CN113121660B

CN113121660B - 玉米myb39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

Info

Publication number: CN113121660B
Application number: CN201911402494.5A
Authority: CN
Inventors: 杨淑华; 张晓燕; 施怡婷
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN113121660A

Abstract

本发明提供玉米MYB39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。本发明发现在玉米中过表达ZmMYB39基因，可增强转基因植物的耐低温能力，所述ZmMYB39基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1，其编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明克隆了ZmMYB39基因，并构建过表达ZmMYB39基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗冻性分析发现，过表达ZmMYB39能够提高冷响应基因表达，促进冷相关基因的表达，使玉米获得更强的低温的耐受能力。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制奠定一定的理论基础。

Description

玉米MYB39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种玉米 MYB39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。

背景技术

低温胁迫作为主要的外界环境因子之一,不仅影响植物的生长发育、地理分布，还严重影响作物的产量。玉米(Zea mays，L.)是一种极其重要的食物和能量来源。玉米抗低温胁迫能力由多个微效数量基因控制。拟南芥中关于冷响应反应的研究显示冷调节(COR)基因在植物耐冷性中发挥重要作用。同源性比对分析在玉米中也鉴定到了COR基因的存在。其中转录因子 DREB1/CBF同源基因，ZmDREB1A在玉米中被发现能够结合DRE/CRT顺式元件，调控冷响应基因的表达。该基因明显是由冷诱导后发生超表达，过表达ZmDREB1A基因能够赋予植物具有较高的抗逆性。

MYB蛋白是植物转录因子的一个大家族，其成员在植物生物学过程中具有多种功能。玉米R2R3-MYB基因家族进行了全基因组的调查。共鉴定出158个编码R2R3-MYBs的开放阅读框(ORFs)。通过对玉米、拟南芥和其他植物中R2R3-MYB家族的系统发育分析，这些MYB基因分为37个亚组。发明人对玉米R2R3-MYB基因家族成员的过表达株系进行冷表型检测，发现不同成员的表型不相同，例如ZmMYB8和MYB153均未表现出冷相关表型，说明该家族成员在调控逆境响应方面并没有功能保守性。表达谱研究表明，玉米R2R3-MYB基因表达模式多样，确认并扩展了该基因家族的序列和功能特征，将有助于今后对玉米中MYB基因家族的功能分析。

发明内容

本发明的目的是提供玉米耐低温基因ZmMYB39及其编码蛋白的应用。本发明通过对玉米冷相关基因ZmMYB39的研究，发现过表达该基因的转基因植株较野生型植株具有明显抗低温的表型。过表达植株中，冷响应基因ZmDREB1s的表达量发生明显上调。本发明的有益效果在于提供的 ZmMYB39基因为培育抗低温植物新品种提供了基因资源。

本发明的目的是提供ZmMYB39蛋白及其编码基因在玉米抗寒中的应用。为发掘玉米抗寒相关基因，本发明对玉米转基因过表达株系库进行冷处理筛选筛选出过表达ZmMYB39基因抗寒的植株。ZmMYB39属于R2R3 家族的转录因子。因此，本发明确定ZmMYB39基因可能为玉米抗寒的关键基因。为了实现本发明目的是提供了玉米耐低温基因ZmMYB39，通过在玉米中过表达ZmMYB39基因，获得抗低温的转基因植物。

本发明中涉及的ZmMYB39基因的序列为：i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；

玉米ZmMYB39 cDNA有1096个碱基组成。该基因的读码框为cDNA 自5’端第157位到第1096位碱基。该基因读码框只由3个外显子组成。由玉米ZmMYB39基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的ZmMYB39蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

本发明提供了玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用。

本发明提供了玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗寒性的转基因植物中的应用。

本发明提供了玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐冷种质资源改良中的应用。

本发明提供了玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高低温环境下植物存活率中的应用。

本发明提供了玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控玉米冷响应基因ZmDREB1s表达中的应用。

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、或重组菌。

本发明还提供含有植物耐低温的ZmMYB39基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。其中，含有ZmMYB39基因的过表达载体为含有Ubi启动子的pCUN载体。本发明还提供了一种转基因植物的制备方法，通过转基因方法提高ZmMYB39基因的表达量，获得具有提高的抗寒能力的植物。

具体所述转基因植物的制备方法包括如下步骤：

(1)扩增ZmMYB39基因的全长基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)；

(2)构建ZmMYB39基因的过表达载体；

(3)构建含有ZmMYB39基因的过表达载体的重组农杆菌；

(4)采用农杆菌侵染法，构建ZmMYB39基因过表达的转基因植物。

本发明提供的ZmMYB39蛋白及其编码基因在植物中的应用，其中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦、玉米。

本发明还提供了构建抗寒的转基因玉米的方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米表达或过表达ZmMYB39基因。

所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含ZmMYB39基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。

在本发明的实施例中，构建抗低温的转基因植物的具体方法为：

1)提取玉米总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R 为引物，扩增ZmMYB39基因，将扩增产物构建到表达载体pCUN上，获得的重组表达载体命名为pCUN-ZmMYB39；

2)用pCUN-ZmMYB39转化农杆菌EHA105，然后利用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，获得抗低温的转基因玉米幼苗。其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3和4所示。其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。所述玉米优选为 LH244纯合基因型的玉米植株。将本发明的ZmMYB39基因过表达后，玉米表现为抗低温的表型。

本发明克隆了ZmMYB39基因，并构建过表达ZmMYB39基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗冻性分析发现，过表达ZmMYB39能够提高冷响应基因表达，促进冷相关基因的表达，使玉米获得更强的低温的耐受能力。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制奠定一定的理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中玉米过表达株系低温处理恢复后植株生长情况照片。可以看到，苗均长势一致，冷处理后，ZmMYB39的转基因过表达株系相对于对照组LH244表现为极为明显的耐冷表型。

图2为qRT-PCR检测玉米过表达株系中ZmMYB39和相对受伤比率。 qRT-PCR结果显示ZmMYB39转基因过表达株系中ZmMYB39基因的表达水平显著高于对照组LH244，证实确实为过表达株系。相对受伤比率反映了受伤程度，ZmMYB39转基因过表达株系的相对受伤比率显著小于对照组 LH244，说明ZmMYB39转基因过表达株系耐冷。

图3为qRT-PCR检测玉米过表达株系中冷相关基因ZmDREB1s的表达量。DREB1s能够被低温快速诱导，是植物响应低温胁迫的关键调控机制。显示过表达株系中冷相关基因ZmDREB1s的表达量显著的高于对照组，与表型结果一致。柱状图中自左至右分别为CK和1-4号过表达株系。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若无特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的生化试剂、材料均为本领域市售可得或公知材料。以下实施例实验均重复3次，结果取平均值。

PCUN载体(参见Guo et al.，2018 Stepwise cis-regulatory changes in ZCN8contribute to maize fowering-time adaptation.Current Bio.28， 3005–3015))由中国农业大学生物学院作物功能基因组平台惠赠；农杆菌 EHA105菌株由中国农业大学生物学院作物功能基因组平台惠赠(参见Ma et al.，2009Enhanced tolerance to chillingstress in OsMYB3R-2transgenic rice is mediated by alteration in cell cycleand ectopic expression of stress genes. Plant Physiol.150，244–256)。

以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司； dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素 (Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、 LBMedium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自于TaKaRa，实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1 ZmMYB39基因过表达载体的构建和检测

根据编码区序列分析，设计引物F和R，将该基因的编码区扩增出来，连接到具有35S启动子的过表达载体pCUN上。所用的引物为：

上游引物F：5’-ATGGGGCGCTCTCCGTGCTG-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物R：5’-AATAATCTGGGGCAAATT-3’(SEQ ID NO.4)

将ZmMYB39基因连接到具有35S启动子的载体PCUN上的具体方法为：首先以cDNA为模板，利用上、下游引物将ZmMYB39扩增出来，将 PCR产物与pBSK载体相连，连接产物命名为ZmMYB39-pBSK；利用SalI 和KpnI将ZmMYB39从测序正确的ZmMYB39-pBSK酶切后回收连入pCUN载体，连接产物命名为35S:ZmMYB39。将上一步所得的质粒酶切后，进行电泳检测，具体的方法为：用SalI和KpnI酶切35S:ZmMYB39，用1％琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳后，UVPGel Documentation凝胶分析系统扫描成像。

将含有ZmMYB39基因的pCUN载体转化到农杆菌EHA105菌株中，再侵染玉米愈伤组织，得到转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan 50μg/mL，Rif 50μ g/mL，Gen 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜，待OD600值为1.0-2.0，以50g，室温离心15min，收集菌体；用2mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将玉米愈伤组织浸泡在农杆菌的转化液中，封口。放回光照培养架上正常生长至长出植株。

本实施例中分离得到过表达株系采用实时定量PCR检测所得过表达株系中ZmMYB39的基因表达。

1)提取植物总RNA，并反转录获得cDNA。

2)将反转录得到的cDNA稀释5倍后，用Takara试剂盒进行实时定量 PCR，所用反应体系包括：2×SYBR Premix ExTaq buffer，0.2μL DyII， 0.4μLPrimer(F/R)，2μL cDNA模板，最后用ddH₂O补齐至20μL，充分混匀后放入ABI PRISM 75实时定量PCR仪中进行两步法进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s；60℃40s；40个循环。PCR反应完成后根据2^-Δ(ΔCt)的原理在满足统计学意义的前提下计算出野生型和过表达之间相对表达量并作图分析。在扩增所鉴定基因的同时，每个样品以UBI作为内参同时扩增。实施例2过表达ZmMYB39基因植物的抗低温能力检测

将实施例1中所得的ZmMYB39基因过表达株系在23℃，16h光照，8h 黑暗的温室生长14天，移入4℃冷室冷处理，冷处理4-5天至对照组LH244 第二叶皱缩萎蔫程度达到50％，移至温室恢复2天。然后进行拍照和统计相对受伤比率。

结果显示(图1)，4个独立的ZmMYB39过表达株系均表现抗冻的表型。这说明ZmMYB39过表达植株的耐低温能力得到显著提高。

2)过表达ZmMYB39转基因玉米的抗低温能力检测

首先将对照组CK和过表达株系的种子播种在黑土，进口土和蛭石 (1:1:1)的长10cm，宽10cm，高10cm的小盆里，每个盆里放5粒，再覆2 cm土放置于托盘中，浇水至土完全湿润，放置于23度的培养室中，16h光照，8h黑暗。生长14d后进行4℃低温处理直到第二叶皱缩萎蔫后，拿出来放到23℃培养室恢复两天后拍照以及取材进行叶片受伤面积进行测定，该指标反映了玉米的耐冷性。结果显示见图1和图2，过表达株系的相对于对照组LH244，相对受伤比率仅为对照组的50％，均表现出抗低温的表型。

实施例3 ZmMYB39正调控冷响应基因ZmDREB1s

DREB1s能够被低温快速诱导，是植物响应低温胁迫的关键调控机制。本实施例对对照以及ZmMYB39过表达株系中的ZmDREB1家族成员 ZmDREB1.5和ZmDREB1.7的冷诱导情况进行了检测。具体方法如下：(1) 根据总RNA浓度,计算3μg RNA所需体积,加入1μL DNaseI,再加 DEPC ddH₂O至总体系10μL,37℃孵育25min使DNA消化,65℃15 min使DNase I失活。在上述10μL体系中加入3μL ddH2O和2μL 10μ M Oligo dT,吹打混匀,70℃反应5min,迅速置于冰上冷却。再向体系中加入5μL 5×反转录酶缓冲液,5μL 2.5mM dNTPs和1μL M-MLV反转录酶, 吹打混匀,42℃反应1hr,65℃15min使M-MLV反转录酶失活。反应结束即得到cDNA,保存于-20℃备用。将反转录得到的cDNA稀释5倍作为实时定量PCR模板,用Takara实时定量PCR试剂盒进行实验,扩增反应体系充分混匀,高速离心甩板10sec,放入ABI PRISM7500实时定量PCR仪中用两步法进行PCR扩增,反应程序为：95℃30sec,循环1次；95℃5sec,60℃34sec,循环40次。

PCR反应完成后，根据原理计算出野生型和突变体之间相对表达量并作图分析。在扩增鉴定基因的同时，每个样品以UBI作为内参基因同时进行扩增。新设计的引物需在PCR扩增反应程序结束后，再进行融解曲线检测引物特异性，程序为：95℃15sec，60℃1min，循环40次。结果显示， ZmMYB39过表达株系中，ZmDREB1.5和ZmDREB1.7的表达量均比对照组显著升高(图3)。与其耐冷表型相一致，说明ZmMYB39具有能够激活 ZmDREB1.5和ZmDREB1.7表达的作用。然后进行筛选得到的种子进行低温逆境处理实验。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 玉米MYB39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

<130> KHP191116551.0

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1096

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccacacagca aaaccacccg cgctccgcca atccagagag cgagccagcc cgagctcaca 60

cagcagcgag ctcggtcttc tcgccaggac acgaacacga ccccagcagg cggcaggcaa 120

gccacgctct ctcgacgggc ggacgttaat cgagacatgg ggcgctctcc gtgctgcgag 180

aagatggggc tgaagagggg tccgtggacg gccgaggagg acaggattct ggtggcgcac 240

gtcgagcgcc acggccacag caactggcgc gcgctgccca agcaggcggg cctgctccgc 300

tgcggcaaga gctgccgcct ccgctggatc aactacctgc gccccgacat caagcgcggc 360

aacttcagcc gggaggagga ggacgccatc atacagctcc accaaatgct cggcaacaga 420

tggtcgacaa tcgctgccag gctgccgggg aggacggaca acgagatcaa gaacgtctgg 480

cacacccacc tcaagaagcg cctggagcca aagccagcca gccagcaggc gcccaagcgc 540

aagcccacga agaagcagca gccgcagccg gagcccgagc ccgtaacgac gctcgagggg 600

ccggccggag ccgtgccgcc ggtggcgccg gagcggtcac tctccacgac gacgtcgacc 660

accaccagca ccgcggacta ctcgcccgcc tcgtcgctgg agaacgcggg cgacagcttc 720

acctcggagg aggactacta ccagatcgac gacagcttct ggtccgagac gctggccatg 780

acgacgacgg tggacagctt cgagtccggg gtgcagcagg cggagggcag cttcggcaag 840

tcggcggcgg cgccgtcgtc gaccaacgac gacatggact tctggctcaa gctgttcatg 900

caggccagcg acatgcagaa tttgccccag attatttagg cgggaaacgg acctagacgg 960

tttgttatct ctcggctgat gatgatattc attgggcgcg cgctcacgat tctttgaatc 1020

ttcgttctgc tccgttttcg gtggatgtat atatatccca ctgaaacctt gtgaagcgga 1080

aagcaattgc ttcgta 1096

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Arg Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Ile Leu Val Ala His Val Glu Arg His

20 25 30

Gly His Ser Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Ser Arg Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Gln

65 70 75 80

Leu His Gln Met Leu Gly Asn Arg Trp Ser Thr Ile Ala Ala Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Arg Leu Glu Pro Lys Pro Ala Ser Gln Gln Ala Pro Lys Arg

115 120 125

Lys Pro Thr Lys Lys Gln Gln Pro Gln Pro Glu Pro Glu Pro Val Thr

130 135 140

Thr Leu Glu Gly Pro Ala Gly Ala Val Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg

145 150 155 160

Ser Leu Ser Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Thr Ala Asp Tyr Ser

165 170 175

Pro Ala Ser Ser Leu Glu Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Ser Glu Glu

180 185 190

Asp Tyr Tyr Gln Ile Asp Asp Ser Phe Trp Ser Glu Thr Leu Ala Met

195 200 205

Thr Thr Thr Val Asp Ser Phe Glu Ser Gly Val Gln Gln Ala Glu Gly

210 215 220

Ser Phe Gly Lys Ser Ala Ala Ala Pro Ser Ser Thr Asn Asp Asp Met

225 230 235 240

Asp Phe Trp Leu Lys Leu Phe Met Gln Ala Ser Asp Met Gln Asn Leu

245 250 255

Pro Gln Ile Ile

260

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggggcgct ctccgtgctg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aataatctgg ggcaaatt 18

Claims

1.玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用；所述玉米MYB39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物材料为表达盒、载体或重组菌。

2.玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗寒性的转基因植物中的应用；所述玉米MYB39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物材料为表达盒、载体或重组菌。

3.玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐冷种质资源改良中的应用；所述玉米MYB39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物材料为表达盒、载体或重组菌。

4.玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高低温环境下植物存活率中的应用；所述玉米MYB39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物材料为表达盒、载体或重组菌。

5.玉米MYB39蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控玉米冷响应基因ZmDREB1s表达中的应用；所述玉米MYB39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物材料为表达盒、载体或重组菌。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述玉米MYB39蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物、单子叶植物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦、玉米。

9.构建抗寒的转基因玉米的方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米表达或过表达ZmMYB39基因，使该基因的表达程度相较于受体植物提高；所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含ZmMYB39基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。