CN101407818A - 一种玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种受甘露醇(mannitol)、氯化钠(NaCl)和脱落酸(abscisicacid，ABA)诱导的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白ZmCIPK2的应用；该玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2在GenBank接受号为EF158033。该基因能够提高植物的抗逆性；尤其是能够提高拟南芥的抗盐性和抗旱性。所述的因此所述的编码玉米蛋白激酶ZmCIPK2的基因ZmCIPK2在植物抗逆领域，特别是玉米的抗旱、抗盐领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

Description

一种玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种玉米蛋白激酶编码基因及其编码蛋白的应用。

背景技术

干旱缺水、盐渍等逆境因子是限制我国北方广大地区农、林、牧业生产的主要因素之一。近年来大量的研究表明，植物具有对逆境胁迫快速感知和主动反应的能力，这种快速感知和主动反应能力的获得是通过一系列逆境信息传递过程实现的。植物可以通过一系列的信息传递产生各种抗逆的生理、生化反应，以渡过短暂的不利环境。蛋白激酶是植物逆境早期信号转导途径中的重要元件。其中CIPK(Calcineurin B-like protein-Interacting Protein Kinase)是参与渗透胁迫、盐、低温、脱落酸(abscisicacid，ABA)和糖等信号转导途径的、植物所特有的一类蛋白激酶。拟南芥AtCIPK1与AtCBL1和AtCBL9交替形成两种复合体，分别调控ABA不依赖和ABA依赖的两种胁迫信号转导途径(The Plant Journal，2006，48：857-872)。

AtCIPK24(SOS2)与AtCBL4(SOS3)结合后，激活位于质膜上的Na+/H+反向运输器SOS1，在盐胁迫下，将胞内多余Na+运至胞外(PlantPhysiol，2002，128：544-55)。Ohta等(2003)发现(Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：11771-11776)

SOS2通过其C端临近但独立于NAF结构域的37个氨基酸序列PPI与2C类蛋白磷酸酶ABI2互作，而拟南芥abi2-1和abi1-1幼苗耐盐性增强，说明ABI2是SOS耐盐途径中的负调节因子，可能对SOS2的磷酸化底物起去磷酸化作用，或者对被上游蛋白激酶磷酸化的SOS2起去磷酸化作用。PPI序列在AtCIPK15、AtCIPK20、AtCIPK8和AtCIPK3中是保守的，而这些蛋白也都与ABI2或ABI1互作。Lee等(2007)的研究显示(ProcNatl Acad Sci USA，2007，104：15959-15964)，2C类蛋白磷酸酶AIP1与CBL-CIPK激活的AKT1互作并抑制其活性，说明AIP1对CIPK激活的AKT1有去磷酸化作用。水稻中有20个OsCIPK基因受包括干旱、盐、低温、渗透胁迫和ABA在内的至少一种胁迫的诱导。过量表达OsCIPK3、OsCIPK12和OsCIPK15的水稻植株分别在耐寒、耐旱和耐盐性上有显著提高(Plant Physiol.2007，144：1416-1428)。

玉米中有关CBL/CIPK研究的报道并不多，最近，Wang等(2007)在玉米中克隆得到了ZmCBL4基因，ZmCBL4与拟南芥AtCBL4同源性很高，过量表达ZmCBL4的拟南芥耐盐离子能力明显提高，这暗示CBL/CIPK信号转导系统很可能也存在于玉米中(Plant Mol Biol，2007，65：733-746)。相对于拟南芥和水稻来讲，有关玉米蛋白激酶的研究报道较少，其原因可能在于玉米基因组序列的复杂性。

发明内容

本发明提供一种受甘露醇(mannitol)、氯化钠(NaCl)和脱落酸(abscisicacid，ABA)诱导的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白ZmCIPK2的应用；该玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2在GenBank接受号为EF158033。该基因能够提高植物的抗逆性；尤其是能够提高拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期的抗旱性和抗盐性。

本发明的有益效果为：

本发明中，ABA、NaCl和甘露醇处理的玉米胚芽鞘中，所述的蛋白激酶ZmCIPK2均被诱导表达。本发明所述的蛋白激酶ZmCIPK2是属于CIPK类蛋白激酶，而CIPK类蛋白激酶是植物早期逆境响应的关键调控因子，所以调控CIPK类蛋白激酶的表达能够调节植物抗逆性。所述的因此所述的编码玉米蛋白激酶ZmCIPK2的基因ZmCIPK2在植物抗逆领域，特别是玉米的抗旱、抗盐领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1：玉米胚芽鞘中ZmCIPK2基因响应逆境胁迫的表达模式电泳图；

图2：ZmCIPK2基因植物表达载体构建过程流程图；

图3：转ZmCIPK2基因的拟南芥种子和对照在不同培养基中的发芽率柱状图；

图4：转ZmCIPK2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫超敏感的照片；

图5：ABA合成抑制剂对ZmCIPK2转基因种子和对照在不同培养基中发芽的影响的照片；

图6：转ZmCIPK2基因的拟南芥幼苗生长对ABA、渗透胁迫和盐敏感的的照片；

图7：转ZmCIPK2基因的拟南芥幼苗生长对ABA、渗透胁迫和盐敏感柱状图。

具体实施方式

实施例1：材料处理

玉米(Zea mays L.)品种：京玉7号；购自北京市农林科学院玉米中心。

玉米材料处理：

A.消毒：挑选饱满的玉米种子，用1％的次氯酸钠表面消毒5分钟，蒸馏水冲洗5遍，最后在蒸馏水中浸泡12小时，使其充分吸水。

B.发芽：将所述的充分吸水的种子在28℃，黑暗条件下发芽；具体的操作为：将所述的充分吸水种子播在铺有一层吸水棉的瓷盘中，上面再覆盖两层湿的吸水纱布，黑暗条件下生长三天。

C.胁迫处理：将发芽的种子进行ABA、甘露醇(mannitol)和NaCl胁迫处理；所述的处理中，ABA溶液的浓度为100μM，甘露醇溶液的浓度为600mM，NaCl溶液的浓度为250mM；处理的时间分别为2小时、6小时、12小时、24小时、48小时；胁迫处理后的玉米作为试验组，剪取主根及胚芽鞘做试验材料；采用未做胁迫处理的玉米幼苗作为对照组，剪取主根及胚芽鞘做试验材料。

实施例2：ZmCIPK2基因的克隆

A.玉米mRNA的分离和纯化

a.玉米主根和胚芽鞘的总RNA的提取

按照Invitrogen公司总RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent)(货号：15596-026)的方法分别进行提取，得到玉米主根和胚芽鞘的总RNA。

b.玉米主根和胚芽鞘的mRNA的分离纯化

按照Promega公司试剂盒(PolyAtract mRNA Isolation System III(withMagnetic Stand)货号：Z5300)方法，将所述的玉米主根和胚芽鞘的总RNA分别进行分离纯化处理，得到玉米主根和胚芽鞘的mRNA。

B.RT-PCR扩增玉米ZmCIPK2基因

a.玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA反转录

将所述的玉米主根和胚芽鞘mRNA，分别按照按照Invitrogen公司的SuperScript^TM RNaseH-Reverse Transcriptase产品说明分别进行反转录，得到玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA。

b.ZmCIPK2基因的PCR扩增

分别以所述的玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA作为模板，进行ZmCIPK2基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。

根据网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中玉米达序列标签(ExpressedSequence Tag，EST)信息和水稻的基因信息设计玉米的CIPK2基因的保守引物为：

上游引物：5’-GGATCCATGGAGAAGAAGCCGACC-3’；

下游引物：5’-AGGCCTTGATGGCTGAACCACTGA-3’。

PCR反应体系的组成为：

模板(约5ng)：1μl，上游引物：1μl，下游引物：1μl，10×Taq buffer：5μl，10×dNTP：4μl，Ex-Taq酶：0.5μl，ddH2O：38.5μl。

PCR程序为：

94℃    3min

72℃    2min

72℃    7min。

将所述的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶，在1×TAE电泳缓冲液中进行电泳。

c.电泳结束后，用QIAGEN GEL EXTRACTION KIT(#28704)试剂盒回收纯化所述的PCR扩增产物。

C.PCR扩增产物的检测

a.连接和转化：将所述的回收纯化的PCR扩增产物连接在pGEM-T载体上，并利用热击法转入大肠杆菌(E.coli)DH5α中；

c.提质粒：筛选抗性菌落后将其进行扩大培养，按照《分子克隆》(第三版)所述的碱裂解法小提质粒；

d.酶切验证：将得到的质粒利用限制性内切酶Bgl II进行酶切验证，检测到分子量约为3700bp的大片段和分子量约为1000bp的小片段，初步证明PCR产物为ZmCIPK2基因；

e.测序：将酶切验证正确的质粒进行测序，测序正确的质粒用于进一步构建其他载体。

本实施例中，也可以将PCR扩增产物用QIAGEN GEL EXTRACTIONKIT(#28704)试剂盒回收纯化后直接进行测序，测序正确的质粒用于进一步构建其他载体。

本实施例中所使用的各种限制性内切酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4连接酶均购自TaKaRa公司。

实施例3：ZmCIPK2基因的表达分析

A.本实施例中，利用RT-PCR的方法来分析ZmCIPK2基因在不同逆境条件下的表达情况。试验的样品为实施例1中所述的试验组和对照组中的玉米的胚芽鞘。

每个样品中，按照实施例2中所述的方法，提取5μg的总RNA并反转录成第一链cDNA作为模板。

根据ZmCIPK2基因序列分析设计得到的引物为：

上游引物：5’-CGTCATCCTCTTCGTGCTCCTC-3’

下游引物：5’-GGTGCTGCTGTCCTTGTGGTC-3’

PCR反应体系(25μl体系)的包括：

模板(约5ng)：1μl，上游引物：0.4μl，下游引物：0.4μl，1×PCR reactionbuffer，dNTP：0.2mM，Ex-Taq酶：1单位。

PCR程序为：

94℃    3min

72℃    1min

72℃    7min。

B.同时，分别以5’-CCATAAACGATGCCGA-3’和5’-CACCACCCATAGAA TCAAGA-3’作为上、下游引物来扩增玉米18SrRNA，扩增片段作为内参。PCR反应体系和程序如本实施例中所述。

C.将得到的PCR产物在1％浓度的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后用Higher Performance Ultraviolet Transilluminator(GDS-8000，GelDocumentation System，UVP，USA)对电泳条带亮度进行定量。目的条带与18S rRNA条带的强度比代表了目的基因的相对表达水平。

D.ZmCIPK2受逆境诱导表达分析

玉米胚芽鞘中ZmCIPK2基因响应逆境胁迫的表达模式见图1；

图1A表示用100μM ABA处理，图1B表示用600mM甘露醇处理，图1C表示用250mM氯化钠处理；图1A、图1B、图1C中，泳道1-5表示处理时间，分别为0小时，2小时，6小时，12小时，24小时。

如图1所示，在ABA、NaCl和甘露醇处理的玉米胚芽鞘中，ZmCIPK2均能被诱导表达。在100μM ABA处理下，随着诱导时间的延长，ZmCIPK2的表达量逐渐上升，到24小时时仍保持较高的转录水平(见图1A)。在600mM甘露醇诱导时间达12小时，ZmCIPK2的表达量达到最高值，随后有所降低，但在24小时时仍有表达(见图1B)。250mM NaCl处理2小时，ZmClPK2即有明显表达，12小时表达量升至最高，到24小时仍有较高的表达量(见图1C)。

本实施例中PCR反应及其检测所使用的仪器与实施例2中相同。

实施例4：ZmCIPK2基因转化拟南芥及转基因植株检测

A.植物表达载体的构建

将ZmCIPK2基因构建在含有dHA序列的PUC18载体上，然后把含有目的基因、dHA序列及CaMV35S启动子的片断构建在pGreen0029上，得到植物表达载体；同时构建仅含35S启动子的pGreen0029作为对照。

ZmCIPK2基因植物表达载体构建过程参见图2。在ZmCIPK2ORF两端引入酶切位点BamHI和StuI，以BamHI和StuI酶切本实验室保存的克隆载体pUC18，切除外源cDNA，同时酶切PCR产物BamHI-ZmCIPK2-StuI，回收，将基因与pUC18大片段连接，酶切验证连接正确，再以XbaI/EcoRI酶切连接产物和pGREEN0029，回收，将35S-ZmCIPK2-DHA-NOS片段连接入植物表达载体pGREEN0029，酶切验证连接正确并测序，酶切和测序结果证实ZmCIPK2已正确连接入pGREEN0029，并且在PCR过程中，ZmCIPK2序列没有发生碱基突变。测序正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，挑取能在筛选培养基上正常生长的GV3101单菌落，提取质粒，首先进行PCR验证，选取两管扩增出阳性条带的质粒再一次转化大肠杆菌，提取质粒，酶切验证正确，表明所述的植物表达载体已经转化进GV3101中，可以用来进行下一步的拟南芥转化。

B.农杆菌介导的基因转化拟南芥植株及其转基因植株鉴定

将含有所述的植物表达载体的农杆菌GV3101转入拟南芥(Arabidopsisthaliana，ecotype Colombia)中，进行转基因植株鉴定，鉴定的项目包括：抗性培养基初步筛选、PCR扩增进一步筛选阳性植株、West-blotting鉴定阳性植株；最终从通过West-blotting鉴定得到阳性植株中选出条带清晰的株系T3，收获其种子，进行实施例5和实施例6中的抗逆表型鉴定。可确定所述的株系T3为转ZmCIPK2基因植株。

本实施例中PCR反应及其检测所使用的仪器与实施例2中相同。

实施例5：转ZmCIPK2基因拟南芥的抗逆表型鉴定——种子萌发期表型鉴定

A.试验方法：

a.种子消毒：将实施例4中所述的转基因的拟南芥和对照的纯合体种子分别在70％酒精溶液中消毒2分钟，灭菌蒸馏水冲洗一次，再用11％次氯酸钠溶液消毒12分钟，灭菌蒸馏水冲洗5-6次。

b.MS培养基平板和在MS培养基的基础上分别添加有200mM甘露醇、500mM甘露醇、100mM氯化钠、150mM氯化钠、0.3μMABA、0.5μMABA、1.0μMABA、2.0μMABA和100μMABA的平板。

c.播种和培养：将对照和转基因种子点播在同一平板上，置4℃下层积处理4天，然后移置无菌培养间，竖直放置平板，23℃，16小时光照下生长。

d.发芽率统计：当胚根出现时开始统计发芽率，每天计数，连续六天。

e.ABA合成抑制剂(norflurazon，NF)：将ABA合成抑制剂norflurazon加入MS培养基、含200mM甘露醇的MS培养基、含100mM氯化钠MS培养基、含0.3μM ABA的MS培养基中，终浓度为100μM，播种对照和转基因种子于同一平板。

B.结果分析：

a.组成型表达ZmCIPK2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫超敏感

图4中，图4A-图4D分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在MS(A)、MS+0.3μMABA(B)、MS+100μM manntol(C)、MS+100μM NaCl(D)培养基上的发芽情况。

转ZmCIPK2基因的拟南芥种子在MS培养基上发芽率和对照相比没有明显差异，播种七天后发芽率均达到100％，子叶均完全展开，见图3和图4A，对照为转35S空载体拟南芥种子。转ZmCIPK2基因的拟南芥种子在MS+0.3μM ABA培养基上发芽率与对照相比明显降低，播种七天后对照发芽率为68％转基因种子发芽率为11％，见图3和图4B。转ZmCIPK2基因的拟南芥种子在MS+200μM mannitol培养基上发芽率与对照相比明显降低，播种七天后对照发芽率达到96％，转基因种子发芽率为79％，见图3和图4C。转ZmCIPK2基因的拟南芥种子在MS+100μM NaCl培养基上发芽率和野生型相比明显降低，播种七天后对照发芽率为82％转基因种子发芽率为36％，见图3和图4D。

ABA作为一种植物激素能促进种子成熟和休眠，抑制种子萌发(Finkelsteinet al，2002)。转空载体的拟南芥种子在MS培养基上播种7天后，发芽率达到100％，而在含0.3μMABA的MS上播种7天后，发芽率仅达到68％，甘露醇和盐胁迫下，转空载体的拟南芥种子发芽也受到抑制，甘露醇处理的发芽率虽然达到96％，但根和子叶的生长明显弱于未处理的，盐处理的转空载体拟南芥种子发芽率降至82％。与转空载体拟南芥相比，组成型表达ZmCIPK2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫更敏感，受抑制程度更大，发芽率分别仅达到11％，79％和36％。高渗透胁迫引起植物体内ABA合成增加(Leung et al，1998；Seo and Koshiba，2002)，因此认为高渗胁迫可能是通过ABA对种子萌发起抑制作用，也就是说可能转ZmCIPK2基因种子内ABA合成作用更强或ABA信号转导活性更强。

为验证转ZmCIPK2基因的拟南芥种子发芽对渗透胁迫的超敏感性是依赖于ABA的，在MS培养基中加入了ABA合成抑制剂norflurazon(NF)。

图5中，图5A-图5C分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在MS+100μM NF(A)、MS+0.3μM ABA+100μM NF(B)、MS+200μMmannitol+100μM NF(C)培养基上的发芽情况。

试验结果显示，在MS+100μM NF培养基中，转ZmCIPK2的拟南芥种子发芽率与对照相比没有明显区别，播种5天后发芽率均达到100％(幼苗失绿是ABA合成抑制剂norflurazon引起的)，见图3和图5A；在MS+200μM mannitol+100μM NF培养基中，播种5天后，对照发芽率达100％，转基因拟南芥种子发芽率为89％，见图3，图5B；在MS+100μM NaCl+100μM NF培养基中，播种5天后，对照发芽率达100％，转基因拟南芥种子发芽率为68％，见图3，图5C。

在抑制了ABA合成时，转空载体的拟南芥种子在不同培养基中的发芽率5天内均达到100％，受甘露醇和盐胁迫的转基因种子的发芽率也分别恢复到89％和91％，这说明甘露醇和盐对拟南芥种子发芽的抑制作用是通过使种子内ABA合成来实现的，与对照相比，高渗胁迫使转ZmCIPK2基因拟南芥种子内ABA合成量更多，这说明所述的ZmCIPK2基因对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥种子ABA合成途径起正调控作用。所以说，向拟南芥中转入所述的ZmCIPK2基因，能够提高拟南芥在种子萌发期的抗旱性和抗盐性。

实施例6：转ZmCIPK2基因拟南芥的抗逆表型鉴定——种子幼苗期表型鉴定

A.试验方法：将在MS平板上正常发芽的子叶刚展平的生长一致的幼苗在无菌条件下移至含有400mM甘露醇、150mM氯化钠和100μMABA的MS平板上，置培养间，竖直放置平板，23℃，16小时光照下生长。

一周后测量根长，计数真叶的叶数。

B.试验结果：转ZmCIPK2基因拟南芥种子发芽后的幼苗生长对ABA和渗透胁迫超敏感。

将在MS培养基中正常发芽的子叶刚展开的大小一致的转基因和对照幼苗移至MS和含100μMABA、400μM mannitol、150mM NaCl的MS培养基中，继续培养10天后拍照。

图6中，图6A-图6D分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在MS(A)、MS+100μMABA(B)、MS+400μM mannitol(C)、MS+150mM NaCl培养基上的幼苗的生长情况。

图7中，图7A表示转基因拟南芥幼苗与对照幼苗的平均根生长量；图7B表示转基因拟南芥幼苗与对照幼苗的平均叶数。相对根生长量是胁迫培养基中根生长量与MS中根生长量的比值，数据为三次重复的平均值和标准误差。

在MS培养基中，转ZmCIPK2基因的拟南芥幼苗生长和对照相比没有明显差别。播种10天后拍照，见图6A。在MS+100μMABA、MS+400μMmannitol和MS+150mM NaCl的培养基中，转基因幼苗生长受抑制程度均大于对照，见图6B、图6C和图6D。在MS+100μMABA培养基中，对照平均相对根生长量为92％，平均叶片数8片；转基因幼苗平均相对根生长量为50％，平均叶片数5片，见图7A和图7B。在MS+400μM mannitol培养基中，对照平均相对根生长量为76％，平均叶片数6片；转基因幼苗平均相对根生长量为53％，平均叶片数4.2片，见图7A和图7B。在MS+150mM NaCl培养基中，对照平均相对根生长量为25，平均叶片数4.3片，转基因幼苗平均相对根生长量为11％，平均叶片数3.3片，见图7A和图7B。

以上试验表明，转ZmCIPK2基因拟南芥种子发芽后的幼苗生长对ABA和渗透胁迫仍表现敏感，ABA不仅抑制种子萌发而且抑制萌发后幼苗的早期发育(Finkelsteinet al，2002；Lopea-Molina et al，2001)，与对照相比，ABA处理下的转ZmCIPK2基因幼苗生长明显受到抑制，而甘露醇和盐胁迫诱导植物体内ABA合成，所以转ZmCIPK2基因拟南芥发芽后幼苗早期发育阶段对甘露醇和盐的敏感性至少有一部分是依赖于ABA的，这说明ZmCIPK2对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥幼苗早期发育中的ABA信号转导起正向调控作用。所以说，向拟南芥中转入所述的ZmCIPK2基因，能够提高拟南芥在幼苗早期发育中的抗旱性和抗盐性。

脱落酸(abscisic acid，ABA)作为一种植物激素，几乎存在于所有高等植物中，不仅在植物种子成熟和休眠、气孔运动以及基因表达调控中起重要作用，而且在植物对逆境胁迫的反应中起重要的调节作用。ABA既是环境胁迫信号的诱导产物，又是胁迫信号的传导者，通过ABA使环境信号迅速级联放大。研究表明，ABA与干旱、高盐、低温、损伤、低氧、光照以及病原体侵染等多种生物和非生物胁迫有关，是植物体响应逆境胁迫信号并引起体内适应性调节反应和基因表达的重要因子。实施例5中和实施例6中，转ZmCIPK2基因的拟南芥种子发芽和发芽后的幼苗生长对ABA、甘露醇和氯化钠超敏感，ZmCIPK2对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥种子ABA合成途径起正调控作用，ZmCIPK2对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥幼苗早期发育中的ABA信号转导起正向调控作用。所以说，向拟南芥中转入所述的ZmCIPK2基因，能够提高拟南芥的抗旱性和抗盐性。

实施例1至实施例6中，玉米(Zea mays L.)京玉7号购自北京市农林科学院玉米中心，拟南芥(Arabidopsis thaliana，ecotype Colombia)种子购自国际上保存拟南芥种质资源的机构(ABRC Arabidopsis Biological ResourceCenter)，http://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/Facilities/abrc/abrchome.htm，大肠杆菌(E.coli)DH5α、质粒pUC18、pGreen0029、pGEM-T均购自Promega公司；

实施例1至实施例6中，主要分子生物学试剂：DNA凝胶回收试剂盒购自杭州V-gene生物技术公司；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、Ex Taq酶、DNA Blunting Kit、DNA Marker DL2000+15000购自宝生物大连有限公司(TakaRa产品)；TRIzol试剂.No.05596-026)购自Invitrogen公司；质粒pUC18、pGreen0029、pGEM-T均购自Promega公司。

实施例1至实施例6中，PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；DNA测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实施例1至实施例6中，所述的PCR反应使用PTC-100Peltier ThermalCycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。

实施例1至实施例6中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏筠著，科学出版社，1998)。

Claims (7)

1.一种玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗逆性。

2.根据权利要求1所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗旱性。

3.根据权利要求1所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗盐性。

4.根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥在种子萌发期中的抗旱性。

5.根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥在种子萌发期中的抗盐性。

6.根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥在幼苗早期发育中的抗旱性。

7.根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于：向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥在幼苗早期发育中的抗盐性。

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