CN114196651A

CN114196651A - D6蛋白激酶d6pkl2的新用途

Info

Publication number: CN114196651A
Application number: CN202111538383.4A
Authority: CN
Inventors: 汪阳东; 陈益存; 高暝; 吴立文; 赵耘霄
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114196651B

Abstract

本发明公开了一种D6蛋白激酶D6PKL2在提高植物抗旱性中的新用途。D6PKL2转基因番茄与非转基因番茄相比表现出较强的抗旱能力；进一步研究发现D6PKL2转基因拟南芥与非转基因拟南芥相比，也表现出强的抗旱能力。导入本发明D6PKL2基因的转基因植物，尤其是转基因番茄和转基因拟南芥的耐旱性明显高于受体植物，对于培育耐旱转基因植物具有重要价值。

Description

D6蛋白激酶D6PKL2的新用途

技术领域

本申请涉及转基因植物技术领域，具体而言，涉及一种D6蛋白激酶D6PKL2在提高植物抗旱性中的新用途。

背景技术

干旱胁迫引起的作物生理缺水严重影响作物生长发育和产量。中科院生态环境研究中心与美国奥本大学及德国波茨坦气候影响研究所的科研人员组成的国际团队在美国《国家科学院院刊》上发表论文，首次评估全球历史时期和未来陆地干旱化的速率、方向及其对自然和人类生态系统的潜在影响。干旱化速度的上升将会威胁到人类社会系统(农业和城市)和陆地生物多样性。研究人员计算了未来时期(2050～2099年)全球平均干旱化速度可达每年0.75公里，在一些干旱化严重的区域该速度超过每年8公里。因此，干旱胁迫成为全球植物特别是作物生长发育的重要限制因子，增加植物特别是作物的抗旱性具有重要意义。

研究发现，D6蛋白激酶(D6PK)在拟南芥和杨树中通过影响生长素的运输，从而调控植物植株特别是下胚轴的向光性。D6PK还影响杨树侧根形成和根表皮的平面极性。D6PKL2是D6PK的成员之一。张启燕的博士论文“千年桐(Vernicia montana)对枯萎病应激反应及抗病基因功能鉴定”，首次发现千年桐D6PKL2(VmD6PKL2)还具有抗枯萎病功能，VmD6PKL2遗传转化的拟南芥和番茄都表现出抗枯萎病功能。

发明内容

本发明提供了一种D6蛋白激酶D6PKL2在植物抗旱性调控中的应用。

该D6蛋白激酶D6PKL2为SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQID No:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由其衍生的蛋白质。

进一步的，D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因为如下(1)-(3)任一项所述的DNA分子：

(1)SEQ ID No:1自5’末端第45-2556位核苷酸所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No:1自5’末端第393-2220位核苷酸所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子。

所述植物为茄科或十字花科植物，优选的，所述植物为番茄或拟南芥。

本发明还提供一种提高植物抗旱性的方法，通过提高D6蛋白激酶D6PKL2在受体植物体内的表达量，得到抗旱能力高于所述受体植物的转基因植物。

具体的，该方法包括将D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因导入受体植物使并其表达，得到抗旱能力高于所述受体植物的转基因植物。

所述编码基因的导入方法可以是农杆菌转化法，基因枪法，超声波介导法，花粉管通道法。

具体的，D6蛋白激酶D6PKL2为SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID No:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由其衍生的蛋白质。

D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因为如下(1)-(3)任一项所述的DNA分子：

(1)SEQ ID No:1自5’末端第45-2556位核苷酸所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No:1自5’末端第393-2220位核苷酸所示的DNA分子；

本发明的有益效果包括：发明人在VmD6PKL2遗传转化番茄的培养过程中，因疏忽忘记浇水导致干旱，意外的发现，VmD6PKL2转基因番茄与非转基因番茄相比表现出较强的抗旱能力；进一步研究发现VmD6PKL2转基因拟南芥与非转基因拟南芥相比，也表现出强的抗旱能力；而拟南芥D6PKL2(AtD6PKL2)突变体与野生型拟南芥相比，抗旱能力也显著降低，说明D6PKL2基因对植物的抗旱能力具有调控作用。导入D6PKL2基因的转基因植物的耐旱性明显高于受体植物，对于培育耐旱转基因植物具有重要价值。

附图说明

图1为VmD6PKL2的基因结构分析图，其中，直线代表UTR非翻译区，黑色框表示CDS编码区，灰色框表示内含子区；

图2为VmD6PKL2的组织特异性表达量分析图；

图3为VmD6PKL2在木质部和韧皮部维管组织中的表达量分析图；

图4为千年桐根总蛋白的提取以及VmD6PKL2抗体的特异性检测，其中，图4A为总蛋白的SDS-PAGE电泳图，M为蛋白Marker；图4B为VmD6PKL2抗体的Western Blot鉴定；

图5为VmD6PKL2的免疫组化检测，其中图5A为未经VmD6PKL2特异性抗体杂交的对照组的根部组织，图5B为VmD6PKL2抗体杂交的根部组织，比例尺为50μm；

图6为VmD6PKL2转基因番茄株系的PCR验证，其中M为DL2000marker；泳道1-4代表VmD6PKL2转基因番茄株系用潮霉素抗性基因引物来检测的结果，泳道6-9代表VmD6PKL2转基因番茄株系用VmD6PKL2引物来检测的结果；泳道5和10是野生型番茄；

图7为干旱胁迫后对照野生型番茄和VmD6PKL2转基因番茄的萎蔫情况；

图8为VmD6PKL2转基因拟南芥株系的PCR验证，其中图8A和图8B分别为VmD6PKL2和GFP的检测结果，M代表DL2,000Marker；+代表阳性对照；-代表野生型阴性对照；泳道1-21代表VmD6PKL2转基因拟南芥株系；

图9转基因拟南芥VmD6PKL2表达量的定量验证；WT代表野生型拟南芥；#1-#8代表拟南芥突变体株系；

图10为拟南芥突变体纯杂合验证，其中M代表DL2,000DNA Marker；泳道8代表拟南芥野生型；泳道1-7代表d6pkl2-2突变体株系；泳道9-14代表d6pkl2-1突变体株系；泳道15-24代表d6pkl2-3突变体株系；

图11为拟南芥突变体中AtD6PKL2基因的表达量分析；

图12为干旱胁迫后d6pkl2突变体、野生型和VmD6PKL2转基因拟南芥的萎蔫情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述实施例是关于D6PKL2基因在提高植物抗旱性中的机理研究及应用研究，主要包括基因的克隆、功能验证、转基因植物的获得及抗旱试验等内容。

实施例1、VmD6PKL2基因

(1)RNA提取

提前备好RNAse-Free的离心管和各种型号的枪头。用锡箔纸包裹研钵、研棒、药匙和镊子，180℃烘箱中灭菌10h。佩戴干净的手套，全程戴口罩。取千年桐实生苗的根部组织，液氮速冻，液氮研磨成粉末后利用RN38 EASY spin plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA。利用Q5000微量分光光度计检测获得RNA的浓度及纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀)，RNAasefree洗脱液作为空白对照；并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度。

(2)cDNA第一链的合成

选取OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.9～2.2之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀>1.8且无降解的RNA样品，并对RNA浓度进行均一化处理，然后进行cDNA第一链的合成。具体操作步骤参照Invitrogen公司SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System反转录试剂盒。反转录引物选择oligo dT。反转录完成后，根据初始RNA浓度对cDNA进行适当倍数的稀释。

(3)PCR扩增

根据千年桐转录组测序得到的VmD6PKL2序列，利用Primier 5.0设计D6PKL2特异性引物。

D6PKL2-CDS-F：5’-ACACACTCTCCTCAAAGACCAAACC-3’(SEQ ID NO.3)；

D6PKL2-CDS-R：5’-TACCAATAAGTACACCACCCACCC-3’(SEQ ID NO.4)。

以cDNA(稀释10倍)为模板，用MCLAB高保真酶扩增D6PKL2的序列。

PCR反应体系：

反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸45s，共35个循环；最后，72℃延伸5min。

(4)DNA目的条带的纯化与回收

1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分离。切下含有目的片段的胶块，称取重量后用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段(扩增目的片段为2513bp，序列如SEQ ID No:1自5’末端第45-2557位核苷酸所示)。检测回收PCR产物的浓度。

(5)目的片段回收产物与克隆载体连接

反应体系：

轻轻混合，稍离心后25℃反应15min后置于冰上。克隆载体与插入目的DNA片段摩尔比为1：7，可以按照“1kb 20ng，1.5kb 30ng”的比例计算；最佳反应体系为5μL，体积不足时用ddH₂O补充。

(6)连接产物转化大肠杆菌感受态

在超净台中加连接产物于50μL刚刚解冻的大肠杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速置于冰上静置2～3min；加500μL LB液体培养基；200rpm、37℃振荡培养1h；12000rpm离心1min；吸取并弃掉450μL上清，悬浮剩余的100μL菌体，涂布于含有50μg/mL Amp或Kan的LB固体培养基的培养皿上，37℃倒置培养过夜。

(7)阳性克隆菌液PCR检测

无菌枪头挑取单菌落于1mL含50μg/mL抗生素的LB液体培养基中，200rpm，37℃培养10h至菌液浑浊。利用M13通用引物对阳性克隆的菌液进行PCR鉴定，反应体系同步骤(3)。反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环；最后，72℃延伸5min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，挑选条带大小与目的片段一致的菌液送样测序。用DNAMAN7软件将测序得到的序列分别与千年桐转录组的D6PKL2序列进行比对。

质粒提取：挑取阳性克隆单菌落于50mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃，200rpm振荡培养过夜。取2～4mL菌液，利用Axygen质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒(质粒命名为pEASY-Blunt Zero-D6PKL2)，用于后续表达载体构建等试验。将剩余菌液12000rpm离心1min，用含有20％甘油的LB液体培养基重悬沉淀，分装保存于-70℃。

(8)目的基因鉴定及生物信息学分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析目的基因cDNA序列的开放阅读框，并在CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上对预测到的ORF序列和氨基酸序列进行保守结构域分析和序列鉴定。用DNAMAN7对D6PKL2的核苷酸和氨基酸序列进行多重序列比对。

利用ExPASy ProtParam(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)预测蛋白的理化性质；SOPMA

(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构；用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽；用ESpritz(http://protein.bio.unipd.it/espritz/)进行无序性分析；用HMMTOP2.0(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)，TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜结构域；用NetPhos 3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点；用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)进行疏水性分析。

VmD6PKL2的cDNA序列全长为2,658bp，5’UTR长392bp，3’UTR长430bp。含有一段长为1,836bp的开放阅读框，编码611个氨基酸，分子量为67.099kD(SEQ ID No:1)。

如图1所示，VmD6PKL2的DNA序列全长为6,114bp。将DNA序列与cDNA序列进行比对，结果显示VmD6PKL2含有两个内含子(图1中灰色框所示)，第一个内含子始于5’UTR区第176核苷酸位置，长度为957bp；第二个内含子始于DNA序列的第2209核苷酸位置，长度为2,861bp。

实施例2：VmD6PKL2的表达模式分析

(1)cDNA样品准备

在浙江省杭州市富阳区庙山坞林区亚林所后山，收集千年桐的根，茎，叶，种仁，雄蕊，雌蕊，花苞；并分离收集了广西千年桐实生苗的主根韧皮部，主根木质部，侧根韧皮部，侧根木质部，茎韧皮部，茎木质部，然后分别进行RNA的提取。检测RNA样品的浓度和质量，均一化处理RNA样品的浓度，合成cDNA第一链，根据RNA初始浓度对cDNA进行适当倍数的稀释。

(2)荧光定量PCR引物设计

定量PCR引物设计在D6PKL2的非保守区域，GC含量在45-55％之间，Tm值在60-65℃，上下游引物Tm值差不超过5℃。引物长度在17-25bp之间，扩增片段长度在100-200bp之间。

qVmD6PKL2-F：5’-TCAAAGAGTGGAAGCAAACAGTC-3’(SEQ ID NO.5)

qVmD6PKL2-R：5’-TACTCAACGAATCAGAAGTCCCT-3’(SEQ ID NO.6)

qTEF1a-F：5’-GCCTGGTATGGTTGTGACCT-3’(SEQ ID NO.7)

qTEF1a-R：5’-GGATCATCCTTGGAGTTGGA-3’(SEQ ID NO.8)

(3)荧光定量PCR反应

以稀释后的cDNA为模板，以千年桐TEF1a(transcription elongation factor 1)基因为内参，按照荧光定量试剂盒TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)的操作说明进行PCR反应。检测设备为QuantStudio 7荧光定量PCR检测系统。

反应体系：

扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃变性31s，共40个循环。每个样品3次生物学重复，4次技术重复。利用2^-ΔΔCT方法计算D6PKL2基因的相对表达量。

选取植株的根、茎、叶、种仁、雄蕊、雌蕊和花苞这七种组织D6PKL2的表达模式进行研究。结果表明，在这七种组织中D6PKL2在根、茎、叶这三种维管组织中的表达量明显高于其他四种组织，说明千年桐D6PKL2主要在维管组织高表达(图2)。

为进一步研究VmD6PKL2在维管组织中的表达情况，对千年桐侧根、主根和茎的韧皮部和木质部进行了分离，并分析了VmD6PKL2的表达模式(图3)。比较千年桐VmD6PKL2在维管组织木质部和韧皮部的表达发现，千年桐VmD6PKL2在维管组织木质部的表达量均显著高于其在韧皮部的表达(p<0.05)。

实施例3：VmD6PKL2特异性抗体制备与蛋白表达分析

(1)抗体制备

抗原多肽制备：结合上述对VmD6PKL2二级结构、亲疏水性等的序列分析结果，预测抗原表位，设计抗原表位多肽序列如下：

VmD6PK-SP1:RTGSKASTKQSVC(SEQ ID NO.9)

VmD6PK-SP2:CAPDKKGSDNY(SEQ ID NO.10)

将这两条特异性多肽序列进行合成，合成抗原多肽经HPLC纯化检测,纯度达到90％以上。分别将它们通过C(半胱氨酸)偶联到免疫增强载体蛋白(KLH，BSA)中。

兔子免疫：在免疫注射之前，分离血清作为阴性对照。采集1mL兔耳静脉血，37℃静置2h，4℃沉淀过夜，吸管吸取血清，4℃，4000rpm离心10min，取上清，加入叠氮化钠至终浓度0.02％，混匀后分装并置于-20℃保存。

将1mL含有400μg蛋白的抗原液用1mL等体积的弗式完全佐剂(FCA)充分乳化，通过背部皮下和后大腿肌肉多点注射于2只新西兰兔(下称兔1、兔2)。两个多肽抗原分别单独免疫。以后每隔两周再于上述部位不同的位置注射抗原进行加强免疫，连续加强免疫2次，加强免疫注射的抗原用等体积的弗式不完全佐剂(FIA)充分乳化，每只兔子每次免疫的抗原量为100μg。

(2)抗体效价检测：免疫第7～10d后，开始从兔耳静脉取血，分离血清，采用ELISA法(间接法)检测抗体的效价。用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液,pH 9.6)将抗原稀释至20μg/mL，每孔加100μL包被酶标板；4℃过夜或者37℃孵育2h；用PBST缓冲液(1×PBS，0.1％Tween-20)洗涤酶标板至少三次；每孔加100μL封闭液，37℃，2h；用PBST缓冲液洗板。PBST缓冲液梯度稀释抗血清1：10000，1：30000，1：100000，1：200000，1：400000，1：800000。各孔加100μL稀释抗血清，每个梯度3个重复。1：10000稀释的免疫前血清作为阴性对照，PBST缓冲液为空白对照。37℃，1～2h，PBST缓冲液洗板；每孔加100μL稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃，1-2h，PBST缓冲液洗板；每孔加100μL四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)底物显色液，37℃反应15min，每孔加50μL 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪检测450nm处的吸光值，计算平均值，OD阳性/OD阴性≥2.1时为阳性。抗血清效价大于1:16000后，取颈动脉全血，沉淀血样提纯抗血清，并准备纯化。

(3)抗体纯化

NHS-琼脂糖凝胶FF偶联蛋白和多肽。

将制备的兔1和兔2的抗血清分别按1：10000，1：30000，1：100000，1：200000，1：400000和1：800000比例稀释，免疫前血清作为阴性对照并按1：10000稀释。ELISA法滴度检测结果表明除去1：800000之外的所有稀释抗体测得S值与阴性对照N值之比(S/N)均大于2.1，表明兔1和兔2抗血清的效价均大于1：100000(结果见下表1)。

表1抗血清效价检测

(4)根总蛋白提取

取于-70℃保存的千年桐根部组织，放入冰冻的研钵中，加入液氮并研磨成粉状，注意研磨过程中样本始终处于冰冻状态。将研磨好的组织转移到新管，按每200mg植物组织加0.5mL的比例加入植物蛋白提取试剂，混匀后冰上放置20min，期间颠倒数次混匀，使蛋白溶解。12000g离心15min，上清即为样品总蛋白，直接使用或-70℃保存。

用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取5μL千年桐总蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，分离胶浓度为12％。电泳结束后将胶块在考马斯亮蓝染色液中染色30～60min，转入脱色液中充分脱色，观察条带的分布并拍照，结果如图4A所示。

(5)Western Blot

SDS-PAGE蛋白电泳后，采用湿转法将蛋白条带转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidine difluoride,PVDF)上。电压设置为100V，转膜1～2h。转膜完成后用PBST缓冲液清洗3次，每次10min。将膜放入封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBST)中，37℃封闭1h。弃封闭液，用PBST缓冲液清洗3次。然后将膜与1:5000稀释的D6PKL2抗体于4℃孵育过夜。回收一抗，用PBST缓冲液清洗3次。将膜与1:1000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗于室温孵育1h。回收二抗，用PBST缓冲液清洗4次。将ECL化学发光检测试剂盒中的A液和B液按照1:1混合，PVDF膜朝上放于化学发光成像系统暗箱，将发光液均匀地涂在膜上，关闭暗箱箱门，曝光2min，观察成像结果。

提取千年桐根部总蛋白并利用蛋白质免疫印迹法检测纯化抗体特异性结合D6PKL2的能力结果如图4B所示。结果显示D6PKL2抗体在千年桐总蛋白中检测到一条大小为67kD的蛋白，与D6PKL2蛋白的大小一致，说明制备抗体可以特异性地与D6PKL2蛋白结合。

(6)石蜡切片

材料固定：用双面刀片将根切成1mm的小块，置于FAA固定液，抽真空15min，更新固定液，4℃固定至少一周。

脱水：取出样品，在30％、50％、70％、80％、90％和95％梯度酒精中各脱水1h；无水乙醇脱水2次，每次1h；无水乙醇：二甲苯(1:1)和纯二甲苯各透明1h。

浸蜡：将样品置于二甲苯:石蜡(1:1)混合液中，40℃烘箱中过夜；取出样品置于纯蜡中，65℃浸蜡2h；重复上述步骤一次；石蜡包埋机包埋样品。

切片和展片：使用切片机切片，厚度8～12μm。将切下的蜡带置于展片机37℃水槽中，烤片机56℃烤片，于45℃烘箱中干燥48h以上。

(7)免疫组化

脱蜡：二甲苯3次，每次10min；二甲苯/无水乙醇(1:1)5min；无水乙醇2次，每次5min；85％、70％、50％和30％乙醇各复水5min；0.1M PBS缓冲液2次，每次5min。免疫染色封闭液室温封闭15min；弃掉封闭液，与1:500稀释的一抗在4℃杂交过夜；PBS缓冲液清洗3次，每次10min；与1:50稀释的HRP标记的羊抗兔二抗室温杂交2h；PBS缓冲液清洗3次，每次10min；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒显色15min；封片拍照观察。利用免疫组化试验对D6PKL2在蛋白水平的表达进行验证(图5)。结果显示，在未经D6PKL2特异性抗体杂交的对照组中未检测到表达信号(图5A)；在实验组中，VmD6PKL2在木质部的表达信号明显高于韧皮部(图5B)，VmD6PKL2在蛋白水平的表达结果与转录水平的结果一致，进一步说明千年桐VmD6PKL2在木质部特异性地高表达。

实施例4：提高番茄抗旱能力的方法及效果验证

(1)植物表达载体GFP-VmD6PKL2的构建

在VmD6PKL2的CDS序列两端设计引物，保留起始密码子，删除终止密码子，并添加同源重组接头序列。

GFP-VmD6PKL2-F tcagcagtcgaagagcATGGCCTCGAGAACTGGCA(SEQ ID NO.11)

GFP-VmD6PKL2-R ttagcgtgtgaagagcAAAGAAATCGAACTCCAGA(SEQ ID NO.12)

以实施例1制备的pEASY-Blunt Zero-VmD6PKL2质粒为模板，用MCLAB高保真酶对VmD6PKL2的CDS区域(不含终止子)进行扩增(扩增目标片段共1833bp，其序列如SEQ ID No:1自5’末端第393-2225位核苷酸所示)。反应体系和反应程序见实施例1步骤(3)。1％琼脂糖凝胶电泳后对扩增产物进行纯化与回收，检测回收产物的浓度。然后利用回收产物构建GFP-VmD6PKL2重组表达载体，反应体系如下：

将反应体系混匀后稍离心，然后37℃孵育30min，20℃孵育15～60min。取5μL反应液加入到大肠杆菌感受态DH5α溶液中混匀，然后通过热激法将表达载体转入大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素筛选阳性克隆。挑取阳性克隆进行菌液PCR鉴定后送样测序，对测序拼接序列与模板序列进行比对。挑取测序正确的菌液扩大培养并提取质粒DNA。

(2)VmD6PKL2转化番茄与阳性苗的筛选

番茄待侵染叶片准备：挑选成熟番茄种子(饱满金黄、不发黑透绿、无霉变)，去掉杂质，避免种子成团粘连。将挑选的种子加到50ml离心管或200ml广口瓶中，75％酒精浸泡30秒，倒掉酒精；及时加入2倍体积的无菌水清洗，导出后加入2倍体积的10％次氯酸钠，混匀后置于摇床上110rpm震荡15分钟；然后倒掉液体，用灭菌水清洗种子至少5遍。将种子接种到MS培养基上，每皿50-60颗，封口膜封口，培养7-9天。挑选子叶完全展平而真叶未长出的幼苗，从根部切下，切割叶片，每片叶片切割3-4段，保证伤口平整。

农杆菌侵染液准备：制备GV3101农杆菌感受态，利用冻融法将GFP-D6PKL2重组载体转入GV3101农杆菌感受态细胞，获得阳性农杆菌转化子。挑取农杆菌阳性转化子于200mL的LB液体培养基(50μg/mL Rif，50μg/m Kan)，28℃，200rpm振荡培养至OD600在0.8-1.0，作为侵染液。

农杆菌侵染番茄叶片：将上述前一天准备好的在皿中培养的番茄切割叶片，采用每皿逐个进行侵染，每皿内加入15mL的侵染液。轻晃培养皿，使子叶充分接触菌液，侵染2min30s。侵染结束后，吸除多余菌液，稍保留2-3mL菌液。于25℃共培养2天。

筛选分化培养：将培养侵染子叶(每皿40-50片)转移至具有抗性(10μg/mL潮霉素)的选择培养基上(MS+1.5mg/L 6-BA +0.5mg/L IBA)，叶片正面向上，伤口尽量接触培养基。双层封口膜封口后，置于25℃温室，16L/8D，光照培养2周。选择培养基培养2周后一般可见愈伤(伤口处)，继代至20μg/mL潮霉素的选择培养基，每皿约30片子叶，之后每2周继代一次，继代至30μg/mL潮霉素选择培养基。许多外植体在生长2-3周后会长出绿色或白色的愈伤组织。

生根培养：筛选分化培养6-8周后，可见有小苗长出挑选大小超过2cm，从外植体切下幼芽(不包括愈伤组织)，转移至生根培养基(1/2MS+0.5mg/L IBA)，挑选时尽量分散挑选，保证每株都是独立转化子。经抗性筛选后，筛选到4株D6PKL2转基因番茄阳性苗。生根培养4-7天后，进行取样鉴定。

(3)VmD6PKL2转基因番茄阳性苗的鉴定

利用全式金TransDirect Plant Tissue PCR Kit(植物组织直接PCR试剂盒)对转基因番茄进行验证。基因组快速提取：选取转基因番茄植株，每个株系取1片叶片于2mL离心管，液氮速冻，组织研磨仪磨成粉末。每管加40μL PD1 buffer，涡旋混匀；金属浴95℃孵育10min，期间颠倒混匀数次，稍稍离心；加40μL PD2 buffer，涡旋混匀，稍稍离心，直接作为PCR模板。引物设计同实施案例2。以野生型番茄为阴性对照，利用PCR对VmD6PKL2转基因番茄株系中潮霉素抗性基因(HYG)和目的基因VmD6PKL2进行鉴定。潮霉素引物序列如下，VmD6PKL2引物同实施案例2。

HYG-F ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCG(SEQ ID NO.13)

HYG-R CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG(SEQ ID NO.14)

结果显示，在4株VmD6PKL2转基因番茄株系中均有目的基因D6PKL2(图6)。

(4)VmD6PKL2转基因番茄抗旱效果试验

如图7所示，干旱胁迫14d后，野生型番茄植株萎蔫严重，萎蔫和失水显著高于D6PKL2转基因番茄D6PKL2转基因番茄整体生长状态良好。说明相比于野生型，D6PKL2转基因番茄抗旱能力更强。

实施例5：提高拟南芥抗旱能力的方法及效果验证

(1)植物表达载体GFP-VmD6PKL2的构建

同实施例4。

(2)VmD6PKL2转化拟南芥

利用冻融法将GFP-D6PKL2表达载体转入GV3101农杆菌感受态细胞，挑取农杆菌阳性克隆单菌落于200mL的LB液体培养基(50μg/mL Rif，50μg/m Kan)，28℃，200rpm振荡培养至OD600在1.0左右；4000rpm室温离心10min；将菌液沉淀用新鲜配置的5％的蔗糖重悬，调整OD600至0.8；向上述重悬液中加入Silwet l-77转化辅助剂至终浓度0.02％，混合均匀。

采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥：取培养4周(初果期)且生长健壮的野生型拟南芥，提前一天剪去已形成的果荚，在这之前也可以先将已抽苔的拟南芥打顶来促进侧枝的生长和花序的产生；将拟南芥全部花序浸泡在上述农杆菌重悬液中1min；利用含有GFP空载体和GFP-D6PKL2重组载体的农杆菌分别转化拟南芥36株，注意不要造成交叉污染；将拟南芥植株平行放置，少量喷水，用黑布覆盖，在黑暗和高湿条件下培养24h；取出拟南芥恢复正常培养。1周后进行第2次侵染，方法同上。继续培养直至种子成熟。

(3)转基因拟南芥阳性苗的筛选与鉴定

将收获的转基因种子进行表面消毒，超净台吹干后均匀撒在含有20mg/L潮霉素B的1/2MS培养基上，4℃黑暗培养2d，移至拟南芥室培养10d发现大部分拟南芥不能在抗性培养基上正常生长出真叶和根，而少数具有抗性的拟南芥正常生长，根伸长，叶片呈鲜绿色。将经潮霉素B筛选后根部正常伸长，子叶长势良好，株高高者初步确定为T1代阳性苗，移栽至土中继续培养10d。培养经抗性筛选后，筛选到21株过表达D6PKL2转基因拟南芥。

转基因拟南芥PCR验证。以野生型拟南芥DNA为阴性对照(-)，重组质粒为阳性对照(+)，具体方法同实施案例4步骤(3)，利用PCR对D6PKL2转基因株系中GFP和目的基因VmD6PKL2进行鉴定。VmD6PKL2引物同实施案例2，GFP引物序列如下：

GFP-F CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG(SEQ ID NO.15)

GFP-R CACGAACTCCAGCAGGACCATG(SEQ ID NO.16)

结果显示在所有VmD6PKL2转基因株系中均检测到GFP(图8B)，但是在个别转化子中没有检测到目的基因VmD6PKL2(图8A)。

(4)纯合阳性转基因株系的培养及VmD6PKL2的表达量检测

将转基因拟南芥阳性株系继续培养，分株系收取T1代植株种子；通过20mg/L的潮霉素B筛选T2代阳性苗；剔除生长缺陷的株系，保留8个株系(编号#1-#8)，每个株系挑取15株T2代阳性苗移栽到土中培养，分株收取种子并播种于含有20mg/L潮霉素B的1/2MS培养基中，所有种子均能萌发且正常生长的株系为T3代纯合转基因株系。以野生型拟南芥为对照(WT)，取T3代纯合转基因株系叶片，qPCR验证VmD6PKL2的表达量，与野生型拟南芥相比，均检测到D6PKL2的表达(图9)。引物及方法同实施例2。

(5)拟南芥d6pkl2纯合突变体的鉴定

拟南芥突变体为研究候选基因的功能提供了好材料。以叶片DNA为模板，以野生型拟南芥为对照，对d6pkl2-1、d6pkl2-2和d6pkl2-3拟南芥突变体株系(D6PKL2突变体株系购自美国ABRC突变体库，分别为SALK_011339C，SALK_099935和SALK_086127)进行纯杂合的验证(图10)。在SIGnAL(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)网站设计用于纯杂合鉴定的引物：

LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC(SEQ ID NO.17)

Atd6pkl2-1-LP CGGCAGATTTCACTAGAGTCG(SEQ ID NO.18)

Atd6pkl2-1-RP GTCATGGAGCTGAAGTCGAAG(SEQ ID NO.19)

Atd6pkl2-2-LP CTTCGCCTTTGATGATCTCTG(SEQ ID NO.20)

Atd6pkl2-2-RP AGTGACGAGAGTAGCTGCAGC(SEQ ID NO.21)

Atd6pkl2-3-LP AGTGTTGGGGTGAACTGACAG(SEQ ID NO.22)

Atd6pkl2-3-RP TGCTGCTTCAATTACATGCAC(SEQ ID NO.23)

在d6pkl2-1突变体所有单株中扩增到一条小带；在d6pkl2-2所有的单株中均扩增到两条带；在d6pkl2-3中，既能扩到单条大带，也能扩到单条小带；相对的，在野生型中扩增到一条大带。根据三引物法的原理可以得知，所有d6pkl2-1单株均为纯合突变，所有d6pkl2-2单株均为杂合突变，而d6pkl2-3中大部分单株为纯合突变。

以野生型拟南芥为对照，取T3代纯合转基因株系叶片，qPCR验证AtD6PKL2的表达量，以AtUBQ5基因为内参，序列如下：

qAtUBQ5-F GACGCTTCATCTCGTCC(SEQ ID NO.24)

qAtUBQ5-R CCACAGGTTGCGTTAG(SEQ ID NO.25)

qAtD6PKL2-F2 CTCCCTATCCACTGTTCTTGA(SEQ ID NO.26)

qAtD6PKL2-R2 ACTTAGCTTGGCACTTCCAC(SEQ ID NO.27)

qPCR(图11)的结果显示d6pkl2-1和d6pkl2-3纯合突变体中AtD6PKL2基因的表达量显著低于野生型的表达量(P<0.001)。因此选取d6pkl2-1突变体株系中的纯合突变体进行下一步抗旱能力研究。

(6)VmD6PKL2转基因拟南芥干旱胁迫

停止浇水10d后，D6PKL2转基因拟南芥整体生长状态良好，d6pkl2突变体拟南芥出现干旱症状，野生型拟南芥也出现一定程度的干旱症状。如图12所示，干旱胁迫14d后，与D6PKL2转基因拟南芥相比，d6pkl2突变体拟南芥和野生型拟南芥萎蔫失水最为严重；而D6PKL2转基因拟南芥没有出现萎蔫症状，呈现出强抗旱能力。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> D6蛋白激酶D6PKL2的新用途

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2658

<212> DNA

<213> 千年桐(Vernicia montana)

<400> 1

ctttctttct ttacgtggta gacccaactt tctttcaacg atcaacacac tctcctcaaa 60

gaccaaacct tttttcatcc tttctctctc ttctctccac acattttagg gagggggagc 120

tctcacaatt ttccttcctt ttatctgtgt atacggtatt ctcttcaatg agtgtgttgt 180

gagtagcgag tagtgctttc tttaagcccc acaaccaaag caaaaacact ctcaaagctt 240

tgatcttttt gaaccaaccc aggaaatctg caaccatact gtttacatat ttgaagatga 300

aagcaagtag gactgctggt ggattggaca tgtttggggc tgagtaatgg gttttcccat 360

tttgatctat gtaataaatc tgctttcttt cgatggcctc aaaacccagt tctggaactt 420

ctccagaaaa gcaaaggaag cccagtggta atcagacacc agaaggaaaa ttccgccggc 480

cctcaccttt acagattaca aagacaagca aatcggagcc agttacccca agaaaaccac 540

ctcaaagtgt acaacaaatt gcatcaaaac aagtctctgt agtgaccaca gaggacaaga 600

aatcgctgat ttcccataaa tcagacaatg taagtttttt ggctgataaa gcatcttcag 660

gtttggcctt tgttgatcca aaacaagcgc caacttgtgt gggtcctgaa gtgagtcagg 720

ctagggactc accagaaagt agtgtggaac aagaaaataa aaatgtacag catgaaatta 780

gccctacttc tgctaaggtt agtgatggga ccagcagcct tgcaaagacc agtggaagtg 840

ccaaagttag tgaaagagcc gattttgttg agagtgggaa aagcagtgtg aacagaggga 900

gcacaagcag tgatgtgagt gatgaaagta cttgtagcag cttaagtagc agtgtcaaca 960

aacctcacaa agccaatgat atgcgatggg aagctataca ggcagtgcgt gcaaaagatg 1020

gtgtattggg tgtgaaccat tttaggctgt tgaagaggtt gggttgtggg gacattggaa 1080

gtgtgtatct ctcagagttg agtggagcaa agtgttattt tgcaatgaaa gttatggaca 1140

aagcttcttt agcaagtcgt aagaaacttc ttcgagctca aactgagaga gaaatactcc 1200

aatgtttgga ccatcccttc cttccaactt tatataccca ttttgagact gacaaattct 1260

catgtttggt tatggagttc tgccctggtg gtgacttgca cacacttcga caaaggcaac 1320

caggaaagca tttttctgaa cgggcagtaa agttctatgt agcagaggtt ctccttgctc 1380

tggaatatct ccatatgctt ggaattgttt accgtgacct taagccagaa aatgttcttg 1440

ttcgtgaaga tggacacata atgctttctg actttgacct ttccctccgc tgtgcagtga 1500

gcccaacgtt agtcaagtgt tcagtgcctg aaggcgaccc cttgcgaaag aacccagctt 1560

attgtgttca accagcttgc attgagccat cttgtattca gccatcatgt gtggccccta 1620

caacatgttt ttctcctcgt ctgttcttaa gcaaatccag aaaagaccgg aagcccaaga 1680

atgaagtggg aaaccaagtc actccgttgc cagagcttat tgcagagcca actgatgctc 1740

ggtccatgtc ctttgtagga acacatgaat acctggctcc tgaaatcata aaaggagaag 1800

ggcatggaag tgctgtagat tggtggactt ttgggatctt tctatatgag ctcttatttg 1860

gtaaaactcc ttttaaagga tctggcaatc gggccacatt attcaatgtt gttggccagc 1920

ctcttcgatt tccagaatca ccagttgtca gttttgcagc aagggatctt ataaggggtt 1980

tgcttgtgaa agaaccacag catagattgg catacaagcg aggggcaaca gaaataaagc 2040

aacacccatt ctttgaaggt gtgaattggg cattgatacg ctgtgctact ccacctgaga 2100

ttccgaagcc agtagaggtt gaacggatac ctgtgccagc atcaacaagc gaaaaaactg 2160

ctgctcgcgt tgtagttgct cctgataaaa aaggttcaga taattatctg gagttcgatt 2220

tcttttagat ggtattgctt gaaatttgca aattgttttc atttatgggg aagaattgtc 2280

tgaacctctg aggggttgtt ggtgacgagg ataaagtctt tcttttcttt ttctttttcc 2340

ccccttcttt tatatattga cagatgataa ggaaatgtat gcttgctgtt gcctgttaac 2400

tttacaaata tgtatctcat attgcagact gtcatagagg gacatgaaac cattttcact 2460

agattgtagt atcataaatt aggcattaac ctagctcttg ggaaggcttc cactgcttgt 2520

gtacaagaag catgggtggg tggtgtactt attggtacac tggtaaatga atagaaagtt 2580

agattttttg ctggatatga ttaggagaaa ttacaggtaa actaataaga atgtttgatt 2640

tttatccttg gaatgtcg 2658

<210> 2

<211> 611

<212> PRT

<213> 千年桐(Vernicia montana)

<400> 2

Met Ala Ser Lys Pro Ser Ser Gly Thr Ser Pro Glu Lys Gln Arg Lys

1 5 10 15

Pro Ser Gly Asn Gln Thr Pro Glu Gly Lys Phe Arg Arg Pro Ser Pro

20 25 30

Leu Gln Ile Thr Lys Thr Ser Lys Ser Glu Pro Val Thr Pro Arg Lys

35 40 45

Pro Pro Gln Ser Val Gln Gln Ile Ala Ser Lys Gln Val Ser Val Val

50 55 60

Thr Thr Glu Asp Lys Lys Ser Leu Ile Ser His Lys Ser Asp Asn Val

65 70 75 80

Ser Phe Leu Ala Asp Lys Ala Ser Ser Gly Leu Ala Phe Val Asp Pro

85 90 95

Lys Gln Ala Pro Thr Cys Val Gly Pro Glu Val Ser Gln Ala Arg Asp

100 105 110

Ser Pro Glu Ser Ser Val Glu Gln Glu Asn Lys Asn Val Gln His Glu

115 120 125

Ile Ser Pro Thr Ser Ala Lys Val Ser Asp Gly Thr Ser Ser Leu Ala

130 135 140

Lys Thr Ser Gly Ser Ala Lys Val Ser Glu Arg Ala Asp Phe Val Glu

145 150 155 160

Ser Gly Lys Ser Ser Val Asn Arg Gly Ser Thr Ser Ser Asp Val Ser

165 170 175

Asp Glu Ser Thr Cys Ser Ser Leu Ser Ser Ser Val Asn Lys Pro His

180 185 190

Lys Ala Asn Asp Met Arg Trp Glu Ala Ile Gln Ala Val Arg Ala Lys

195 200 205

Asp Gly Val Leu Gly Val Asn His Phe Arg Leu Leu Lys Arg Leu Gly

210 215 220

Cys Gly Asp Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Glu Leu Ser Gly Ala Lys

225 230 235 240

Cys Tyr Phe Ala Met Lys Val Met Asp Lys Ala Ser Leu Ala Ser Arg

245 250 255

Lys Lys Leu Leu Arg Ala Gln Thr Glu Arg Glu Ile Leu Gln Cys Leu

260 265 270

Asp His Pro Phe Leu Pro Thr Leu Tyr Thr His Phe Glu Thr Asp Lys

275 280 285

Phe Ser Cys Leu Val Met Glu Phe Cys Pro Gly Gly Asp Leu His Thr

290 295 300

Leu Arg Gln Arg Gln Pro Gly Lys His Phe Ser Glu Arg Ala Val Lys

305 310 315 320

Phe Tyr Val Ala Glu Val Leu Leu Ala Leu Glu Tyr Leu His Met Leu

325 330 335

Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Val Arg Glu

340 345 350

Asp Gly His Ile Met Leu Ser Asp Phe Asp Leu Ser Leu Arg Cys Ala

355 360 365

Val Ser Pro Thr Leu Val Lys Cys Ser Val Pro Glu Gly Asp Pro Leu

370 375 380

Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Cys Val Gln Pro Ala Cys Ile Glu Pro Ser

385 390 395 400

Cys Ile Gln Pro Ser Cys Val Ala Pro Thr Thr Cys Phe Ser Pro Arg

405 410 415

Leu Phe Leu Ser Lys Ser Arg Lys Asp Arg Lys Pro Lys Asn Glu Val

420 425 430

Gly Asn Gln Val Thr Pro Leu Pro Glu Leu Ile Ala Glu Pro Thr Asp

435 440 445

Ala Arg Ser Met Ser Phe Val Gly Thr His Glu Tyr Leu Ala Pro Glu

450 455 460

Ile Ile Lys Gly Glu Gly His Gly Ser Ala Val Asp Trp Trp Thr Phe

465 470 475 480

Gly Ile Phe Leu Tyr Glu Leu Leu Phe Gly Lys Thr Pro Phe Lys Gly

485 490 495

Ser Gly Asn Arg Ala Thr Leu Phe Asn Val Val Gly Gln Pro Leu Arg

500 505 510

Phe Pro Glu Ser Pro Val Val Ser Phe Ala Ala Arg Asp Leu Ile Arg

515 520 525

Gly Leu Leu Val Lys Glu Pro Gln His Arg Leu Ala Tyr Lys Arg Gly

530 535 540

Ala Thr Glu Ile Lys Gln His Pro Phe Phe Glu Gly Val Asn Trp Ala

545 550 555 560

Leu Ile Arg Cys Ala Thr Pro Pro Glu Ile Pro Lys Pro Val Glu Val

565 570 575

Glu Arg Ile Pro Val Pro Ala Ser Thr Ser Glu Lys Thr Ala Ala Arg

580 585 590

Val Val Val Ala Pro Asp Lys Lys Gly Ser Asp Asn Tyr Leu Glu Phe

595 600 605

Asp Phe Phe

610

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acacactctc ctcaaagacc aaacc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccaataag tacaccaccc accc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaaagagtg gaagcaaaca gtc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactcaacga atcagaagtc cct 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcctggtatg gttgtgacct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatcatcct tggagttgga 20

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Thr Gly Ser Lys Ala Ser Thr Lys Gln Ser Val Cys

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Cys Ala Pro Asp Lys Lys Gly Ser Asp Asn Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcagcagtcg aagagcatgg cctcgagaac tggca 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttagcgtgtg aagagcaaag aaatcgaact ccaga 35

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaaaaagc ctgaactcac cgcg 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctatttcttt gccctcggac gag 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctggtcgagc tggacggcga cg 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacgaactcc agcaggacca tg 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

attttgccga tttcggaac 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cggcagattt cactagagtc g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcatggagc tgaagtcgaa g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttcgccttt gatgatctct g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agtgacgaga gtagctgcag c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agtgttgggg tgaactgaca g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgctgcttca attacatgca c 21

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gacgcttcat ctcgtcc 17

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccacaggttg cgttag 16

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctccctatcc actgttcttg a 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acttagcttg gcacttccac 20

Claims

1.D6蛋白激酶D6PKL2在植物抗旱性调控中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述D6蛋白激酶D6PKL2为SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID No:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由其衍生的蛋白质。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因为如下(1)-(3)任一项所述的DNA分子：

(1)SEQ ID No:1自5’末端第45-2557位核苷酸所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No:3自5’末端第393-2225位核苷酸所示的DNA分子；

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述植物为茄科或十字花科植物。

5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述植物为番茄或拟南芥。

6.一种提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述方法通过提高D6蛋白激酶D6PKL2在受体植物体内的表达量，得到抗旱能力高于所述受体植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述方法包括将D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因导入受体植物使并其表达，得到抗旱能力高于所述受体植物的转基因植物。

8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述D6蛋白激酶D6PKL2为SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID No:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由其衍生的蛋白质。

9.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述D6蛋白激酶D6PKL2的编码基因为如下(1)-(3)任一项所述的DNA分子：

(1)SEQ ID No:1自5’末端第45-2556位核苷酸所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No:3自5’末端第393-2220位核苷酸所示的DNA分子；

10.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述植物为茄科或十字花科植物；优选的，所述植物为番茄或拟南芥。