 각각 감소하였고, 반면에 발아 8일째의 gabi -4 와 야생형은 32.3%와 55.2%로 각각 나타냈다(도 5b). 이러한 결과는 외부의 ABA에 대하여 과발현 식물체는 야생형보다 더 민감하고, 반대로 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체은 덜 민감한 것을 보여준다.

6. OE #5 와 OE #2 식물체의 가뭄에 대한 내성

AtCPL5가 가뭄 스트레스 하에서의 작용기작을 조사하기 위하여, gabi -4, 야생형, OE #5 과 OE # 2 의 식물체에 가뭄스트레스를 처리하였다. 식물체를 3주 동안 토양에서 잘 자라게 한 뒤, 10일동안 물을 주지 않았다. 식물체의 잎은 시들기 시작하였고, 물을 주지 않은 7일째 되던 날 안토시안(anthocyan)이 축적되었다. 10일째에 식물체 대부분은 시들었다. 그 후 다시 물을 주기 시작하여 3일째에, gabi -4 와 야생형 식물체의 39% 와 56%은 각각 다시 살아났다. 놀랍게도, 과발현식물체 OE #5 와 OE #2의 72% 와 81%가 살았다(도6a, 6b). 이러한 결과는 가뭄스트레스에서 과발현 식물체가 야생형과 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체 gabi -4보다 내성이 좀 더 강한 것을 알 수 있게 한다. ABA에 고도로 민감하고, 가뭄에 내성을 갖는 35S:: AtCPL5 식물체에 따르면, AtCPL5은 ABA-매개한 가뭄 스트레스의 양성 조절자이다.

7. AtCPL5 유전자의 과발현은 몇 개의 비생물적 스트레스 반응 유전자를 활성화시킨다.

RNAP II CTD phosphatase는 스트레스 반응과 발달(development)에서 중요한 역할을 한다(Bang, W. et al.(2006) Plant Physio . 142, 586-594; Koiwa, H. et al. (2002) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 99, 10893-10898). 스트레스 반응 유전자의 발현 패턴이 AtCPL5에 의해 조절되는지 알아보기 위해, 2주된 야생형과 OE#5 식물체에 ABA 처리후 스트레스 반응 유전자들의 발현패턴을 조사하였다. 노던블럿 분석 결과 반응 유전자 RD22와 RD26 은 전사수준에서 AtCPL5 에 의해 조절받는 것을 확인하였다(도7). ABA 처리후, 탈수(dehydration) 반응 유전자 RD22은 야생형과 OE #5에서 유도되었고, 놀랍게도 RD22은 야생형보다 OE #5에서 두드러지게 발현되었다. ABA 처리 후, 또 다른 탈수 반응 유전자 RD26은 야생형 식물체에서 활성화되었고, 더욱이 OE #5에서 mock 처리나 ABA 처리시, 매우 많이 발현되었다. AtCPL5은 RD20, RD29A (COR78/LTI78), RD17 ( COR47 ) 및 RAB18와 같은 다른 스트레스 반응 유전자에는 영향을 끼치지 않는다. 이러한 결과는 AtCPL5 는 ABA 신호전달에서 RD22 와 RD26과 같은 스트레스 반응 유전자의 양성 조절자라는 것과 ABA 관련 스트레스 반응에 관여할 것이라고 추측이 된다.

8. 재조합 His₆-AtCPL5와 GST-AtCTD의 발현과 정제

AtCPL5이 RNAP II (AtCTD)의 CTD에 CTD phosphatase activity가 있는지 조사하기 위하여, AtCPL5의 full-length cDNA를 단백질 발현백터인 pET-30a(+)에 클로닝하여 N-말단에 His-tag 이 붙은 His6-AtCPL5 재조합 융합단백질을 만들었다. His6-CPL5의 재조합 융합단백질은 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL 에서 37℃에서 발현 시 모두 불용성이었고, 따라서, 낮은 온도에서 발현을 시도하였다. 적은 양의 가용성 단백질이 18℃에서 발현되었다. 가용성 박테리아 용해물(lysates)은 4℃에서 Nickel-affinity chromatography로 정제하였다. His6-AtCPL5 (77 kDa)와 일치하는 폴리펩타이드는 SDS-PAGE와 His-tag antibody를 이용한 웨스턴 블럿으로 검출하였다(도8a). His6-AtCPL5 의 기질로서의 RNAP II CTD 는 애기장대의 RNAP II 의 가장 큰 subunit 인 At4g35800 의 CTD 영역의 cDNA 를 단백질 발현백터인 pGEX-5X-1 클로닝하여 재조합 GST-AtCTD 융합단백질을 만들었다. GST-AtCTD 는 E. coli BL21(DE3) 37℃에서 가용성단백질이 많이 만들어졌고 가용성 박테리아 용해물(lysates)은 glutathione affinity chromatography을 이용하여 정제하였다. SDS-PAGE (75 kDa)로 GST-AtCTD융합 단백질의 정확한 크기는 64 kDa보다 큰 것으로 확인되었다. 웨스턴 블럿은 GST antibody로 수행하였다(data not shown).

9. RNAP II CTD 의 Ser-2가 탈인산화(Dephosphorylate)가 된 AtCPL5

AtCPL1와 AtCPL2은 RNAP II CTD phosphatase 활성을 가지고 있으며 인산화된 합성 CTD 펩타이드와 재조합 GST-AtCTD의 Ser-5를 탈인산화시킨다 (Koiwa et al ., 2004). AtCPL5가 RNAP II CTD phosphatase 활성을 가지고 있는지 조사하기 위해, 단백질 키나아제에 의해 인산화된 기질인 재조합 GST-AtCTD를 이용하여 정제된 His₆-AtCPL5 재조합 단백질을 가지고 탈인산화분석(dephosphorylation assay)를 수행하였다. 재조합 GST-CTD을 인산화하기 위하여 재조합 RNAP II CTD의 세린 잔기를 인산화한다고 보고된 두가지의 단백질 키나아제 Cdc2와 Erk2를 사용하였다(Koiwa, H. et al.(2004) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 14539-14544; Zheng, H. et al.(2005) Biochem . Biophys . Res . Commun . 331, 1401-1407). Ser-2-po4과 Ser-5-po4 (Bregman, D.B. et al. (1995) J. Cell Biol . 129, 287-298)에 대해 각각 특이적인 phosphoserine 특이 단일항체인 H5와 H14을 사용하여 수행한 웨스턴 블럿을 이용하여 His₆-AtCPL5의 CTD phosphatase activity를 조사하였다. 선행연구에서 GST-AtCTD의 비인산화 형태는 GST-AtCTD_A로써, 인산화된 형태는 GST-AtCTD_o고안하였다(Koiwa, H. et al.(2004) Pro . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 14539-14544). GST-AtCTD_o은 Cdc2 또는 Erk2 protein kinases에 의하여 인산화될 때 H5 와 H14에 의하여 인식되고, GST-AtCTD_A와 비교하여 lower electrophoretic mobility 을 보여준다(도 8b , c). 10 mM MgCl₂이 있는 37℃에서 4시간동안 dephosphorylation reaction buffer (50 mM Tris-acetate, pH 4.0)에서 His₆-AtCPL5을 처리한 후에, GST-AtCTD_o은 H5 (도 8b ,c, 패널 H5, 레인 3)에 의해 약하게 보였고, 반면에 H14 (도 8b, c, 패널 H14, 레인 3)에 의해 강하게 인식되었다. 예상외로, H5은 GST-AtCTD_A(도 8b, 패널 H5, 레인1)을 가진 약한 cross-reasctivity를 보였다. 이러한 결과는 His₆-AtCPL5가 Ser-2로부터 인산기를 제거하는 능력을 가졌고, GST-AtCTD_o에서 Ser-5으로부터 인산기를 제거하는 능력을 갖지 못한 것을 의미한다. 따라서 AtCPL5은 시험관에서 Ser-2특이적 RNAP II CTD phosphatase activity을 가진 것을 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예1; 식물, 성장조건, mRNA발현 패턴을 관찰하기 위한 스트레스 처리>

야생형(Columbia-0), GABI-Kat T-DNA 삽입 돌연변이 식물체(GABI-KatT-DNA insertion knockout mutant) 애기장대 종자를 본 발명에 사용하였다. T-DNA 삽입 돌연변이 식물체 GABI-Kat 532E08(Knockout mutant GABI-Kat 532E08)은 Max Planck Institute for Plant Breeding Research in Germany (www.gabi-kat.de)으로부터 획득하였다. T-DNA가 삽입된 동형접합(homozygosity)을 PCR로 확인하기 위하여 정방향 프라이머 5`-CGCGGATCCTGTTTCTCTTCTTTTTGT-3`(서열번호3)와 역방향 프라이머 5`-CGCAAAGAAATGGCCGTAGT-3`(서열번호4)을 이용하여 AtCPL5을 확인하였고, T-DNA left border는 5`-CCCATTTGGACGTGAATGTAGACAC-3``(서열번호5)을 이용하였다. 식물성장을 위해, 종자는 30% 블리치 솔루션(bleach solution)과 80% 에탄올에 멸균하 였고, 1% 슈크로스, 0.05% MES-KOH (pH 5.7), 0.65% 피토 아가 (호르몬 스트레스와 비생물적 스트레스 처리를 위하여) 또는 1% 피토 아가 (뿌리 성장 분석을 위하여)가 포함된 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에서 배양하였다. 플레이트는 휴면을 깨기 위하여 4℃, 암조건에서 4일동안 휴면타파를 하였고, 100 μ E m^-2 s^-1, 23℃, 16/8 h 명/암 주기로 세팅된 성장 챔버에 옮겼다. 호르몬 및 비생물학적 스트레스 처리를 한 후 mRNA 발현 정도를 조사하였다. 2주된 애기장대 종자는 MS 고체배지에서 분리하였고, 0.1 mM ABA, 300 mM NaCl, 400 mM 마니톨용액, DW(대조구)에 각각 담가두었다. 저온 스트레스는 MS 배지에 심은 2주된 식물체를 cold room에서 처리하였고 가뭄 스트레스를 위해, 3주된 애기장대 식물체에서 로제트 잎만 분리하여 페트리 디쉬에 놓고 실험벤취 위에서 놓아두었다.

<실시예2; 플라스미드 구조체와 애기장대로의 형질전환>

AtCPL5 cDNA의 ORF(open reading frame)을 얻기 위해, total RNA를 야생형 애기장대로부터 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 분리하였다. Total RNA 1㎍을 65℃에서 5분 동안 가열하고, Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen)을 이용하여 AtCPL5 특이 역방향 프라이머 5`-TCATTCTACAGATTCTACGTTGAGTTC-3` (stop codon in italics. 서열번호6)로 55℃, 60분동안 역전사효소반응을 수행하였다. Full-length cDNA의 PCR 증폭은 두 단계를 통하여 수행하였다. 1차 PCR은 주형으로서 희석된 cDNA 사용하였고, PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene, USA)와 정방향 프라이머5`-ATGTTTGTAGCCAAAAATCTTTCTCC-3`(start codon in italics, 서열번호7)와 역방향 프라이머5`-TCATTCTACAGATTCTACGTTGAGTTC-3` (stop codon in italics, 서열번호8) 을 사용하였다. 2차 PCR 증폭은 주형으로서 희석한 1차 PCR 산물을 정제하여 사용하였고, 정방향 프라이머 5`-TTTGTAGCCAAAAATCTTTCTCC-3` (no restriction enzyme site, start codon deleted, 서열번호9)와 역방향 프라이머5`- CGGCTAGCTTCTAGAGATTCTACGTT-3` (added NheI site underlined, stop codon deleted, 서열번호10)을 이용하였다. 식물 바이너리 벡터pCAMBIA1301 (MRC, England)은 NcoI (개시 코돈 포함)절단 후 klenow fragment (Promega, USA)로 5`말단을 채우고 난 뒤, 3`을 NheI으로 부분 절단하여 GUS 시퀀스를 제거하였다. 3` NheI-절단된 2차 PCR 산물은 5` 블런트 엔드(5` blunt end)와 3` NheI 스티키엔드(3` NheI sticky end )로 준비된 pCAMBIA1301벡터에 삽입하였다. 과발현 벡터인 p35S::AtCPL5은 DNA 시퀀스 분석으로 확인하였고, 아그로박테리움 튜머훼시엔스 C58C1(Agrobacterium Tumefacience C58C1)을 이용하여 floral dip method (Clough, S. et al. (1998) Plant J. 16, 735-743)으로 애기장대에 형질전환하였다. 형질전환체는 하이그로마이신((30㎍/㎖))이 포함된 MS 배지에서 선별하였고, T3 세대에서 두 개의 T-DNA 가 단일카피로 삽입된 독립적인 계통의 동질접합체를 서던블럿 분석, 노던블럿 분석, 하이그로마이신 저항성분리 비율로 선별하였다. 서던 블럿은 p35S::AtCPL5의 T-DNA 부위의 염색체 DNA를 유일한 제한효소로 절단한 뒤 0.8% 아가로스 젤에서 분리하고 Hybond-N<sup>+</sup>나일론 막으로 옮겼다(Amersham Biosciences, UK). 혼성화(Hybridization)는 35S 프로모터 (Southern blot forward primer: 5`-TTCAAATAGAGGACCTAACAGAA-3`, 서열번호11 )와 AtCPL5 gene (Southern blot reverse primer: 5`-ATGTACCAGTGTCCACAGTTATTA-3, 서열번호12)와 반응하는 [α-³²P] dCTP-labeled DNA probe를 이용하였다. 방사선능은 오토라디오그라피로 검출하였다.

<실시예3; RT-PCR(Reverse transcriptase PCR) 분석과 노던 블럿>

RT-PCR과 노던 블럿 분석을 위한 total RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 추출하였고, 염색체 DNA의 오염을 피하기 위하여 DNase처리는 정제과정에서 컬럼안에서 처리하였다. RT-PCR은 AtCPL5 RT-PCR 프라이머(표1)를 사용하여 one-step RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)으로 수행하였다. Total RNA 1㎍을 주형으로 사용하였고, 37 사이클을 러닝하였다. β-tubulin 은 정량을 위한 대조구로 사용되었다. 노던블럿을 위해, 샘플 각각의 total RNA 5~20㎍은 1% formamide/agarose gel에서 전기영동으로 분리하였고, Hybond-N⁺ nylon membrane (Amersham Biosciences, UK)에 옮겼다. AtCPL5와 몇몇의 애기장대 스트레스 반응유전자 대한 다양한 [α-³²P] dCTP-labeled DNA 프로브로 혼성화하였다. 방사능은 방사능사진촬영술(autoradiography)로 검침하여 검출하였고, 노던 블럿에 사용된 프로브는 표1에 있다.

표1. RT-PCR에 사용한 프라이머와 노던 블럿에 사용된 프로브

Gene name	Sequence (5` to 3`)
RT-PCR
AtCPL5 (At3g19600)	F: TGTTAAAGCCTCACTCTGAGGAA(서열번호13)
	R: TGTAAACATACATGGTGAAAAACTCGT(서열번호14)
β- tubulin (At5g62690)	F: CTCAAGAGGTTCTCAGCAGT(서열번호15)
	R:TCACCTTCTTCATCCGCAGT(서열번호16)
Northern blot
AtCPL5 (At3g19600)	Same as mentioned above
RD22 (At5g25610)	F: TCTCTCCATAATCTTTTGACTTTCG(서열번호17)
	R:TTATCGTCAGACAACTTCTTTACCC(서열번호18)
RD26 (At4g27410)	F: GATCTCAGAGACAAGCTGTTACTCC(서열번호19)
	R:GGTAACCATTTATTTTTCTCTCCGT(서열번호20)
RD20 (At2g33380)	F: GATTTGGAGGAAACATTACCAAAAC(서열번호21)
	R: GCAATTTGTTCAAATAAACTTCCAT(서열번호22)
RD29a (At5g53210)	F: AATATCTTGATGGTCAACGG(서열번호23)
	R: TGATCAAGAGTCTCCGTCTT(서열번호24)
RAB18 (At5g66400)	F: TTTGGAACTGGCGGAGGAGCTAGG(서열번호25)
	R: AGCATCATATCCGGATCCCATGCCG(서열번호26)
COR47 (At1g20440)	F: AAGAGGAAGTGAAACCTCAAGAGAC(서열번호27)
	R: TTCTCTTTGATCTTTTCCAAAATCC(서열번호28)

<실시예4; 조직화학적 GUS 분석>

P _AtCPL5 ::GUS 벡터의 제조를 위해, AtCPL5 유전자의 두 개의 프로모터 부위(745, 3955bps upstream from the initiation codon)를 적절한 프라이머(including BamHI and EcoRI sites)를 이용하여, 주형은 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, USA)에서 받은 Arabidopsis BAC clone MMb12의 염색체 DNA를 이용하여 PCR로 증폭하였고(including BamHI and EcoRI sites), 이를 pCAMBIA1391바이너리 벡터 (MRC, England)의 BamHI와EcoRI 사이트에 삽입하였다. P_AtCPL5-745::GUS 와 P_AtCPL5-3955::GUS 의 T3 동질접합 형질전환 식물체(T3 homozygous transgenic plants)를 선발하였고 GUS 염색법으로 GUS 발현을 분석하였다 (Hemerly, A. S. et al.(1993) Plant Cell, 5, 1711-1723). P_AtCPL5::GUS 형질전환 식물체의 다양한 조직은 엽록소를 표백하기 위하여 4℃에서 20분 동안 90% cold acetone에서 고정하였고 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)에서 헹구었다. 그 뒤, 염색액(100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 mM K₃(Fe[CN]₆), 0.5 mM K₄(Fe[CN]₆)에서 배양하였고, 0.5 ㎎/㎖ X-Gluc (5-bromo-4chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid))에 담궈 37℃에서 4~ 24 시간동안 반응시켰다. 염색후, 샘플은 70% ethanol으로 여러번 헹구어, 나머지 엽록소를 깨끗하게 제거하였다.

<실시예5; 뿌리성장 분석과 가뭄 스트레스 처리>

뿌리 성장 분석을 위해, 식물체는 0, 0.5, 1.0, 1.5 μM ABA을 포함하는 1/2 MS 배지에서 8일동안 키운 후 23℃, long-day conditions(16 h 명/ 8 h 암)인 성장 챔버에서 키웠다. 적어도 20개의 식물체/반복의 원뿌리 길이는 8일동안 측정하였고 3 반복 실험을 수행하였다. 가뭄 스트레스 처리는 3주된 애기장대 식물체에 물을 주지 않고 10일동안 키운 후, 3일동안 다시 물을 준후 생존율을 측정하였다.

<실시예6; 재조합 단백질의 발현과 정제>

재조합 AtCPL5 단백질 발현을 위해, AtCPL5 (1-1806)의 full-length cDNA는 forward primer 5`-CGGATATC ATGTTTGTAGCCAAAAATC-3` (밑줄은 EcoRV 사이트 , 이탤릭은 개시 코돈, 서열번호29)와 reverse primer 5`-GCGAGCTC TCATTCTACAGATTCTACG- 3` (밑줄은 SacI 사이트 , 이탤릭은 정지 코돈, 서열번호30)를 이용한 PCR을 수행하여 얻었다. EcoRV와 SacI으로 절단된 PCR 산물은 EcoRV와 SacI으로 자른 pET-30a (+) vector (Novagen, Germany)에 삽입시켰다. 만들어진 발현 플라스미드 pET30a-His₆-CPL5은 N-말단에 His₆-tagged CPL5 융합단백질을 암호화한다. pET30a-His₆-CPL5 플라스미드는 E.coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL으로 형질전환시켰다. 단일 형질전환체로부터 유도된 배양물(1ℓ)은 50㎍/㎖ kanamycin과 17㎍/㎖ chloramphenicol이 첨가된 37℃, LB배지에서 A ₆₀₀가 0.4이 되도록 배양하였다. 배양물은 0.2 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)를 첨가하고, 18℃에서 20시간동안 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 모으고 이를 0.1% Triton X-100이 포함된 50 ㎖ 1ⅹBinding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol)에서 잘 풀어준 뒤, 10분동안 초음파처리한다. 용해성 추출물은 4℃에서 Ni²⁺chelate affinity column (Novagen, Germany)을 이용하여 최소한의 변형이 일어나도록 제조사의 지시서대로 정제한다. 레진은 1ⅹwash buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 30 mM imidazole, pH 7.9)로 씻고, 50, 100, 200 mM 이미다졸이 포함된 1ⅹelution buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 순차적으로 녹여서 분리한다. 재조합 His₆-AtCPL5 단백질은 200 mM imidazole fraction에서 가장 많이 재수득되었다. 정제된 단백질 농도는 스탠다드로써, BSA를 이용하여 Bradford (Bradford, M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254)방법으로 결정하였 고, SDS-PAGE와 His-tag antibody (Novagen)를 이용한 Western Blot으로 검출하였다. 재조합 GST-AtCTD을 제작하기 위해, RNAP II의 가장 큰 단위체(subunit)의 CTD 코딩영역(Christiane Nawrath, J.S. et al.(1990) Mol. Gen. Genet. 223, 65-75; Umeda, M. et al.(1998) Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5021-5026)인 cDNA (NCBI, At4g35800)은 BamHI와 XhoI DNA 조각으로 분리하였고, glutathione S-transferase (GST)유전자 융합 벡터 pGEX-5X-1 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)의 BamHI와 XhoI자리에 도입하였다. GST-AtCTD 융합단백질은 0.8 mM IPTG를 첨가한 37 ℃ 배지에서, 4시간동안 E.coli BL21(DE3)에서 발현되었고, 제조사의 지시대로 GST Purification kit (Clontech, USA)으로 정제하였다.

<실시예7; RNAP II CTD Phosphatase활성>

Cdc2 protein kinase (New England Biolabs)로 30℃에서 8시간동안 인산화를 수행하거나 Erk2 (New England Biolabs) protein kinase로 30℃에서 2시간동안 인산화를 수행하여 정제된 재조합 GST-AtCTD를 준비하였다. 각각의 인산화는 4 mM ATP (Sigma, USA) 와 kinase buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM dithiothreitol, 0.01% Brij 35, pH7.5 )를 사용하였고, 탈인산화시킨 다음 65℃에서 20분동안 반응시켜 불활성화 시켰다. 탈인산화(Dephosphorylation)는 50 mM Tris-acetate buffer (pH4.0), 10 mM MgCl_2, His₆-AtCPL5 (1.2㎍)과 상기의 인산화된 2.1 ㎍ GST-AtCTD을 포함한 phosphatase reaction mixtures (30 ㎕)로 37℃에서 4 시간 반응시켜 수행하였다 (Koiwa, H. et al.(2004) Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 14539-14544; Zheng, H. et al.(2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1401-1407). 탈인산화(dephosphorylation)된 단백질 시료를 10% SDS-PAGE에서 분리하고, Hybond-ECL nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences, UK)으로 옮겼다. 막은 2% fatty acid-free bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 으로 1시간동안 23℃(room temperature)에서 블럿킹하고, H5와 H14 단일항체 (1:500 dilution) (Covance, USA)로 반응시킨 후, 항마우스 2차 항체 IgG-HRP에 1:5000인 희석액과 ECL 검출시약 (Amersham Biosciences, UK)으로 각각 IgG-HRP반응시켰다. 막은 LAS-3000 (Fuji Photo Film, Japan) 발광 이미지분석기로 관찰하였다.

AtCPL5 유전자가 과발현됨으로써 식물호르몬인 ABA나 비생물학적 스트레스인 NaCl 및 가뭄 스트레스에 내성을 갖는 AtCPL5 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> AtCPL5 gene and AtCPL5 overexpression transgenic plants <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1806 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtttgtag ccaaaaatct ttctccggaa cgagaatcca aaaggcagaa gaaagaaccg 60 gagatcatgg aaccctcatt tccattgttg tctcctaata actgtggaca ctggtacatt 120 cgttacggat tctgcatcgt atgcaaatca acggtggaca aaactatcga aggccgagta 180 ttcgacggtt tacatctaag cagcgaggct ttagcgttaa cgaagcgtct cataacgaaa 240 ttctcttgtc tcaacatgaa gaagcttcac cttgtccttg acttggacct tacgcttatc 300 cactccgtta gggttccatg tctctccgaa gcagagaagt atctaatcga agaagctggt 360 tcaacaacaa gggaagatct atggaaaatg aaagtcagag gagatcccat atccataacc 420 atagaacact tggtaaaact acggccattt ctttgcgaat tcttgaaaga agccaacgag 480 atgttcacaa tgtatgttta cacaaagggt actcgccctt acgctgaagc cattttgaag 540 ctgattgatc cgaagaaact ctattttgga catagagtga taacaagaaa tgagagtcct 600 catacgaaga cacttgatat ggttttggct gatgaacgtg gagtggtgat tgtggatgat 660 acacgtaaag cttggcctaa 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gtggatgata cgcgtaacgt ttggcctgat 1560 cacaagagta acctagtgga tataagcaag tacagctatt tcagactcaa aggccaagac 1620 tcaatgcctt actctgagga gaagacagac gagagtgaaa gcgaaggtgg attggcgaat 1680 gttttgaaac tactcaagga agttcaccaa agattcttca gagtcgagga agaattggag 1740 tcgaaggacg ttaggtcgct gcttcaagaa atagactttg aactcaacgt agaatctgta 1800 gaatga 1806 <210> 2 <211> 601 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Phe Val Ala Lys Asn Leu Ser Pro Glu Arg Glu Ser Lys Arg Gln 1 5 10 15 Lys Lys Glu Pro Glu Ile Met Glu Pro Ser Phe Pro Leu Leu Ser Pro 20 25 30 Asn Asn Cys Gly His Trp Tyr Ile Arg Tyr Gly Phe Cys Ile Val Cys 35 40 45 Lys Ser Thr Val Asp Lys Thr Ile Glu Gly Arg Val Phe Asp Gly Leu 50 55 60 His Leu Ser Ser Glu Ala Leu Ala Leu Thr Lys Arg Leu Ile Thr Lys 65 70 75 80 Phe Ser Cys Leu Asn Met Lys Lys Leu His Leu Val Leu Asp Leu Asp 85 90 95 Leu Thr Leu Ile His Ser Val Arg Val Pro Cys Leu Ser Glu Ala Glu 100 105 110 Lys Tyr Leu Ile Glu Glu Ala Gly Ser Thr Thr Arg Glu Asp Leu Trp 115 120 125 Lys Met Lys Val Arg Gly Asp Pro Ile Ser Ile Thr Ile Glu His Leu 130 135 140 Val Lys Leu Arg Pro Phe Leu Cys Glu Phe Leu Lys Glu Ala Asn Glu 145 150 155 160 Met Phe Thr Met Tyr Val Tyr Thr Lys Gly Thr Arg Pro Tyr Ala Glu 165 170 175 Ala Ile Leu Lys Leu Ile Asp Pro Lys Lys Leu Tyr Phe Gly His Arg 180 185 190 Val Ile Thr Arg Asn Glu Ser Pro His Thr Lys Thr Leu Asp Met Val 195 200 205 Leu Ala Asp Glu Arg Gly Val Val Ile Val Asp Asp Thr Arg Lys Ala 210 215 220 Trp Pro Asn Asn Lys Ser Asn Leu Val Leu Ile Gly Arg Tyr Asn Tyr 225 230 235 240 Phe Arg Ser Gln Ser Arg Val Leu Lys Pro His Ser Glu Glu Lys Thr 245 250 255 Asp Glu Ser Glu Asn Asn Gly Gly Leu Ala Asn Val Leu Lys Leu Leu 260 265 270 Lys Gly Ile His His Lys Phe Phe Lys Val Glu Glu Glu Val Glu Ser 275 280 285 Gln Asp Val Arg Leu Thr Met Ser Val Val Glu Asn Phe Ser Ser Glu 290 295 300 Pro Lys Ala Lys Arg Arg Lys Ile Glu Pro Thr Ile Asn Glu Ser Ser 305 310 315 320 Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys Gly His Trp Tyr Ile Cys His 325 330 335 Gly Ile Cys Ile Gly Cys Lys Ser Thr Val Lys Lys Ser Gln Gly Arg 340 345 350 Ala Phe Asp Tyr Ile Phe Asp Gly Leu Gln Leu Ser His Glu Ala Val 355 360 365 Ala Leu Thr Lys Cys Phe Thr Thr Lys Leu Ser Cys Leu Asn Glu Lys 370 375 380 Lys Leu His Leu Val Leu Asp Leu Asp His Thr Leu Leu His Thr Val 385 390 395 400 Met Val Pro Ser Leu Ser Gln Ala Glu Lys Tyr Leu Ile Glu Glu Ala 405 410 415 Gly Ser Ala Thr Arg Asp Asp Leu Trp Lys Ile Lys Ala Val Gly Asp 420 425 430 Pro Met Glu Phe Leu Thr Lys Leu Arg Pro Phe Leu Arg Asp Phe Leu 435 440 445 Lys Glu Ala Asn Glu Phe Phe Thr Met Tyr Val Tyr Thr Lys Gly Ser 450 455 460 Arg Val Tyr Ala Lys Gln Val Leu Glu Leu Ile Asp Pro Lys Lys Leu 465 470 475 480 Tyr Phe Gly Asp Arg Val Ile Thr Lys Thr Glu Ser Pro His Met Lys 485 490 495 Thr Leu Asp Phe Val Leu Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ile Val Asp 500 505 510 Asp Thr Arg Asn Val Trp Pro Asp His Lys Ser Asn Leu Val Asp Ile 515 520 525 Ser Lys Tyr Ser Tyr Phe Arg Leu Lys Gly Gln Asp Ser Met Pro Tyr 530 535 540 Ser Glu Glu Lys Thr Asp Glu Ser Glu Ser Glu Gly Gly Leu Ala Asn 545 550 555 560 Val Leu Lys Leu Leu Lys Glu Val His Gln Arg Phe Phe Arg Val Glu 565 570 575 Glu Glu Leu Glu Ser Lys Asp Val Arg Ser Leu Leu Gln Glu Ile Asp 580 585 590 Phe Glu Leu Asn Val Glu Ser Val Glu 595 600 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgcggatcct gtttctcttc tttttgt 27 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcaaagaaa tggccgtagt 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccatttgga cgtgaatgta gacac 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcattctaca gattctacgt tgagttc 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgtttgtag ccaaaaatct ttctcc 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcattctaca gattctacgt tgagttc 27 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tttgtagcca aaaatctttc tcc 23 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggctagctt ctagagattc tacgtt 26 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttcaaataga ggacctaaca gaa 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgtaccagt gtccacagtt atta 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgttaaagcc tcactctgag gaa 23 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgtaaacata catggtgaaa aactcgt 27 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctcaagaggt tctcagcagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcaccttctt catccgcagt 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tctctccata atcttttgac tttcg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttatcgtcag acaacttctt taccc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gatctcagag acaagctgtt actcc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggtaaccatt tatttttctc tccgt 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gatttggagg aaacattacc aaaac 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcaatttgtt caaataaact tccat 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aatatcttga tggtcaacgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgatcaagag tctccgtctt 20 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tttggaactg gcggaggagc tagg 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 agcatcatat ccggatccca tgccg 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 aagaggaagt gaaacctcaa gagac 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttctctttga tcttttccaa aatcc 25 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cggatatcat gtttgtagcc aaaaatc 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcgagctctc attctacaga ttctacg 27

Claims (9)

1. 삭제
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6. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 AtCPL5 (Arabidopsis thaliana CTD phosphatase domain) 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제
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