CN113005106A - 玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用。本发明首次揭示了玉米耐低温基因ZmCIPK10.1参与正调控玉米抗寒性。在玉米中过表达ZmCIPK10.1基因，可增强转基因玉米的耐低温能力。本发明提供的ZmCIPK10.1基因及其编码蛋白为培育耐低温玉米新品种提供了宝贵资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定理论基础。该基因可用于培育耐低温植物新品种，具有潜在的应用价值。

Description

玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays L)属于禾本科玉蜀黍属玉米，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。玉米对寒冷非常敏感，特别是在早期自养生长阶段。低温下，玉米C4和卡尔文循环中酶的活性降低，抑制光合作用因，促进了耗散机制，影响了玉米叶片的抗氧化防御。寒冷胁迫会影响叶绿体和分生组织的发育，对后期生产造成不可弥补的损害。玉米耐寒性的生理机制仍然很大程度上未知，但近年来，首次发现了玉米幼苗耐冷QTL。利用转基因技术可以将内源或外源的抗逆基因导入需要改良的玉米遗传物质中，并使其后代表现出稳定遗传的抗逆能力。这可能有助于最终解开寒冷耐受的机制。

发明内容

本发明的目的是提供玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用。

本发明构思如下：通过对编码玉米内响应调节子的基因ZmCIPK10.1(全称为CBL-Interacting Protein Kinase)的研究，发现过表达该基因的转基因植株较野生型植株具有明显抗低温的表型。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供玉米耐低温基因ZmCIPK10.1或含有该基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用。

ZmCIPK10.1属于CIPK家族的蛋白激酶，通过与类钙调磷酸酶B蛋白CBL相互作用。玉米ZmCIPK10.1基因由1828个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第149位到第1828位碱基。该基因读码框只由11个外显子组成。

本发明中涉及的基因ZmCIPK10.1为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

具体地，ZmCIPK10.1基因的cDNA序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交的核苷酸序列。

本发明中，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选玉米、水稻、小麦、棉花、大豆等。

所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第二方面，本发明提供获得具有抗寒性的植物的方法，所述方法包括：

1)使植物包含玉米耐低温基因ZmCIPK10.1；或

2)使植物过表达玉米耐低温基因ZmCIPK10.1。

所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

进一步地，过表达基因ZmCIPK10.1的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过向植物中导入具有所述基因ZmCIPK10.1的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因ZmCIPK10.1的拷贝数；

3)通过将强启动子与所述基因ZmCIPK10.1可操作地连接；

4)通过导入增强子。

第三方面，本发明提供构建抗寒性转基因玉米的方法，所述方法包括将玉米耐低温基因ZmCIPK10.1通过质粒导入玉米中或通过基因工程手段整合到玉米染色体上。

进一步地，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导等方法将包含基因ZmCIPK10.1的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括：用重组表达载体转化农杆菌，然后用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，筛选阳性转基因玉米株系。

其中，所述重组表达载体的出发载体为pCAMBIA1300，所述农杆菌为EHA105。

第四方面，本发明提供一种鉴定植物的方法，所述植物是按照上述任一项方法获得的植物，所述方法包括：

1)测定所述植物是否包含玉米耐低温基因ZmCIPK10.1；或

2)测定所述植物是否表达玉米耐低温基因ZmCIPK10.1编码的蛋白质。

第五方面，本发明提供玉米耐低温基因ZmCIPK10.1或含有该基因的生物材料在改良玉米品种中的应用。

第六方面，本发明提供玉米耐低温基因ZmCIPK10.1或含有该基因的生物材料在耐低温植物育种中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次揭示了玉米耐低温基因ZmCIPK10.1参与正调控玉米抗寒性。在玉米中过表达ZmCIPK10.1基因，可增强转基因玉米的耐低温能力。该基因可用于培育耐低温植物新品种，具有潜在的应用价值。

本发明通过克隆ZmCIPK10.1基因并构建过表达ZmCIPK10.1基因的转基因玉米，对获得的转基因玉米的性状进行分析发现，过表达ZmCIPK10.1基因提高了玉米对低温的耐受能力。本发明提供的ZmCIPK10.1基因及其编码蛋白为培育耐低温玉米新品种提供了宝贵资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例3中过表达ZmCIPK10.1基因的转基因玉米植株抗低温表型；其中，左图为冷处理后幼苗表型，右图为冷处理后叶片损伤表型。处理条件为4℃下处理6天后，25℃回复1天后照相。

图2为本发明实施例3中过表达ZmCIPK10.1基因的转基因玉米植株的离子渗漏率统计。

具体实施方式

本发明通过提高ZmCIPK10.1基因的表达量，获得具有提高的抗寒能力的玉米。

构建抗寒转基因玉米的方法包括：提取玉米总RNA，并反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，F和R为引物，扩增ZmCIPK10.1基因的CDS序列，将扩增产物构建到植物表达载体上，然后用获得的重组表达载体转化农杆菌，接着用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，筛选阳性转基因植株，获得抗寒的转基因玉米。

其中，所述植物表达载体为pCUN；载体pCUN是在质粒pCAMBIA1300的基础上，通过在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因改造得到的。

引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。

所述农杆菌为EHA105。

以下实施例中使用的pBSK载体为常用的克隆载体，可市购；pCUN载体由中国农业大学生物学院作物功能基因组平台惠赠，pCUN载体是在pCAMBIA1300的酶切位点之间连入潮霉素抗性基因构建得到的(参见Guo et al.,2018Stepwise cis-regulatory changesin ZCN8 contribute to maize fowering-time adaptation.Current Bio.28,3005–3015)；农杆菌EHA105菌株由中国农业大学生物学院作物功能基因组平台惠赠(参见Ma etal.,2009Enhanced tolerance to chilling stress in OsMYB3R-2transgenic rice ismediated by alteration in cell cycle and ectopic expression of stressgenes.Plant Physiol.150,244–256)。

以下实施例中使用的主要试剂：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、、LBMedium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自TaKaRa，实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，并进行相关测序。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 ZmCIPK10.1基因过表达载体的构建和检测

为了解玉米响应低温的分子机制，从玉米B73基因组中克隆了ZmCIPK10.1基因。根据编码区序列分析，设计引物F和R，将该基因的编码区扩增出来，连接到具有35S启动子的表达载体pCUN(载体pCUN是在质粒pCAMBIA1300的基础上，通过在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因改造得到的)上。所用引物为(SEQ ID NO:3-4)：

上游引物F：5’-ATGGTGAGCGACGGCGCGCG-3’

下游引物R：5’-CAACGCAACCAAAGGCGTCG-3’

将ZmCIPK10.1基因连接到具有35S启动子的载体pCUN上的具体方法为：提取玉米总RNA，反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，利用上、下游引物将ZmCIPK10.1扩增出来，将PCR产物与pBSK载体相连，连接产物命名为ZmCIPK10.1-pBSK；利用SalI和KpnI将ZmCIPK10.1从测序正确的ZmCIPK10.1-pBSK酶切后回收连入pCUN载体，连接产物命名为35S:ZmCIPK10.1。将上一步所得的质粒酶切后，进行电泳检测，具体方法为：用SalI和KpnI酶切35S:ZMCIPK10.1，用1％琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳后，UVP Gel Documentation凝胶分析系统扫描成像。

实施例2 ZmCIPK10.1基因过表达玉米的构建和检测

将实施例1构建的含有ZmCIPK10.1基因的pCUN载体转化到农杆菌EHA105菌株中，再侵染玉米愈伤组织，得到转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan 50μg/mL，Rif 50μg/mL，Gen 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜，待OD₆₀₀值为1.0-2.0，以50g的转速室温离心15min，收集菌体；用2mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将玉米愈伤组织浸泡在农杆菌的转化液中，封口。放回光照培养架上正常生长至长出植株。然后进行筛选得到的种子进行低温逆境处理实验。

本实施例中分离得到过表达株系OE-126，OE-127，OE-130采用实时定量PCR检测所得过表达株系OE-126，OE-127，OE-130中ZmCIPK10.1基因的表达。

1)提取玉米总RNA，并反转录获得cDNA。

2)将反转录得到的cDNA稀释5倍后，用Takara试剂盒进行实时定量PCR，所用反应体系包括：2×SYBR Premix ExTaq buffer，0.2μL DyII，引物F、R各0.4μL，2μL cDNA模板，最后用ddH₂O补齐至20μL，充分混匀后放入ABI PRISM 75实时定量PCR仪中进行两步法进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃40s，40个循环。PCR反应完成后根据2^-Δ(ΔCt)的原理计算出野生型和过表达之间相对表达量并作图分析。在扩增所鉴定基因的同时，每个样品以玉米UBI作为内参基因同时扩增。

实施例3 过表达ZmCIPK10.1基因玉米的抗低温能力检测

首先将对照组CK和过表达株系OE-126，OE-127，OE-130的种子播种在黑土、进口土和蛭石(体积比1:1:1，进口土为德国进口草炭土Pindstrup Sphagnum Moss Peat)的长10cm，宽10cm，高10cm的小盆里，每个盆里放5粒，再覆2cm土放置于托盘中，浇水至土完全湿润，放置于23℃的培养室中，16h光照，8h黑暗。生长14d后进行4℃低温处理直到第二叶皱缩萎蔫后，将盆转移至23℃培养室恢复两天后，进行拍照，并取材进行离子渗漏率统计。本实施例中离子渗漏率的统计采用测定叶片的相对电导率L＝(S1-S0)/(S2-S0)。将低温处理后玉米的一整棵植株全部放到装有10ml蒸馏水的15ml离心管中，用真空泵抽气30min，然后置于220rpm摇床上室温摇1h，之后用电导仪测定其初电导值为S1，然后再将样品置于沸水中水浴15min，取出置于220rpm摇床上室温摇2h，再测定电导率记为S2。S0为空白对照蒸馏水的电导率。结果显示(图1、图2)，OE-126，OE-127，OE-130均表现出抗低温的表型。过表达ZmCIPK10.1基因能够使得玉米抗冻能力增强。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 玉米耐低温基因ZmCIPK10.1在提高植物抗寒性中的应用

<130> KHP191116557.6

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1828

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

cgacggctgc aggagacccg tataaatacg atctggtttc cgttcccaat ccccttcttc 60

cccgactcgc ccggcgctga ataagattcc cctgtattct gttccagaga tgagctgatc 120

gagcagcccg tcgccaagcc aaccggacat ggtgagcgac ggcgcgcgcg ggctgctggg 180

cgcgtacgag ctcgggcgga cgctcgggga gggcaacttc gggaaggtga agcaggcgcg 240

gcaccgcggc agcggcgggc agtttgccgt gaagatcatg gagcgcgcca gggtgctgtc 300

gcagcgcgcg gacgagcaga tatgccgcga gatcgccacg ctcaagctgc tcgcgcaccc 360

caacgtcgtc cgcctccacg aggtggctgc cagcaagacg aagatctaca tggtgcttga 420

gctcgtcaac ggcggcgagc tgctggacag gattcaggcg gccagtgagg gaaagctccc 480

ggagcaggag gcaaggaggc tcttccagca gctggttgat ggtgtaagct actgccatga 540

aaagggcgtc tgtcacagag acctcaagct ggagaacgtt cttgtcgacc ggaagggaaa 600

catcaagatc tctgatttcg ggctcagcgc tttaccgcaa catctcggga acgatgggtt 660

gctgcacacg acctgcggta gccccaacta cattgcccct gaggttctgc agaacagagg 720

gtacgacggg tcgctatcgg acatctggtc atgcggggtg attctctacg tgatgctcgt 780

agggcacctc ccgttcgacg accggaacat cgtcgttctc taccagaaga ttttcaaggg 840

cgatgctcag atcccggagt ggctctctcc cggcgcacgg aaccttctcc ggaggatcct 900

tgagcccgac ccggcggagc ggatcgccat ggcagagatc aaggcgcacc catggttcca 960

ggagcactac gtccctgtcc ttcctccgta cgacgacgac gacgaccacg attcagtgaa 1020

gcaaatcggt gcgggtagta aaaccactca tcacatcaac gcgtttcagt tgatcggaat 1080

ggcgtcgtcc ctagacctct cagggttttt tgaggaagag gacgtgtccc aaaggaagat 1140

caggttcacg tccgcacaac cgcctgagga tttgttcgcc gagatcgaac gctctgcgac 1200

tgacatgggc ttccatgttc acagagggca tagtaagctt aggctgacgc gaaactgcga 1260

ccggtcgaag aatcagaaga accctatgtc gtcgtcgtcg tcgtcgtttc tagtctgcac 1320

cgaggttttt gagcttagcc cctctttgta tgtcgtggag ctcaacaagt cccatggcga 1380

ccctgcactg tacaggcagc tctgtcagag gatctgcggt gacctaggtg tgctcgagat 1440

ggaccagatc tttgggacga ggccgccggt cgccgacgat ctcgcgggct tggccttggc 1500

gttggagaga cgatctgcga cgcctttggt tgcgttgtga cgaaaggctg cccccgccgg 1560

cccccctgac cgtgatgttt gtagcgtcag attatttagt gacgacgaag cagttcagct 1620

gcaacgcagc tcggaacggt tgtgtgatcc ctcccagaaa tagaggacaa ggtaaaagag 1680

tgtagccgta cacgtgtagg atcatgctcc aatgtaaata aagtggtagt agccaccgat 1740

gtaaaactga atgtaaaatc taagaaataa atcgtttatc cagtacacag aagctctata 1800

gtggtggtac tagagctatt tgtactaa 1828

<210> 2

<211> 463

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

Met Val Ser Asp Gly Ala Arg Gly Leu Leu Gly Ala Tyr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Glu Gly Asn Phe Gly Lys Val Lys Gln Ala Arg His

20 25 30

Arg Gly Ser Gly Gly Gln Phe Ala Val Lys Ile Met Glu Arg Ala Arg

35 40 45

Val Leu Ser Gln Arg Ala Asp Glu Gln Ile Cys Arg Glu Ile Ala Thr

50 55 60

Leu Lys Leu Leu Ala His Pro Asn Val Val Arg Leu His Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Ser Lys Thr Lys Ile Tyr Met Val Leu Glu Leu Val Asn Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Leu Asp Arg Ile Gln Ala Ala Ser Glu Gly Lys Leu Pro Glu

100 105 110

Gln Glu Ala Arg Arg Leu Phe Gln Gln Leu Val Asp Gly Val Ser Tyr

115 120 125

Cys His Glu Lys Gly Val Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Val

130 135 140

Leu Val Asp Arg Lys Gly Asn Ile Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser

145 150 155 160

Ala Leu Pro Gln His Leu Gly Asn Asp Gly Leu Leu His Thr Thr Cys

165 170 175

Gly Ser Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Gln Asn Arg Gly Tyr

180 185 190

Asp Gly Ser Leu Ser Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val

195 200 205

Met Leu Val Gly His Leu Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ile Val Val Leu

210 215 220

Tyr Gln Lys Ile Phe Lys Gly Asp Ala Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ser

225 230 235 240

Pro Gly Ala Arg Asn Leu Leu Arg Arg Ile Leu Glu Pro Asp Pro Ala

245 250 255

Glu Arg Ile Ala Met Ala Glu Ile Lys Ala His Pro Trp Phe Gln Glu

260 265 270

His Tyr Val Pro Val Leu Pro Pro Tyr Asp Asp Asp Asp Asp His Asp

275 280 285

Ser Val Lys Gln Ile Gly Ala Gly Ser Lys Thr Thr His His Ile Asn

290 295 300

Ala Phe Gln Leu Ile Gly Met Ala Ser Ser Leu Asp Leu Ser Gly Phe

305 310 315 320

Phe Glu Glu Glu Asp Val Ser Gln Arg Lys Ile Arg Phe Thr Ser Ala

325 330 335

Gln Pro Pro Glu Asp Leu Phe Ala Glu Ile Glu Arg Ser Ala Thr Asp

340 345 350

Met Gly Phe His Val His Arg Gly His Ser Lys Leu Arg Leu Thr Arg

355 360 365

Asn Cys Asp Arg Ser Lys Asn Gln Lys Asn Pro Met Ser Ser Ser Ser

370 375 380

Ser Ser Phe Leu Val Cys Thr Glu Val Phe Glu Leu Ser Pro Ser Leu

385 390 395 400

Tyr Val Val Glu Leu Asn Lys Ser His Gly Asp Pro Ala Leu Tyr Arg

405 410 415

Gln Leu Cys Gln Arg Ile Cys Gly Asp Leu Gly Val Leu Glu Met Asp

420 425 430

Gln Ile Phe Gly Thr Arg Pro Pro Val Ala Asp Asp Leu Ala Gly Leu

435 440 445

Ala Leu Ala Leu Glu Arg Arg Ser Ala Thr Pro Leu Val Ala Leu

450 455 460

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgagcg acggcgcgcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caacgcaacc aaaggcgtcg 20

Claims (10)

1.玉米耐低温基因ZmCIPK10.1或含有该基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用，其中，基因ZmCIPK10.1为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，优选玉米、水稻、小麦、棉花、大豆。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

4.获得具有抗寒性的植物的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)使植物包含玉米耐低温基因ZmCIPK10.1；或

2)使植物过表达玉米耐低温基因ZmCIPK10.1；

其中，基因ZmCIPK10.1的定义同权利要求1中所述。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，过表达基因ZmCIPK10.1的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过向植物中导入具有所述基因ZmCIPK10.1的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因ZmCIPK10.1的拷贝数；

3)通过将强启动子与所述基因ZmCIPK10.1可操作地连接；

4)通过导入增强子。

7.构建抗寒性转基因玉米的方法，其特征在于，所述方法包括将玉米耐低温基因ZmCIPK10.1通过质粒导入玉米中或通过基因工程手段整合到玉米染色体上；

其中，玉米耐低温基因ZmCIPK10.1的定义同权利要求1中所述。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含基因ZmCIPK10.1的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：用重组表达载体转化农杆菌，然后用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，筛选阳性转基因玉米株系；

其中，所述重组表达载体的出发载体为pCAMBIA1300，所述农杆菌为EHA105。

10.鉴定植物的方法，其特征在于，所述植物是按照权利要求4-9任一项所述方法获得的植物，所述方法包括：

1)测定所述植物是否包含玉米耐低温基因ZmCIPK10.1；或

2)测定所述植物是否表达玉米耐低温基因ZmCIPK10.1编码的蛋白质。

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