CN113004381B

CN113004381B - ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

Info

Publication number: CN113004381B
Application number: CN201911325467.2A
Authority: CN
Inventors: 杨淑华; 施怡婷; 李卓洋
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN113004381A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。本发明发现玉米ZmbZIP68基因能够负调控植物抗寒性，通过降低ZmbZIP68基因的表达量，能够有效提高植物的抗寒性。本发明利用CRISPR/Cas9技术获得了具有优异抗寒性能的ZmbZIP68基因纯合敲除玉米株系，ZmbZIP68基因的抗寒功能的发现为培育耐冷植物品种提供了新的基因靶点和资源，对玉米的耐冷分子机制的研究具有重要意义，对农业生产具有重大意义。

Description

ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。

背景技术

随着世界耕地面积逐渐减少以及世界人口数量的增加，人类对粮食的需求越来越大。玉米作为世界三大粮食作物之一，其野生祖先是墨西哥类蜀黍，在距今九千年多年前首次被人类驯化，在距今4000多年前玉米开始出现在美国西南部地区，而之后玉米的种植区域开始向世界各个地区扩散，在这个过程中，玉米的种植环境由热带地区逐渐转移向亚热带及温带地区，伴随这这个过程中玉米生长的环境温度逐渐降低，然而玉米是一种对温度较为敏感的作物。在所有生物及环境逆境中，低温胁迫是影响农作物存活及产量的主要限制因子之一，低温胁迫对玉米苗期萌发及幼苗的存活和成熟期子粒灌浆过程具有重要影响。因此，研究玉米耐受低温胁迫的影响对玉米生产具有重大意义。传统的育种技术培育和改良耐胁迫性状难度相对较大，不能快速高效的得到优良的耐冷品种。而随着分子生物学技术的发展，以及对植物抗逆的分子机制的深入研究和人类在在基因工程研究中取得重大进展。采用转基因等基因工程手段向植物导入抗逆性外源基因或调控植物内源抗逆性基因的表达已成为改良植物抗逆性的新途径之一。

低温胁迫对于植物生长发育具有重要影响，低温胁迫对植物造成的损害分为零上低温造成的冷害以及零下低温造成的冻害，目前在拟南芥中应对低温胁迫的信号转导过程已有了一些研究，主要分为以CBF转录因子为核心的CBF途径以及不依赖CBF转录因子的途径，同时植物对低温胁迫的适应过程涉及到多种信号传导途径，其中，植物激素可能作为启动抵抗低温胁迫基因表达的关键激素。脱落酸(Abscisic Acid，ABA)作为植物体内重要的激素之一，早在20世纪60年代初被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素脱落酸(ABA)在植物生长发育的各阶段都发挥重要作用，包括种子休眠、萌发、幼苗生长、气孔运动以及营养生长向生殖生长转换等过程。而ABA在植物应对外界各种逆境胁迫响应中也起着重要作用，例如冷、盐/干旱以及机械伤害等非生物胁迫，以及病虫害等生物胁迫。植物响应ABA的过程非常复杂，随着科学研究的发展，更多参与ABA信号通路的组分被大量发现，一个崭新的ABA信号网络逐步呈现在人们面前。

bZIP(The basic region leucine zippers)转录因子包含两个保守的结构域，N端有16个保守的氨基酸残基，其中包含核定位信号及一个紧邻的N-x7-R/K序列能够识别保守的DNA序列，同时C端含有由串联的亮氨酸拉链结构组成的保守结构域，其功能是使转录因子可以与自身以及其他转录因子构成同源及异源二聚体，进而能够识别保守的DNA序列行使其对下游目标基因的转录激活功能。目前在拟南芥中已发现的bZIP类型的转录因子有78个，而在玉米种已克隆出的bZIP类型的转录因子已有128个。bZIP转录因子家族分为13个组，同时根据其识别的保守的DNA序列不同将bZIP转录因子分为四组，核心碱基为ACGT。bZIP转录因子广泛参与调控植物的生长发育和逆境应答过程，例如拟南芥中的ABF转录因子是一组典型的bZIP类型的转录因子，其作为ABA信号通路的重要组分能够通过响应植物体内的ABA信号转导过程调节下游靶基因表达量，进而调节植物体生长发育及抗逆过程。目前已克隆的玉米抗寒基因大多为正调控子，需通过转基因过表达的方式增强其抗寒性，存在不稳定性及应用受到限制的问题，而有效的负调控抗寒基因资源仍然非常有限，因此，鉴定负调控玉米抗寒性的基因，并通过基因敲除手段来提高玉米抗寒性性，具有重要应用价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。

本发明通过200余份玉米CRISPR/Cas9突变体库低温表型测试，筛选到一个在低温处理下能够明显抵抗低温胁迫的株系，通过序列鉴定发现与该株系抗低温胁迫性能相关的基因为bZIP类型的转录因子ZmbZIP68。ZmbZIP68蛋白与水稻中已鉴定的在低温下发挥调控作用的bZIP转录因子的氨基酸序列同源度较低(最高同源仅为33％)；进一步通过实验证明，ZmbZIP68负调控植物的抗寒性，降低植物中ZmbZIP68蛋白的表达量，能够显著提高植物的抗寒性。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物抗寒性中的应用。

本发明中，所述抗寒性包括抵抗/耐受零上低温或零下低温的性能。

具体地，所述抗寒性可表现为离子渗漏率或渗透式。

第二方面，本发明提供ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物在低温条件下的存活率和/或生长中的应用。

第三方面，本发明提供ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在提高抗寒性和/或产量的植物遗传育种或者在植物抗寒种质资源改良中的应用。

优选地，上述应用中，通过降低所述植物中所述ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性，提高所述植物的抗寒性和/或产量，或者提高所述植物在低温条件下的存活率和/或生长。

本发明中，所述ZmbZIP68蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为玉米的ZmbZIP68蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的ZmbZIP68蛋白的突变体。

本发明中，所述ZmbZIP68蛋白的cDNA具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为玉米中ZmbZIP68蛋白的编码基因序列。考虑到密码子的简并性，所有编码所述ZmbZIP68蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述ZmbZIP68蛋白的编码基因的抑制因子包括能够抑制ZmbZIP68蛋白表达的gRNA或干扰RNA。

优选地，所述gRNA的靶序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反义互补链的第1014-1033位或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1170-1189位。

更优选地，所述gRNA的编码基因包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

上述两个gRNA组合使用可实现利用CRISPR/Cas9技术高效敲除ZmbZIP68基因。

本发明中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

本发明提供含有所述ZmbZIP68蛋白的编码基因或其抑制因子的克隆载体或各类表达载体。本发明还提供含有所述载体的宿主细胞、含有所述ZmbZIP68蛋白的编码基因或其抑制因子的转化植物细胞或转基因植物。

第四方面，本发明提供用于编辑ZmbZIP68基因的gRNA，所述gRNA的靶序列为如SEQID NO.2所示的核苷酸序列的反义互补链的第1014-1033位或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1170-1189位。

优选地，所述gRNA的编码基因包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或包含如SEQID NO.4所示的核苷酸序列。

第五方面，本发明提供包含所述用于编辑ZmbZIP68基因的gRNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

第六方面，本发明提供一种提高植物抗寒性的方法，其为通过降低所述植物中所述ZmbZIP68蛋白的表达量，提高所述植物的抗寒性。

优选地，所述降低所述植物中所述ZmbZIP68蛋白的表达量为利用CRISPR/Cas9技术敲除所述植物中ZmbZIP68蛋白的编码基因。

更优选地，所述CRISPR/Cas9技术使用的两个gRNA的编码基因分别包含如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

第七方面，本发明提供一种抗寒玉米的选育方法，其为通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米中ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性降低；所述ZmbZIP68蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

优选地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述ZmbZIP68蛋白的编码基因的抑制因子的重组载体导入玉米，获得转基因玉米株系。所述抑制因子包括能够抑制ZmbZIP68表达的gRNA或干扰RNA。

更优选地，所述gRNA的靶序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反义互补链的第1014-1033位或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1170-1189位。

具体地，作为本发明的一种实施方式，所述抗寒玉米的选育方法包含如下步骤：

(1)利用如SEQ ID NO.5-6所示和如SEQ ID NO.7-8所示的引物，以pCBC-MT1T2为模板通过双引物扩增将两个gRNA连接至pCBC-MT1T2上，并将其进一步连接至pBUE411载体上，得到CRISPR/Cas9重组载体pBUE411-pCBC-MTaTb；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转化至农杆菌中，构建重组农杆菌；

(3)利用步骤(2)获得的重组农杆菌侵染玉米愈伤组织，获得抗寒玉米幼苗。

利用上述方法，本发明获得了ZmbZIP68基因的纯合稳定敲除株系，并通过自交得到去除CRISPR/Cas9背景的纯合敲除玉米株系。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述单子叶植物为禾本科植物。更优选为玉米。

本发明的有益效果在于：本发明发现玉米ZmbZIP68基因能够负调控植物抗寒性，通过降低ZmbZIP68基因的表达量，能够有效提高植物的抗寒性。本发明利用CRISPR/Cas9技术获得了ZmbZIP68基因的纯合敲除株系，相比于野生型玉米植株，ZmbZIP68基因的纯合敲除株系对低温逆境胁迫的耐受性显著提高，并且该敲除株系为去除CRISPR/Cas9背景的纯合敲除玉米株系，具有更高的稳定性和应用价值。ZmbZIP68基因的抗寒功能的发现为培育耐冷植物品种提供了新的基因靶点和资源，对玉米的耐冷分子机制的研究具有重要意义，为研究植物应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定一定的理论基础，对农业生产具有重大意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中ZmbZIP68基因的CRISPR/Cas9敲除突变体的鉴定结果示意图；其中OsUP代表启动子，OsU3t代表终止子，Target代表靶点序列，Target1代表序列Ta，Target2代表序列Tb；gRNA-Sc代表向导RNA序列内部包含Target序列；D169和D19分别代表两个敲除株系。

图2为本发明实施例2中ZmbZIP68基因敲除株系的耐低温表型；其中，D169和D19分别代表两个敲除株系，WT代表野生型玉米。

图3为本发明实施例2中ZmbZIP68基因的敲除株系的离子渗漏率和渗透势的测定结果；其中，A为离子渗漏率测定；B为渗透势测定；D169和D19分别代表两个敲除株系，WT代表野生型玉米。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LB Medium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自于TaKaRa；以下实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；以下实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1 利用CRISPR/Cas9技术构建ZmbZIP68基因的纯合敲除突变体

本实施例中所涉及的ZmbZIP68基因来源于玉米LH244自交系，其在玉米基因组中的序列如SEQ ID NO.11所示，由6735个核苷酸组成，其中第3010-3226、3297-4627以及4659-6509位均为内含子序列；其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例利用CRISPR/Cas9技术在玉米中敲除ZmbZIP68基因，构建的ZmbZIP68基因的纯合敲除突变体。

1、重组载体pBUE411-pCBC-MTaTb的构建

经筛选确定CRISPR/Cas9敲除ZmbZIP68基因的两个靶序列Ta和Tb，其中，靶序列Ta为如SEQ ID NO.2所示序列的第1014-1033位反向互补序列；靶序列Tb为如SEQ ID NO.2所示序列的第1170-1189位。设计扩增引物，通过双引物扩增以pCBC-MT1T2载体为模板(pCBC-MT1T2载体上有一部分片段含有控制T1靶点表达的终止子以及控制T2靶点表达的启动子)，将靶序列靶序列Ta和靶序列Tb连接在pCBC-MT1T2载体上，然后将扩增好的重组片段与pBUE411载体连接(Hui et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editingin plants,BMC Plant Biol.2014；14:327)。

引物序列如下：

BsF：5’-ATATATGGTCTCGATTGCATTACTGACCGCCTG AAT-3’；

F0:5’-GCATTACTGACCGCCTGAATGTTTTAGAGCTAGA AATAGC-3’；

R0:5’-ACGCGGTCACCGTGAGTCCGGCAATCTCTTAGTC GACTCTAC-3’；

BsR:5’-ATTATTGGTCTCGAAACGCGGTCACCGTGAGTCC GGC-3’。

用限制性内切酶Bsa1酶切pBUE411载体，使用上述两对引物以pCBC-MT1T2为模板进行四引物扩增，将扩增产物切胶回收得到连接片段，然后使用Soluton I连接酶进行连接，得到重组质粒。将得到的重组质粒送样测序，将经测序表明在pBUE411载体的酶切位点Bsa1间插入pCBC-MTaTb的DNA片段的重组质粒命名为pBUE411-pCBC-MTaTb。

2、ZmbZIP68基因敲除玉米的获得及初步鉴定

(1)转入pBUE411-pCBC-MTaTb重组载体以及转入pBUE411空载体的玉米植株的获得

将步骤1构建的重组表达载体pBUE411-pCBC-MTaTb和空载体pBUE411通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌采用由引物F0和引物R0组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有pCBC-MTaTb(PCR扩增的目的条带大小为1000bp左右)的农杆菌GV3101命名为pBUE411-pCBC-MTaTb-1。

采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal,1998,16(6):735-743.)将重组农杆菌pBUE411-pCBC-MTaTb-1转化侵染玉米野生型(LH244生态型)的愈伤组织，使用bar抗性进行筛选。

(2)ZmbZIP68的CRISPR/Cas9敲除株系的鉴定

对筛选获得的玉米株系进行鉴定，结果表明，利用pBUE411载体能够在T0代得到纯合稳定敲除株系，然后通过自交F2代得到去除CRISPR/Cas9背景的纯合敲除株系。

3、ZmbZIP68的CRISPR/Cas9敲除株系的测序鉴定

提取玉米野生型(LH244生态型)和ZmbZIP68敲除植株(D19和D169)的总DNA，利用PCR检测材料中ZmbZIP68基因的DNA序列差异。PCR扩增方法如下：

扩增ZmbZIP68基因的引物序列为：

ZmbZIP68RT-F1：5’-atggatctcaacgaatgcga-3’(如SEQ ID NO.2所示序列的第1-17位)；

ZmbZIP68RT-R1：5’-ctgcttacgggcacgggatc-3’(如SEQ ID NO.2所示序列的第875-894位的反向互补序列)。

PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

每个样品设置三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad PCR仪进行实验。

PCR反应程序如表2所示。

表2 PCR反应程序

使用1％琼脂糖凝胶电泳检测(电压：157V)扩增产物的条带大小为500bp左右，送测序公司进行测序。

ZmbZIP68的PCR扩增产物的测序结果示意图如图1所示，ZmbZIP68基因存在两种不同的敲除形式：敲除植株D169为在如SEQ ID NO.2所示序列的Ta和Tb两靶点间敲除169bp，敲除植株D19为在如SEQ ID NO.2所示序列的第1183-1201位点缺失同时在第1186-1188位点插入一个碱基，这两种敲除形式均导致移码突变，从而导致ZmbZIP68基因生物学功能的丧失。

实施例2 ZmbZIP68基因敲除株系的低温处理试验

1、低温胁迫下的生长表型检测

低温胁迫会造成玉米叶片损伤，同时也会造成叶片脱水皱缩。以野生型玉米植株为对照，对实施例1构建的ZmbZIP68基因敲除株系进行低温胁迫处理试验，具体如下：

将在23℃正常光照条件下生长的14天玉米幼苗(包含萌发出土3-4天)放置在4℃培养箱中处理3天，将处理后的ZmbZIP68CRISPR/Cas9敲除株系D19和D169及同批野生型(LH244生态型)放置在23℃恢复24h，然后进行表型观察和图片采集。结果如图2所示，结果显示，相对于野生型玉米植株，在低温处理后，D19和D169耐受低温胁迫的能力明显提高，表明ZmbZIP68基因敲除能够明显提高玉米耐受低温胁迫的能力(通过至少三次低温处理试验验证)。

2、植株离子渗漏测定试验

植物在受到低温胁迫后，低温能够对植物体细胞造成损伤，使其细胞膜对离子的选择透过性丧失或部分丧失，因此测定离子渗漏能够反应植物对于低温胁迫等多种逆境胁迫的耐受性。以野生型玉米植株为对照，对实施例1构建的ZmbZIP68基因敲除株系进行离子渗漏测定试验，具体如下：

将4℃处理2-3天的玉米幼苗，25℃恢复24h，取其地上部分放入15ml离心管中，加入10ml去离子水，使植株完全浸没在水面以下，23℃摇床120rpm 1h，使用离子渗漏检测仪进行测定，记为S0；然后将所有样品放置100℃水浴1h，23℃摇床120rpm 1h，然后再次对样品进行测定，记为S1；在测定每个样品前都要对仪器探头进行涮洗然后测定涮洗液(去离子水)的值，分别记为S2及S3；离子渗漏率的计算公式为：Ion leakage(％)＝S0-S2/S1-S3

本试验至少测定三棵同一株系的玉米幼苗并取平均值(三次实验，*表示差异显著，P<0.05)

结果如图3的A所示，ZmbZIP68基因敲除株系D19和D169的离子渗漏率明显低于野生型(LH244生态型)，与野生型相比，D19和D169的离子渗漏率分别降低了35.8％和30.28％，离子渗漏率是反应细胞膜完整性的生理指标，ZmbZIP68基因敲除株系中离子渗漏率明显降低，说明其细胞膜完整性更好。因此ZmbZIP68基因敲除株系D19和D169在低温胁迫处理下耐受低温胁迫能力较野生型明显提高。

3、渗透势测定试验

渗透压的维持是植物维持其自身内环境稳态的重要环节，当植物受到外界胁迫环境刺激后能够在细胞内积累保护物质，从而使其冰点渗透压升高。以野生型玉米植株为对照，对实施例1构建的ZmbZIP68基因敲除株系进行渗透势测定试验，具体如下：

对生长14天的玉米幼苗在4℃低温处理12h后使用注射器将玉米幼苗地上部分进行挤压，将汁液收集于1.5ml离心管中，12000rpm离心5min后除去上清，使用冰点渗透压测定仪进行测定。结果如图3的B所示，ZmbZIP68基因敲除株系D19和D169的冰点渗透压高于野生型(LH244生态型)，与野生型相比，D19和D169的冰点渗透压分别提高了90.2％和100.4％，渗透势是反应细胞内渗透调节物质的含量，渗透势高低与植物抗逆性成正比。ZmbZIP68基因敲除株系中渗透压高，说明其低温胁迫处理下耐受低温胁迫能力较野生型明显提高。

以上试验均证明了敲除ZmbZIP68基因能够显著提高玉米的耐冷性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> ZmbZIP68蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用

<130> KHP191116563.3

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Leu Asn Glu Cys Glu Arg Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asp Pro

1 5 10 15

Leu Ser Arg Gln Gly Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln

20 25 30

Asn Thr Leu Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Lys Asp Phe Gly Ser

35 40 45

Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser

50 55 60

Gln Ala Met Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Val Ser Ala

65 70 75 80

Leu Gly Ala Ala Val Asp Gly Gly Ala Ala Leu Gln Arg Gln Gly Ser

85 90 95

Leu Ala Leu Pro Arg Thr Leu Ser Val Lys Thr Val Asp Glu Val Trp

100 105 110

Arg Asp Phe Val Arg Glu Ala Pro Pro Gly Thr Ala Gly Gly Glu Glu

115 120 125

Pro Gln Pro Asn Arg Gln Pro Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu

130 135 140

Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Asp Asn Pro Ala Ala Ala Ala

145 150 155 160

Ala Ala Val Pro Ala Gln Pro Val Ala Pro Arg Pro Ile Gln Ala Val

165 170 175

Ser Asn Gly Ala Ser Ile Phe Phe Gly Asn Phe Gly Gly Ala Asn Asp

180 185 190

Ala Gly Ala Gly Ala Met Val Phe Ala Pro Val Gly Ile Gly Asp Gln

195 200 205

Ala Met Gly Asn Gly Leu Met Pro Gly Val Ala Gly Met Ala Gly Gly

210 215 220

Ala Val Thr Val Ser Pro Val Asp Thr Ser Val Ala Gln Leu Asp Ser

225 230 235 240

Met Gly Lys Ser Asp Glu Asp Leu Ser Ser Pro Met Ala Pro Val Pro

245 250 255

Tyr Pro Phe Glu Gly Val Ile Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ala Gly Val

260 265 270

Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu

275 280 285

Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Met Glu Leu

290 295 300

Glu Ala Glu Val Gln Lys Leu Lys Glu Gln Asn Ala Glu Leu Gln Lys

305 310 315 320

Lys Gln Glu Gln Ile Met Glu Met Gln Gln Asn Gln Val Pro Glu Leu

325 330 335

Val Ser Asn Pro Tyr Ala Gln Lys Lys Arg Cys Leu Arg Arg Thr Leu

340 345 350

Thr Gly Pro Trp

355

<210> 2

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggggcagcg tggcagtggg tgtgcgggcg cgtgcatcaa cgcagacgat ccgggcgact 60

tcacgttatc agttagcacg tacacgcaca ccgccggcac cggcgtcggg agggacacct 120

gtcgcccgcc gcactctgac ctccgccccc gccgcgcgag acgacagcgc ccgcaccaag 180

acgaggcaac tcggcgagcg ggacaggtgc tgccagcgcg agcctcctcc cacccaaccc 240

caacaccacc accaccagac accagtccac cactaccact gaggcgagcc ggaggcgcac 300

acaggcacag cacagtccgg gcccgtgcct tccaattcgg tcgtcgcaca catcgattga 360

gcccgcgcac gagcccatcg ctttcgcttt ggcgtcttcg agaacccgca agcaacctat 420

atagcccgcc gcgaattccg cctggcttcc tcgtcgcccg cctcgtcgtc gcgccgcagt 480

gagaggaggg ggaggcgatg gatctcaacg aatgcgagag gagggggccg gcggggccgg 540

atccgctgtc gaggcagggg tcgatctact cgctcacgtt cgacgagttc cagaacacgc 600

tcggcgggat ggggggaggg cttggcaagg acttcggctc catgaacatg gacgagctgc 660

tgcggagcat ctggaccgcc gaggagagcc aggccatggc gtcggcttcg gcctcggcct 720

cggcctcggt gtccgcgctg ggggcagccg tcgacggcgg ggcggcgctg cagagacagg 780

ggtctctcgc gctgccgcgc actctcagcg tcaagacggt ggacgaggtc tggcgggact 840

tcgtgcggga ggcgccgccc gggacggctg gcggcgagga gccgcagccc aaccgacagc 900

cgactctcgg ggagatgacg ctggaggagt tcctggtcag ggccggggtc gtccgtgaca 960

accctgccgc ggcagctgct gctgtccctg cgcagccggt tgctccacgg ccgattcagg 1020

cggtcagtaa tggcgcctcc atctttttcg gcaactttgg gggcgccaat gacgccgggg 1080

ctggagcgat ggtgtttgcg ccggtgggga tcggggatca ggccatgggc aacgggttga 1140

tgcctggggt ggctgggatg gcaggtggtg cggtcaccgt gagtccggtg gatacgtcgg 1200

tggcccagct ggattctatg ggcaagagcg atgaggatct gtcatcgcca atggctccgg 1260

tgccataccc ctttgaggga gtgataaggg gaaggaggag cggtgcgggt gtggagaagg 1320

ttgtggagcg gcggcagagg aggatgatca agaacaggga gtctgcagct agatcccgtg 1380

cccgtaagca ggcttataca atggagttgg aagccgaagt tcagaaactg aaggaacaaa 1440

atgcagaatt gcagaagaag caggaacaaa taatggagat gcagcaaaac caggtcccgg 1500

aattggtcag caatccatat gcacaaaaga agcgatgcct gcggagaaca ttgacaggtc 1560

cctggtaact gagttgttgt tgatcggact cgacaggata tttaacatta tggtacttgt 1620

acattcttca ggatttggag aacccaaatt tctgttgtat attagcgatc aacagagtcg 1680

aatgtaccag tgcataactt tcttctcctg acactatgcc tcctcgattc atttctgcaa 1740

gtctggtaga tttattgcac ttctgcgccc tcgtgctcct taatactccc tgatgaacga 1800

ctagtaactg tgggatttca taggaacaga gatgcgtgtc aggattgaag tggtaagttt 1860

caggattgaa gtttg 1875

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattactgac cgcctgaat 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggtcaccg tgagtccgg 19

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatggtc tcgattgcat tactgaccgc ctgaat 36

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcattactga ccgcctgaat gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgcggtcac cgtgagtccg gcaatctctt agtcgactct ac 42

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attattggtc tcgaaacgcg gtcaccgtga gtccggc 37

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggatctca acgaatgcga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgcttacgg gcacgggatc 20

<210> 11

<211> 6734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatttatttc taatcctaac tccgggtgaa gtgcgtgtcc aaagtttata attttcaggt 60

ttctcctatt caccccctct aggtgacttt caaaatacaa acctaggcac aaaagaaact 120

agatgttaat gaaattgcaa gatcataaat ctaattaact ataacatggg aggagtaatt 180

tggtccatag tattcactaa ctcacttagc aatgacatga tctagtatga tgcatagcat 240

aatatgcacc cttcctttgt caagtctcca aattcctatt cacccccctc ttgccttggc 300

ttgcttgttc atcttgatgg ccaccaactt gtgatttttc ttctttttca acaagtatgg 360

tgtagtggct ttcttatcaa ccttgttggt gtgggagtta gagagtttgg ttattttttg 420

tcatacccag ttttaagagt aaaaccgaat gcatagcata tgtgtgtcag gatctatttc 480

cacacatatg ttgatgtcag aagtgtaata tatcaaaaaa acaatgcata aaagcgtaaa 540

taaatattat taacatatta cacttcgaac agacataatg tcttaacctt tattcatcaa 600

agttcaacga aacatgagca tccttccacg tgaagatgac cgaagaaatc actagactag 660

tatccaacaa gttcatcatc ataatcttta tctccaacct tttgatcaaa attaatcaag 720

tgtgagctta cttatgatgg aggctcagca attagaatga aaatgcaaag ttaacaagat 780

aagactaagg gggtgtttgg ttaccccaaa ttaaaattta gcctctgtca tatcgaatgt 840

ttgaacctcc gttccgggta ttaaatgtag tcggattata aaactaattt ctcagccgaa 900

gattaaaaga cgagacgaat ctagtccagt tggttgggtc tatatttcat actcctattt 960

gaaagtcaaa tgcttgatgt gacccggacc aaacaccccc taagggcttg ttcggttatt 1020

cccaatacac atggattgga tgggattgga aaaaattgag aagaagtttg acttgtttgg 1080

gattcaaacc catccaatcc cactcaatcc acatggattg agagctaacc gaacaagccc 1140

taaagtttaa cgatatgtaa aatcaactga ttattcctag ttctgaacca ccggtgcacg 1200

aggaacagtt ccatggtagc caagatctgg ttggtacgat gcttccgtga atgcgcctac 1260

cccgcgcacc tgcccactga cacccaccaa gaccaactga tgcctcggcc ccatgctgcc 1320

ctggcccact cgccggcggt acggccgcgg cggcaccaac cggggtggcg tgcctcgtag 1380

gtgacttatg ttcttgtcgg ggagtaaaaa atggctgcca acggaggtgc tgtgactgct 1440

gctgcccccc cccccccccc cccacacaca cacacacacg tctcgcgctt tgattggcct 1500

gacgtcgcct ctaccggctc gatcctgggt gcgccgccac gtagtacgcc cttccgcctc 1560

cactgcggca cgcactgcct acccctccct cccccggacg ggccggaccc tctgcgacag 1620

gggcagcgtg gcagtgggtg tgcgggcgcg tgcatcaacg cagacgatcc gggcgacttc 1680

acgttatcag ttagcacgta cacgcacacc gccggcaccg gcgtcgggag ggacacctgt 1740

cgcccgccgc actctgacct ccgcccccgc cgcgcgagac gacagcgccc gcaccaagac 1800

gaggcaactc ggcgagcggg acaggtgctg ccagcgcgag cctcctccca cccaacccca 1860

acaccaccac caccagacac cagtccacca ctaccactga ggcgagccgg aggcgcacac 1920

aggcacagca cagtccgggc ccgtgccttc caattcggtc gtcgcacaca tcgattgagc 1980

ccgcgcacga gcccatcgct ttcgctttgg cgtcttcgag aacccgcaag caacctatat 2040

agcccgccgc gaattccgcc tggcttcctc gtcgcccgcc tcgtcgtcgc gccgcagtga 2100

gaggaggggg aggcgatgga tctcaacgaa tgcgagagga gggggccggc ggggccggat 2160

ccgctgtcga ggcaggggtc gatctactcg ctcacgttcg acgagttcca gaacacgctc 2220

ggcgggatgg ggggagggct tggcaaggac ttcggctcca tgaacatgga cgagctgctg 2280

cggagcatct ggaccgccga ggagagccag gccatggcgt cggcttcggc ctcggcctcg 2340

gcctcggtgt ccgcgctggg ggcagccgtc gacggcgggg cggcgctgca gagacagggg 2400

tctctcgcgc tgccgcgcac tctcagcgtc aagacggtgg acgaggtctg gcgggacttc 2460

gtgcgggagg cgccgcccgg gacggctggc ggcgaggagc cgcagcccaa ccgacagccg 2520

actctcgggg agatgacgct ggaggagttc ctggtcaggg ccggggtcgt ccgtgacaac 2580

cctgccgcgg cagctgctgc tgtccctgcg cagccggttg ctccacggcc gattcaggcg 2640

gtcagtaatg gcgcctccat ctttttcggc actttggggg cgccaatgac gccggggctg 2700

gagcgatggt gtttgcgccg gtggggatcg gggatcaggc catgggcaac gggttgatgc 2760

ctggggtggc tgggatggca ggtggtgcgg tcaccgtgag tccggtggat acgtcggtgg 2820

cccagctgga ttctatgggc aagagcgatg aggatctgtc atcgccaatg gctccggtgc 2880

catacccctt tgagggagtg ataaggggaa ggaggagcgg tgcgggtgtg gagaaggttg 2940

tggagcggcg gcagaggagg atgatcaaga acagggagtc tgcagctaga tcccgtgccc 3000

gtaagcaggt cacacccttt tcctgaactc ttgcatgtgt tgcatcagta gtagttgttt 3060

cttattgcaa gttgcttctg ataaataagc acattggcct tgtctatgcc ctgtccaaat 3120

caacggatat ttgattaggt agtaaggtag actcacatct ggcctagcct atcacatttg 3180

caacttcgac acataacctg ttgcttatat ctgttacgaa tgtaggctta tacaatggag 3240

ttggaagccg aagttcagaa actgaaggaa caaaatgcag aattgcagaa gaagcaggta 3300

tataccatgt tgtacaattt ctgtacagtg aagagtattt tctgtcactt aacggaaagg 3360

gattctgatc acatttgcat gcctggctca atgttaattg cagcagttct ttcacagatt 3420

ttggtaaaat aacatatgtt tatttattta gtaaagttac agtgattttt ccttaagggt 3480

tggactgttg gaagttgggt acagaagatt gtttactttg aatagttcta cttttaaaaa 3540

gctaaattct atggtgatgt acgtttgaac aagtgtcatg tagaatttct ctgaatcatt 3600

tataggtgat ttccacaatt gatatgagca caactaaatc taagaaaaac ttgaaaaggt 3660

aaaatcgttt caagaattaa gtggagattt tattcaaatg atcaacattt taaaagaagc 3720

gccactcttt ttaaaaaaac tgttgccgag ctgggcttta attgaagaac ttagttaaga 3780

agtaagatta gcatgaattt tctctttaaa tatatataga tcttgaattt cagtgtctct 3840

tggagttgga gtccatttta ccatcatact tacagatgtt tcatgccaag agtttttttt 3900

gttgaacttc tgcatagctt ttaattgtta gcatgctttg aatactgcac tttcaatagt 3960

actttgtctg gaacgacatg agattgcaca tatgtgtctt tgtttctctt cccaccaggt 4020

agacctagtc ccttgtgttc tgtctaccgg cccatctcaa tcccaaattg cttttccctg 4080

aactccatcc atttgagtga agcaacaaaa aatgatgcat ggactaactt tttggctctt 4140

aaatatcatt ttagggaagg gaaacattga ggccttgagg gcctatttgg ataggatcta 4200

gggaaattcc ccttaccgaa ataaggggag cattcctttt ttatgaaagg agcagtccta 4260

ttttgatggt cttatggagt catgattatt ctatcctcca aaataatcac caaaagtaaa 4320

atggacaaaa caccattcac cagtgctgtt ctgcaaagtt tgaactatgg tactttaatt 4380

actaatactt gttcgtcagg aattttgaat gaacatcaat tatgaacatt tccttattga 4440

gtggggtaga tatatctttc agtaaaaatt atttcccctg tcgcatctac attcaaaatt 4500

cctatcattg tcattcttta atctttatat acatctctct gtggatgcca ttagcacaat 4560

aatgttttct cgaacgtagc acaataatgt tggagtttcc taatcttgtt tgttttcttg 4620

aaccgtagga acaaataatg gagatgcagc aaaaccaggt agattttttt gttaaacttc 4680

cattgttgat gtttcttttt cattgcacac taaagatgga tacattcctg ttttcaaata 4740

gtgaatttca gtgcttattc acttagcaat tggataactg atggaaacta ggttgctatg 4800

ctgttttttt ttcaatatag atgcattctt ccatgacatt ggtttaaccg gtgtggtggg 4860

tttatgtttg cttgtccatt gctggatttt ttgtgcattt agaaaatggc gttgctgttg 4920

tattagcaaa gcccactgcc agtgatggtg aaattgcaaa ttcctcaact aaaaagtggt 4980

tgtaagacca taagatatgc attttaaagg gagttaggta tagcagtttg gactgatgca 5040

tttatgtaag gaaatacctt gtacaattgg cgggagcggg actgagcctg ctcagttgtt 5100

acaccatagg tataccaagt acctgagaga cagcagcctt ttctgagcct tatgaattat 5160

catggaaata tccaactttc acattgtcat tgaattccac atttcgaagg tactgataac 5220

tgagacccac atgatatcct tatgtggttc tgctggctaa aggtgattca cttttatgcc 5280

agatatacca gctcatacga attagtatag ttgtctgata atatgtacaa attatatttg 5340

tgtaacttct ttataatgac ttgaaaaagc atagcatcta ccgttacaac gattttgagc 5400

acaagtgtac ttctcttaaa tttgcgcaac actgtgtttc taatgacttc tatatgcatt 5460

gttatccttg aacatgctaa atggaaaaat gaaattcagt caaatgagta ggctttgagt 5520

ttttaaaaat gtgtactttg agactaatgc catgaatgca gatgttaatt gctctctctt 5580

tatcatgtca gctgtaccaa aaattgcata atgtttgtga cactgaataa acgtttgtct 5640

acattggctt tagttgtagc ttcttccttc tccctcttag tttagtagga gtatatgtta 5700

cacaatgttc cagtggtcat cgagagcttt gggtatcaca cgcttaatta tgttctgttg 5760

attcttaaaa atagcggtac atggtttcgt ccatgtatcc tggtaattgg ggttatggtt 5820

atcacagtaa ctagggtgtt gtttggttgt gtaatttgac tggcaaatgg aaaagaagta 5880

agctactact cagattgttt ggttcagctc aggtaagacc tggtatccta ttacactttg 5940

ggcctagttt ggatactcta gtaatgagtg ggattggagt ggattgagat gtattgagac 6000

agtatttgat ctattaggga tttacaccct cttcaatccc tccaaaacac tctaatccta 6060

aagtatccaa actaggcctt gatgagaggg gtattggata acactccatt ttctacattc 6120

ccgtatctga ttagcacatt acgttgtggc tcaaacaaac gcaatgcaac ataatcggtt 6180

gccgttgtaa tcaaatcgcg ttacatccca ccgaaccaaa cagcacatac aatctagttg 6240

tttggctagc aaaccttgtg aatataactg gtcagatggg gtggggggca tgccctctcg 6300

catgggctga gtgtgaaagc cataatccat gactgccacg attgtaggtg ttatgttttc 6360

aaagattttt tttcttttcg attccattgt gcaggtgtgc aagtttacat gtgtcagttt 6420

tcttttcaaa atcctctggt acatttattt gcacatgata aagttgtctt gtttagatac 6480

ctgatcacaa agcttgcctc cgaacaggtc ccggaattgg tcagcaatcc atatgcacaa 6540

aagaagcgat gcctgcggag aacattgaca ggtccctggt aactgagttg ttgttgatcg 6600

gactcgacag gatatttaac attatggtac ttgtacattc ttcaggattt ggagaaccca 6660

aatttctgtt gtatattagc gatcaacaga gtcgaatgta ccagtgcata actttcttct 6720

cctgacacta tgcc 6734

Claims

1.ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控玉米抗寒性中的应用；

所述ZmbZIP68蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ZmbZIP68蛋白的编码基因的抑制因子包括能够抑制ZmbZIP68蛋白表达的gRNA或干扰RNA；

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌；

所述应用为通过降低玉米中所述ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性，提高玉米的抗寒性。

2.ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控玉米在低温条件下的存活率和/或生长中的应用；

所述ZmbZIP68蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌；

所述应用为通过降低玉米中所述ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性，提高玉米在低温条件下的存活率和/或生长。

3.ZmbZIP68蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在提高抗寒性的玉米遗传育种或者在玉米抗寒种质资源改良中的应用；

所述ZmbZIP68蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌；

所述应用为通过降低玉米中所述ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性，提高玉米的抗寒性，或者提高玉米在低温条件下的存活率和/或生长。

4.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述ZmbZIP68蛋白的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述gRNA的靶序列为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列的反义互补链的第1014-1033位或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1170-1189位。

6.一种抗寒玉米的选育方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米中ZmbZIP68蛋白的表达量和/或活性降低；

所述ZmbZIP68蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述ZmbZIP68蛋白的编码基因的抑制因子的重组载体导入玉米，获得转基因玉米株系；

所述抑制因子包括能够抑制ZmbZIP68表达的gRNA或干扰RNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述gRNA的靶序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反义互补链的第1014-1033位或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1170-1189位。