CN112080518B

CN112080518B - 玉米al14基因在植物抗旱中的应用

Info

Publication number: CN112080518B
Application number: CN202010930148.0A
Authority: CN
Inventors: 王瑜; 巩志忠; 王亚琳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2040-09-07
Also published as: CN112080518A

Abstract

本发明提供玉米AL14基因在植物抗旱中的应用。本发明的玉米AL14基因突变后，干旱处理条件下突变体生长明显好于野生型，ABA处理后气孔开度小于野生型，表明该基因突变能够通过调节气孔运动显著提高植物抗旱性。进一步通过CRISPR/Cas9技术获得了抗旱的AL14突变体，通过自交去掉Cas9背景后遗传稳定性更强，能够在不同世代间稳定遗传，为培育和改良抗旱新品种提供了基因资源，为阐明植物干旱逆境信号应答的分子机制提供了理论依据。

Description

玉米AL14基因在植物抗旱中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和遗传育种领域，具体地说，涉及玉米AL14基因在植物抗旱中的应用。

背景技术

我国一半以上玉米种植在西北、西南、华北和东北地区依靠自然降水的旱地上，水分流失快且降水变率也很大，严重影响作物的生长。找到参与植物干旱信号转导、影响抗旱性的相关基因，研究其基因功能，为通过遗传改良提高作物抗旱性、减少干旱造成的减产提供了理论依据。通过基因工程手段编辑或过表达某个或某些特定基因，提高植物的抗逆性，是分子育种的方式之一。这种技术突破了种间杂交的限制，是改良作物抗逆性的有效途径之一，能够提高作物在逆境下的产量，对解决环境胁迫导致的粮食短缺有重要意义。

干旱可引起植物的渗透胁迫，植物体内的渗透压低于环境渗透压(如土壤溶液)，植物体不能吸水甚至失水。渗透胁迫有两条通路：依赖于ABA和不依赖于ABA的通路。当植物受到环境胁迫时，体内植物激素脱落酸(ABA)合成增加，在依赖于ABA的通路中，PYL/PYR/RCAR作为ABA受体，与ABA结合。结合了ABA的受体可以通过改变构象与蛋白磷酸酶PP2C结合，解除PP2C对蛋白激酶SnRK2的抑制，活化的SnRK2可以磷酸化下游的离子通道和转录因子等，引起下游逆境响应基因表达的改变和细胞内外离子浓度的变化，促进气孔关闭，减少水分散失，以及产生其他的响应。因此，ABA作为极其重要的植物激素，在调节气孔关闭和逆境响应基因的表达等方面发挥着关键的作用。不依赖于ABA通路中，干旱胁迫诱导转录因子DREB2A被磷酸化，从而调控下游逆境响应基因表达。转录因子Alfin-like(AL)家族成员具有保守的DUF3594和PHD结构域。玉米中有18个AL家族成员，部分成员受ABA、干旱、高盐和低温的诱导，推测可能在非生物胁迫应答中起重要作用，但是他们在ABA依赖的环境胁迫信号响应中的作用有待进一步研究。

玉米是一种容易受到干旱胁迫影响的农作物，因此通过基因工程手段，改良玉米品种，提高抗旱性，对于干旱造成的减产具有重要意义。随着B73和Mo17等玉米自交系基因组测序的完成，玉米的遗传背景更加清楚。同时，易于遗传转化的自交系不断被测序和开发，使转基因过表达和基因编辑技术的效率大大提高，例如LH244自交系。该自交系转化效率高于目前已知的绝大多数自交系，易于通过转化获得转基因过表达或基因编辑植株，这些为利用分子育种进行遗传性状改良提供了技术支持，对减轻干旱等非生物胁迫造成的玉米减产具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供Alfin-like(AL)家族转录因子--玉米AL14基因在植物抗旱中的应用。

本发明构思如下：植物中AL家族蛋白具有重要生物学功能，本发明通过在玉米中对AL14基因进行编辑，使AL14基因突变，其编码蛋白失去功能，突变体抗旱性提高，为培育抗旱的玉米新品种提供新手段。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供玉米AL14基因的活性和/或表达量降低或消失在提高植物抗旱性中的应用。

本发明的玉米AL14基因由3059个碱基组成，T01转录本的读码框为自5'端第191位到第2694位碱基。该基因由9个外显子组成，其中T01转录本编码外显子5个，读码框第1位到第118位碱基，第209位到第241位碱基，第340位到第562位碱基，第2040位到第2169位碱基，第2247位到第2504位碱基，其余为其内含子序列。进一步地，本发明的玉米AL14基因来源于zheng58型玉米，在玉米基因组数据库https://www.maizegdb.org/中的编号(参考序列号)为GRMZM2G017142。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本发明保护范围内。

本发明中，所述植物优选玉米。

第二方面，本发明提供提高植物抗旱性的方法，利用基因工程手段弱化玉米AL14基因；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

弱化的方法可选自诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种。

优选地，利用CRISPR/Cas基因编辑技术，对玉米AL14基因进行定点突变，使得该基因功能缺失。

玉米AL14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，根据该序列，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，得到影响AL14蛋白功能的突变序列。具体地说，本发明的技术方案包括：利用网站设计AL14基因的编辑靶点，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等一系列操作，构建CRISPR/Cas9打靶载体(CRISPR/Cas9基因编辑载体)，将打靶载体转入农杆菌，用农杆菌侵染玉米幼胚的方式得到转化苗，用除草剂和PCR鉴定筛选阳性植株，提取转基因植株DNA进行测序，获得具有突变位点的突变体。突变体经自交繁种后进行旱处理实验。AL14基因可进行编辑的靶点不止一个，经过编辑后的突变基因可能会产生一个或多个核苷酸增加或缺失，导致蛋白部分缺失或提前终止，其中有些突变会影响蛋白质的生物学功能。表达无功能蛋白的突变体植株可能会产生耐干旱胁迫的表型，均属于本发明保护的范围。获得突变体后，检测AL14突变体在干旱处理下的表型，包括苗期干旱处理、失水率等旱相关生理指标的测定。

进一步地，以玉米AL14基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米AL14基因的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因玉米。

在本发明的一个具体实施方式中，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TATACAGCGCTGATGAGTTCTGG-3’(SEQ ID NO:3)。

第三方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因玉米在植物育种中的应用。

进一步地，育种目的是选育抗旱新品种。

育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明的玉米AL14基因突变后，干旱处理条件下突变体生长明显好于野生型，ABA处理后气孔开度小于野生型，表明该基因突变能够通过调节气孔运动显著提高植物抗旱性。进一步通过CRISPR/Cas9技术获得了抗旱的AL14突变体，通过自交去掉Cas9背景后遗传稳定性更强，能够在不同世代间稳定遗传，为培育和改良抗旱新品种提供了基因资源，为阐明植物干旱逆境信号应答的分子机制提供了理论依据。

(一)通过CRISPR/Cas9技术对玉米AL14基因进行突变后，ABA处理下突变体气孔开度小于野生型，表明该基因突变能够通过调节气孔运动减少水分散失，提高植物抗旱性。

(二)本发明中玉米AL14基因突变植株的具有明显抗旱表型，在干旱条件下，生长状况良好，其叶片萎蔫程度明显低于未突变的野生型植株。

(三)本发明提供的抗旱植株选育的方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强等优势，显著缩短育种的周期，提高了旱响应育种的效率。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中CRISPR/Cas9转基因植株测序鉴定结果。

图2为本发明较佳实施例中AL14 CRISPR突变体抗旱表型。

图3为本发明较佳实施例中AL14突变体ABA处理后的气孔开度图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用转录本和编辑靶点仅作为示例，不限制应用中的编辑位点。若未特别指明，实验方法均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。

玉米自交系生态型为LH244(WT)；农杆菌菌株为EHA105。载体pBUE411C由中国农业大学陈其军实验室提供，参见文章(Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-YanZhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang and Qi-Jun Chen.A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants.BMC Plant Biology 2014,14:327)。主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自Sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

实施例1 CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和检测

为研究植物抗旱的分子机制，基于CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)基因组中定向突变了AL14基因。首先登陆网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选打靶位点。序列如下：红色大写字母区为基因外显子，红色大写字母加粗为T01转录本读码框，紫色框内是起始密码子和终止密码子，黄色框内为靶点。

最终选择将玉米AL14基因第6个外显子作为靶点，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TATACAGCGCTGATGAGTTCTGG-3’。该靶点的打靶效率较高，脱靶率低。

根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等操作，构建CRISPR/Cas9打靶载体(CRISPR/Cas9基因编辑载体)。

所用引物如下：

ID-1f：5’-GGCGATACAGCGCTGATGAGTTC-3’

ID-1r：5’-AAACGAACTCATCAGCGCTGTAT-3’

载体构建方法：

(1)退火：将上述引物稀释后进行梯度退火，使其退火形成双链；

(2)载体酶切：酶切体系及反应条件如下：

(3)连接体系：连接体系及反应条件如下：

(4)取5μl酶切-连接体系的产物，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆测序。菌落检测PCR引物为：

ID-1f：5’-GGCGATACAGCGCTGATGAGTTC-3’

ID-1r：5’-AAACGAACTCATCAGCGCTGTAT-3’

测序引物：OsU3-FD3：5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’

实施例2 CRISPR/Cas9基因编辑植株的构建和鉴定

将实施例1中测序正确的质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆。将鉴定正确的农杆菌单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，次日转接至含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重悬至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。侵染无菌条件下扒出的LH244自交系玉米幼胚后，诱导愈伤成苗。转基因植株经自交繁种后获得T1代进行后续实验。测序发现，本实施例中的突变导致玉米AL14基因10bp的缺失，造成移码突变(图1)，导致蛋白翻译提前终止，蛋白功能被破坏(打靶效率为30-40％)。突变体繁种获得T2代植株，可用于旱处理，观察表型。为防止再次发生突变，测序后挑出的突变体可经过自交，去掉Cas9，获得稳定的突变体后再进行干旱处理。

实施例3转基因植株的表型鉴定

1、AL14突变体旱处理表型检测

在每个小盆中加入110g土，托盘里加上水，每小盆放4粒玉米种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，出苗后将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1L水，吸满后将水倒掉，开始旱处理，观察对照和转基因植株旱处理表型。对照及转基因植株各3盆重复。图2显示干旱处理下AL14突变体的生长状况好于对照，叶片萎蔫程度低于对照，说明突变体比对照抗旱。

2、AL14突变体气孔运动检测

气孔开度测定所用缓冲液：10mM KCl，50μM CaCl₂，10mM MES(2-吗啉乙磺酸)，pH5.7；按如下实验方法进行：

a.野生型(WT，玉米自交系LH244)和AL14 CRISPR突变植株在25℃温室条件下生长8天，将第一片完全展开的玉米叶片置于气孔开度缓冲液中，温度28℃，光照300μmol·m^-2·s^-1处理2h，使气孔开放或关闭，分别用于气孔关闭过程和开放过程的开度检测；

b.将一部分野生型和突变体叶片放入含有10μM ABA的缓冲液中进行处理，另一部分野生型和突变体叶片放在含有相同浓度溶剂的缓冲液中作为对照；

c.根据实验需要，在处理不同时间后，撕取叶片下表皮在高倍光学显微镜下观察气孔的开度；每个处理随机选取3～5个视野拍照，分别用ImageJ软件测定并记录气孔的开度，4个生物学重复。

实验结果见图3，结果表明，在没有ABA处理的对照条件下，野生型和AL14突变体气孔开度一样。干旱引起的ABA升高可以诱导气孔关闭，因此直接用ABA处理，可以造成气孔关闭，AL14突变体的气孔关闭程度大于野生型，说明干旱导致的AL14突变体叶片气孔关闭比野生型更紧，水分散失少，植株会更抗旱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 玉米AL14基因在植物抗旱中的应用

<130> KHP201115593.7

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3059

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

aaaaaaaaga aacgcaagat cttgcactgt tgcacatctc ccctctttta gcccgcagca 60

cccgtccggg tgtaccggtg tactatcatc cctcggctcc aggccgcatc gcgatcagtc 120

atctctttcc ctcccagcct tcctcctgcg tctcgctctc gccggaggtc aggcgcaccg 180

ccgccgggcg atggacgcct cctaccgccg cgccggcacc gggagcggct ccgctccccg 240

ctccgtcgag gacatctaca aggactaccg ctcccgccgc tccgccatcc tccgcgccct 300

cacccacggt acgcgcccgc tcccccgcgg ctcctcttcc cgccacgctt gcggaaagtc 360

cccagctcta accctatccc acttctctcg cttcgcagac gttgaggagt tctacgcgct 420

gtgcgatcca ggtgagtctc cttcccctcg cgatctctcc gcaccgtggc tttcgattca 480

atttgggtgc gaggtgatac ggtctgtggt tggggttggg tgtcggtaga gaaggagaac 540

ctgtgcctgt acggctacgc gaacgaagcg tgggaggtag cgctgccggc ggaggaggtg 600

cccacggagc ttccggagcc ggcgctcggg atcaacttcg cgcgcgacgg gatgaaccgt 660

ggcgactggc tcgcgctcgt cgccgtacac tctgactcgt ggctcgtctc cgtcgcattc 720

tactacgccg cgcggctcaa ccgcagtgat cggtacgaca cgatcccctc gctcccagtc 780

tcgcctgcgg tgacttctgc atcttggtgt gctgtttgtg ctcactgaca tctaggcatg 840

catacatgtg ctggggagta ttctgtgagt tgaattggat gccaggatat gcatggtgtg 900

ttgtgcgtgc cctctgcccc tctgaatgca tgtcagtgtg cggaggtatt tgggtccaac 960

attgggcctc ctgcggaggt ttcgtagaat ataattaatt tgccaatttt cgaaggagta 1020

aatgagtttg ttcccatgta gcaatttaag gagctgtgct attgaattgt ttattatagc 1080

cattcgaatt actaagttat actagctcat aaagtgtcat tttgctgaag ttggggacga 1140

tatctgttta tctgtgctgt agttagcatt tgtaaatttc tgagcctgtg tgcgcactga 1200

agttctactt ctattcttcc ctaagatgtt aataatatcc taatgaaggg tattgttggt 1260

tattcatgtg gaaagcttag tgtataccct tcattgtcat cagaatgttc atatgttgct 1320

gaactaaata tgccaaatgt tcagatgcgt aaagcttgct ctgtcttcaa gttgttcctg 1380

aaagacttct tgctttgatt tcaaggaatt gaaacttctt ctgtgatggt tataagttac 1440

ttacaatttt tttaattaaa aaaacgtgca attgtgaatt gatgattatg gtcttttcca 1500

acttcacttc ttgttactaa tactgtgtca acgttttgat atagtggatg gatctgatta 1560

tggggtttgc ttaagtactc tacttcaagc tttttactaa tctttctgca gaaatagcta 1620

ttgataacca tggccaaata tgtagcaaag ccttttagtc ctcatcttat tgttttctac 1680

tttgttttgt tcttttttcc agttattttt tttctagtgc aacaagttaa aatgattcct 1740

attctattgt atttaagttg ttctccatcc acaaaagctt taatttttta acatattttt 1800

atttacatga ttttttcgaa tcagaatcta tcttatcagc caaacggttc cataaagtga 1860

ttctgattca tcatcagaaa catttcttga gagaatctgg atccataaca tttctgttaa 1920

aatccggagc tctagtaagc cactataaac aacgttaatg tcggtcggtt gcatcttgca 1980

acttataagt ttgactttgt ttttttcata gaatgttctt acagtttacc tttggctagt 2040

cagtcatact aattcaaaag gtattaagta gccttcactt gaaccacaat ggaagtgaaa 2100

catttcttat tccaccctgc aattgttttt ggttctagta gcagtatcca gtggtaattt 2160

aactgccact agaggagttg atattgcagt aaccattttg cgtaatgcgt ctcctctcta 2220

attgagcagg aagcgtttgt tcggcatgat gaatgatctg ccaactgttt ttgaagtcgt 2280

ctccagtggt gtgaagcaat caaaagagag ggatagatcc ggtactgaca atggtggtag 2340

aaataaactg tcggtaaagg taacaagaac ccatcgctgt ttttaccaca tcttctattg 2400

tcatgttatg atgttgaact tgatctgtct ctccagcaaa caagcgagcc acgattagaa 2460

aataacgcca gggagcctga tgagggctac gatgaagatg acagcaacca cagcgaaacc 2520

ttgtgcggga catgtggtgg aatatacagc gctgatgagt tctggatcgg gtgcgacgtg 2580

tgcgagaagt ggtaccatgg caagtgcgtg aagatcacac ctgcaaaggc ggagagcata 2640

aagcagtaca agtgcccaag ctgctgcaat tcaaaaagac ctaggccgat ttaggcctat 2700

agcatcgccc tcctcccggg aggacggcca tggatggaag aagactggac aagcaggtca 2760

gagtttcctc ttgcgcaagg tcaatgccgc cttgcgatgt ttactgtacc ttttcgatta 2820

agcttacata tgacgaacga tgatgatgct aatgttagca gggaaagatc acacattaat 2880

ttataatctt tttgtggttt ctccatgccg tggagagtta tggtagtctg tatgttgccg 2940

gagaaggaat aggggcagag gaagcctttg taatctttct ataggtggaa tgtgcagctt 3000

atgcgaagat aataataatc cgtgatgttc atgttaatat attttattta ctataaaga 3059

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

Met Asp Ala Ser Tyr Arg Arg Ala Gly Thr Gly Ser Gly Ser Ala Pro

1 5 10 15

Arg Ser Val Glu Asp Ile Tyr Lys Asp Tyr Arg Ser Arg Arg Ser Ala

20 25 30

Ile Leu Arg Ala Leu Thr His Asp Val Glu Glu Phe Tyr Ala Leu Cys

35 40 45

Asp Pro Glu Lys Glu Asn Leu Cys Leu Tyr Gly Tyr Ala Asn Glu Ala

50 55 60

Trp Glu Val Ala Leu Pro Ala Glu Glu Val Pro Thr Glu Leu Pro Glu

65 70 75 80

Pro Ala Leu Gly Ile Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met Asn Arg Gly Asp

85 90 95

Trp Leu Ala Leu Val Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Val Ser Val

100 105 110

Ala Phe Tyr Tyr Ala Ala Arg Leu Asn Arg Ser Asp Arg Lys Arg Leu

115 120 125

Phe Gly Met Met Asn Asp Leu Pro Thr Val Phe Glu Val Val Ser Ser

130 135 140

Gly Val Lys Gln Ser Lys Glu Arg Asp Arg Ser Gly Thr Asp Asn Gly

145 150 155 160

Gly Arg Asn Lys Leu Ser Val Lys Gln Thr Ser Glu Pro Arg Leu Glu

165 170 175

Asn Asn Ala Arg Glu Pro Asp Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Asn

180 185 190

His Ser Glu Thr Leu Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ile Tyr Ser Ala Asp

195 200 205

Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Val Cys Glu Lys Trp Tyr His Gly Lys

210 215 220

Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Lys Ala Glu Ser Ile Lys Gln Tyr Lys

225 230 235 240

Cys Pro Ser Cys Cys Asn Ser Lys Arg Pro Arg Pro Ile

245 250

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

tatacagcgc tgatgagttc tgg 23

Claims

1.玉米AL14基因的表达量降低或消失在提高玉米抗旱性中的应用；

玉米AL14基因在玉米基因组数据库中的参考序列号为GRMZM2G017142。

2.提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，利用基因工程手段弱化玉米AL14基因；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，弱化的方法选自诱变、定点突变、同源重组中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas基因编辑技术，对玉米AL14基因进行定点突变，使得该基因功能缺失。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以玉米AL14基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米AL14基因的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因玉米。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TATACAGCGCTGATGAGTTCTGG-3’。

7.根据权利要求2-6任一项所述方法获得的转基因玉米在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，育种目的是选育抗旱新品种。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。