CN114645053B

CN114645053B - ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用

Info

Publication number: CN114645053B
Application number: CN202011493037.4A
Authority: CN
Inventors: 巩志忠; 王瑜; 蒋杉
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN114645053A

Abstract

本发明公开了ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。本发明提供的DNA分子，为WRKY70基因，是如下：(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；本发明提供的WRKY70基因经CRISPR‑Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下未突变的对照植株生长明显优于突变体植株，说明该基因突变能够显著降低植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得了旱敏感的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明WRKY转录因子在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。

背景技术

玉米是世界三大粮食作物之一，种植区域广泛，但在各地区的分布并不均匀，不同的地区，环境不同，气候条件不同，降水量不同，其中，干旱是影响玉米产量的重要因素，在玉米苗期干旱会抑制玉米生长速率，导致发育期严重缩短，干旱还会抑制玉米株高，导致叶片萎蔫，从而使光合作用减少，在玉米灌浆期干旱会导致籽粒不饱满，从而导致玉米产量减少。我国一半以上玉米种植在西北、西南、华北和东北地区依靠自然降水的旱地上，这些地方年降水量200-600mm不等，有些地方蒸发量大，水分流失快,水分对于玉米的生长发育满足率很低，严重影响玉米的生长。因此提高玉米的抗旱性对于玉米产量至关重要。

植物中存在大量的转录因子，转录因子通过与靶基因特定序列结合调控其表达，在整合外界环境信号、调节植物生长发育中发挥重要作用，但转录因子在植物响应生物和非生物胁迫，如干旱、抗冷中的具体机制仍待进一步探究。作为植物所特有的最大的转录因子家族之一，WRKY转录因子是植物生存过程中不可或缺的关键调控子，在不同的生理过程中发挥正调控或负调控作用。目前已经在多个物种中鉴定获得WRKY家族基因,拟南芥中有74个WRKY基因,水稻中超过100个,大豆中有197个,玉米B73自交系中有119个。WRKY转录因子是一类DNA结合蛋白，包含N端高度保守的WRKY蛋白结构域，由60个氨基酸组成，能够结合DNA，具有WRKYGQK基序以及C端Zn-finger基序。除此之外，大多数WRKY转录因子还具有核定位信号(NLS)、激酶结构域等其它结构。WRKY转录因子通常在转录激活/抑制结构域富集，激活/抑制目的基因的转录。已有研究表明，WRKY转录因子的表达受水杨酸(SA)等防御信号分子快速诱导，在植物防御病原体攻击、调节植物生长发育及代谢、衰老等多个生理过程中发挥重要作用。

玉米的产量容易受到干旱胁迫影响，通过基因工程方法改良玉米抗旱性，对保护玉米产量具有重要意义。B73玉米基因组测序已经完成，基因编辑和遗传转化技术也在不断更新，为通过基因工程手段改良玉米抗旱性提供了重要保障。

发明内容

本发明一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，为WRKY70基因，是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述DNA分子编码的蛋白质也是本发明保护的范围。

上述蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1为标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

上述玉米WRKY70基因由5524个碱基(序列1)组成，T01转录本的读码框为序列3，编码的蛋白为序列2，命名为WRKY70蛋白。该基因由3个外显子组成，读码框第584位到第2136位碱基，第2755位到第2895位碱基，第3978位到第4924位碱基，其余为其内含子序列。基因来源于B73型玉米，由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该DNA段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。

上述DNA分子或上述的蛋白质在调控植物抗旱型中的应用也是本发明保护的范围。

降低上述蛋白质活性或含量的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围。

或，抑制上述DNA分子表达的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶点为序列1第1580-1598位；

所述sgRNA2的靶点为序列1第1633-1651位；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

WRKY70基因的核苷酸序列如序列1所示，根据本发明公开的核苷酸序列，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，得到影响WRKY70蛋白功能的突变序列。具体地说，本发明的技术方案包括：利用网站设计WRKY70基因的编辑靶点，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等一系列过程，构建CRISPR/Cas9的载体，将载体转入农杆菌，用农杆菌侵染玉米幼胚的方式得到转化苗，用除草剂和PCR鉴定筛选阳性植株，提取突变体植株DNA进行测序，获得具有突变位点的突变体。突变体经自交繁种后进行旱处理实验。WRKY70基因可进行编辑的靶点不止一个，经过编辑后的突变基因可能会产生一个或多个核苷酸增加或缺失，导致蛋白部分缺失或提前终止，其中有些突变会影响蛋白质的生物学功能。表达无功能蛋白的突变体植株可能会产生响应干旱胁迫的表型，均属于本发明要求保护的范围。获得突变体后，检测WRKY70突变体在干旱处理下的表型。

本发明还有一个目的是提供一种培育对干旱敏感转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：

1)所示的方法为包括如下步骤：降低目的植物中上述蛋白质活性或含量，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物；

2)所示的方法为包括如下步骤：抑制目的植物中DNA分子的表达，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物；

3)所示的方法为包括如下步骤：对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述降低目的植物中上述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中上述DNA分子表达或所述对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将上述所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中。

上述物质也是本发明保护的范围。

上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明提供的WRKY70基因经CRISPR-Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下未突变的对照植株生长明显优于突变体植株，构建的CRISPR-Cas9基因编辑技术突变WRKY70基因的突变体植物的抗旱能力显著降低，在干旱条件下，其叶片萎蔫程度相较于野生型更加明显，叶片相对含水量更低，说明该基因突变能够显著降低植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了旱敏感的植株，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了干旱敏感育种的周期，提高了干旱敏感育种的效率，为阐明WRKY转录因子在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

附图说明

图1为玉米WRKY70 CRISPR-Cas9突变位点。

图2为野生型玉米(对照)和WRKY70CRISPR-Cas9突变株系干旱处理后植株生长情况照片，左边3个是野生型，右边3个是突变型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

以下实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。

玉米生态型为B73，记载在如下文献中：Zhang et al.The genetic architectureof nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018.；

农杆菌菌株是EHA105。

CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。

主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

实施例1、WRKY70基因的获得及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和检测

一、WRKY70基因的获得

为研究WRKY家族蛋白在植物抗旱中的分子机制，利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)B73基因组中定向突变了WRKY70基因。

玉米WRKY70基因由5524个碱基(序列1)组成，T01转录本的读码框为序列3，编码的蛋白为序列2，命名为WRKY70蛋白。该转录本由3个外显子组成，读码框第584位到第2136位碱基，第2755位到第2895位碱基，第3978位到第4924位碱基，其余为其内含子序列。基因来源于B73型玉米，由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该DNA段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。

二、用于基因编辑WRKY70基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

选取WRKY70基因中GGAAACGCCGCGGACACGC(序列1第1580-1598位)和GGGGGACGCGACGATGCTC(序列1第1633-1651位)作为该基因的两个靶点，设计包含两个靶点信息的引物:

根据靶点设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：

M1T12-F:AATAATGGTCTCAGGCGGCGTGTCCGCGGCGTTTCC

M1T12-F0:GGCGTGTCCGCGGCGTTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

M1T12-R:ATTATTGGTCTCTAAACGGGGGACGCGACGATGCTC

M1T12-R0:GGGGGACGCGACGATGCTCCGCTTCTTGGTGCC

(1)退火：将上述引物稀释后进行退火，得到带粘性末端的双链DNA片段gRNA；

将上述M1T12-F和M1T12-F0退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA1，

将上述M1T12-R和M1T12-R0退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA2。

(2)pBUE411载体(该载体含有3×FLAG-NLS-zCas9-NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)用BsaI(NEB)酶切，得到酶切后pBUE411；

表2为酶切体系

(3)连接体系

将上述(1)的带粘性末端的双链DNA片段gRNA1、带粘性末端的双链DNA片段gRNA2和上述(2)得到的酶切后pBUE411连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN-WRKY70CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1识别区的编码序列为序列1第1580-1598位，sgRNA2识别区的编码序列为序列1第1633-1651位。

上述连接体系如表3所示：

表3为连接体系

(4)鉴定

取5μl步骤(3)得到的连接产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆(得到700bp为阳性)，提取质粒送去测序。

PCR鉴定所需引物如下：

M1T12-F:AATAATGGTCTCAGGCGGGAAACGCCGCGGACACGC

M1T12-R:ATTATTGGTCTCTAAACGAGCATCGTCGCGTCCCCC

测序引物：OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

测序结果显示，阳性克隆的质粒为重组CRISPR载体pBCXUN-WRKY70 CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1识别区的编码序列为序列1第1580-1598位，sgRNA2识别区的编码序列为序列1第1633-1651位。

实施例2、WRKY70基因CRISPR-Cas9植物的构建和鉴定

1、重组菌的制备

将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN-WRKY70 CRISPR-Cas9突变质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN-WRKY70 CRISPR-Cas9。

2、WRKY70基因CRISPR-Cas9植物的构建

将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN-WRKY70 CRISPR-Cas9单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。

将重组菌EHA105/pBCXUN-WRKY70 CRISPR-Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73以下也称为野生型玉米)，B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architecture ofnodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018。

3、检测

提取T0代转化苗的DNA作为模板进行PCR扩增并测序，以B73玉米为对照。

扩增所需引物如下(得到700bp为阳性)：

M1T12-F:AATAATGGTCTCAGGCGGGAAACGCCGCGGACACGC

M1T12-R:ATTATTGGTCTCTAAACGAGCATCGTCGCGTCCCCC

测序引物：OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

测序结果如图1所示，可以看出，与野生型玉米B73(下面序列)相比，T0代转化苗(上面序列)中WRKY70基因中有单碱基缺失突变造成移码(突变位置为序列1第1637为的G缺失)，导致蛋白翻译提前终止，蛋白功能被破坏。

将含有该突变形式的转化苗命名为阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米。

阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米培育，直至获得T2代CRISPR-Cas9突变玉米。

实施例3、WRKY70基因CRISPR-Cas9突变玉米旱处理表型检测

1、在装有营养土的小盆中播种T2代CRISPR-Cas9突变玉米种子和野生型玉米B73种子，覆盖50cm²土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，培育7天后出苗，得到T2代CRISPR-Cas9突变玉米苗和野生型玉米苗；

2、将长势齐的T2代CRISPR-Cas9突变玉米苗和野生型玉米B73苗分别移栽到新的装有营养土的盆中，每盆3株，正常浇水并培养7天。设置三次重复试验，每次重复试验6盆。

3、完成步骤2后，持续不浇水14天(干旱处理)，再次恢复浇水7天。

恢复浇水7天后，表型差异明显，结果如图2所示，左边3个是野生型玉米B73，右边3个是T2代CRISPR-Cas9突变玉米，可以看出，不浇水14天再次恢复浇水7天后对照野生型玉米B73植株的生长状况优于WRKY70-Cas9突变植株(T2代CRISPR-Cas9突变玉米)，WRKY70-Cas9突变植株的叶片萎蔫程度高于对照，WRKY70-Cas9突变植株与对照植株相比对干旱更加敏感。

统计干旱处理14天且恢复后再次恢复浇水，各株系的存活率(将表现为能正常生长植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，T2代CRISPR-Cas9突变玉米干旱处理后的存活率为50％；野生型玉米干旱处理后的存活率为80％。

因此，抑制WRKY70蛋白表达或者敲除WRKY70基因能够降低玉米耐旱性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120>ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5524

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

atgcgtacgt gggcgattcc gtctctcctt caccccctga cgccgatgct gatagacgac 60

gacgacgcac aaccatgcat ataatcgtgg actatttgca catgaataaa cgccagtaga 120

taactgctct attgatggtg tatatagtac atccacagaa cggaacacat gatgcaaaat 180

tcttgtgtgt gcatgcagca gcagcgtgca tgcacacagg tcgatccaga gcgtgcgtgc 240

ttggcgatca gatcggtcgg gtcgcccggc cggcctgcgc tgcgcatgcc atgaagaagg 300

cctgagtaac ggagtggtgc aagtaggttg cgtgtgcggc ggactcggtc attccgtccg 360

tcagtgggtt aaaaagaaga ggagacagag acgacaggcg tccgacgcga gcgagctaga 420

tcagctcagg gaggtccggc tccggccggg gacggttcca gccttttcac cgtgcatgga 480

catggtagca tcgcatgcgg atcggacccg gtggccggca tatgcacggc ccgtttttct 540

ttttaccagg ccagggccag ggcgacaggc gcccgacgcg gccatgccgc cttgcgtatg 600

gaggtggcac accggccgcg gcctccccca cgcacctcgc ccgtctgccg tgcccttgaa 660

aaggtcagcc tccatccgtc cgtccgtcgg tcaatcgacc ggcgcaggag gacggagggc 720

cagcatatgt tatgcatatg catatgcatg cacgcacatc gatcgccaga agaaaacaat 780

acaaaatcca cacaacccat cactctcgcc ctcctgtccc tctctcgaca tgcctgtcta 840

tctctctctc tctcatctct ctgccctcac atacttcttt attgtcctct cttggaagcc 900

aactcaagtt acccatctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 960

ctctctctct ctctctctct ctctgtgtgt gtctctcctc ttcttgtgtt ttcgatccct 1020

cttctctcct gttgcttgct tggtgtggag aaaagatagc tcactttcca cagccccatc 1080

tctcacatcc tgcttcccct ccaccctacc tccttttctg ccccccacaa aagctaaaca 1140

agcttgctgg ttcgcttgcc tgcttggtat tagctacccc caagcagatc gggccaacct 1200

gcaactactt caagagatcg ctgtccctgc cctagcagcc ttctttctcc ttcgtgacaa 1260

cacatgcatg cacccaggct gctgcttcct gtgctgtgca tcacacgggt cttggaaagc 1320

tagcctcgtt agcttcttgg tgccagttga ttggaaagga gcgagagaat tattgagcgg 1380

ttggcatcag ccgcttgcat ccactataga ggcagcgagc gagagcgaga gggatcggca 1440

aagggcgccc taggggagct actactagct gccgcacgat actacagcca tgtgcgacta 1500

cttccttccg aggatggagg gcgaccaggc cggcggcgga gacctcacgg acatcgtccg 1560

gtccggcgga gccatccctg gaaacgccgc ggacacgccg tccacggccg ccgcggacga 1620

gtggcagctc cagggggacg cgacgatgct cttcccgccg cttccctcgt cgacgacagc 1680

atcggaagta ggctgcgccg ccgtcttcgg caccgaccct ttctccggcc tcgtggaccc 1740

gttcagtacc gactactcct cgggcgccga cttcctggac gccatgccgg acgcgatggc 1800

caaggtcggc ttcgacacga cggctatctg tggcggcagc ggcagcggca gcggctgcag 1860

aggaggaggc ggaggccaac tcatagacat gagccggaag cagcagcctc tcttgccgcg 1920

ggggttgcag atgccggcgg ttggaggagt gctgacgccg agggtggtgc tgccgtcgcc 1980

gttgtcgccg agggagatac gaccgtaccc ggcgttagcc ggagacatgg tcaagctcgg 2040

aatcacggcc gggcaggtgg ccgggtgcgc catcgacgcc gccgttgtcg acatgcagat 2100

gtcttcgcct cgcgccgcgg gcgggatcaa gcgcaggttg ggcagatccg cctggatcca 2160

acgcacatct gctagcttcg ttgcatcgtc tttatcttgc atgcgtgttt gctacctgct 2220

actccgtata tagctcgtga tgatttttag ggaaggttct gcgatctctt ttttttttct 2280

gttgcttttg cttctcctcc tctctcgtgc tccgcgcgct gcacctccat ggaaaaaaag 2340

aaatagagta agaaatgggg caggattcca aggattcctc gggctgtgct agctaggaat 2400

tggcaaggtc gtaagtgttg cctacagctc gaaatttgag gcgtgagagt catcatgaac 2460

acatggtgtg atcagtgggg ggtatttctg gatggaccaa cgatgcctac acatgtacat 2520

agggttatgt gcatctagac ctagctggtt ttctccccgg acaggccggc tttggagtct 2580

ccaaagctga tttacgaaac cctagtaata agcctcaatt aatttaaaaa aaaacagtac 2640

ctttgcctca tcaatagata attattcgtg cacttgtagc tctgtaattt tatcacttgc 2700

ttgatcacag atgctcatca aatattaacg ccatcagaaa atacatctgc gcaggaagaa 2760

ccaagcaagg aaggtggtat gcatcccagc gccgacagca gcagggggga gaccaactgg 2820

agaggtggtt ccttctgatc tctgggcctg gaggaagtac ggccagaagc ctatcaaggg 2880

ttctccttat ccaaggtatg cgttaagcac atccacgaat tagctgggat tttgttccaa 2940

tagaagagaa atggttaatg tggctcagtt aatctatagc tgaataatct gctggtgata 3000

aattcgaggt gaagcttaca aattactact ataagagagt aaacaaaact atcttctcta 3060

gttctctatg gcccatcgct atagaattct tagctccaca attattctta tttgtggctg 3120

catgatcgat gcagtttgaa agacaattta atgcatggtt acctggctag ctaggtagca 3180

agacgtatag tatggggagg atgcttgtaa gtctcatgcg tccaatatct atagtagtta 3240

gttgtttcat cactctatga gacattttgg cgtttgtttt tggagtgtac aacacgtcgt 3300

cctaattaca gatacggtta cattatcagc aacagataac aaagtatgca ccttatcttg 3360

gggttaatgt gttccaaggc atacacatta ccaaaccgtt catgttttcc cccagatttt 3420

aattctatat gcaaagcgta gttaggagtt gctcacaccc acctggatct acttttaagc 3480

tcttttgtac agtttttatt tacatgtgat atgtcagact atcttcccta gattgaacgg 3540

gggaaactaa ttataaaaat tctgataaat catacctctc tgtttcaaaa tataattctt 3600

tctaggcttc cagccttttt tctattcaca ttcgcattaa tgacaataaa tatagacata 3660

tatagactac atttataagt tgattaatga atgtagattt aatctaaaac gaattatatt 3720

tttggacaga tggagtatca agtacgacac tgttgatttt gaataactgt ttaagtatat 3780

gtaagcatat atacatgtaa aactgatgag cccccgatcg atcgatcggc tcatcgggat 3840

atatatgaag tgcaatttat taaaacttac atagatacgc tggttgcaat atatcacagc 3900

aagctagtga tgaaaaaggt gcgtgcatgc ttgctgactt caataatgtt cttgttcatg 3960

aaatgcacga tatccagagg gtactacaga tgcagcagct cgaaaggatg ctcggcgcgg 4020

aagcaagtgg aacgaagtcg gaatgacccc aacatgctcg tcatcaccta cacctccgag 4080

cacaaccatc catggccgac tcagcgcaac gccctggccg ggtcaactcg gaaccaccac 4140

agcaagaaca gcggcggcag ctcaggttcc aagaacgaga agcaacagca gcaatccaac 4200

accgacgtca aggaagagcc caacaaggat ccagccacca ccacgacgac gacgacgacc 4260

actagcacga tcactacaat gacaaccagt gcttctccgg cagcggtcgt gaaagaggag 4320

actctggcag ctgggtcgtc agaggcgccg ctggggcaag tcatggatac agcagcagca 4380

gcagtagacc acagtatcga gctcatggac caggtgttca gctgtgagag ctacaagccg 4440

atgatgatcc cggaggccgg cggccactca tctgacgact tcttctccga cctcgcggag 4500

ctggagtcgg atcccatgag cctaatcttc tccagagagt acatggaagc gaagccaagc 4560

ggtggcgatg gtgaccatcg tgggcaccag gagaaagcga tgacgtccaa ggacctggat 4620

ccactgttcg acatgctgga ctggtctgcc aattcctcgt cgtcagcagt gagctcgtcg 4680

tttgagcaac aaggaaacag agggtaatcg atcgtcgatc cattggcata tgtacgtgca 4740

cacatacgtt tgatcagaga gaagctaata acaacaaacc cagagaaact aagatcacca 4800

caaggtcatg agttaaatta agacgagaga gagttcctcc tttttcttca ctttcttttc 4860

ctctttagtt ctttaatttg gttcttatca tatcatttgt gtgagagaga ttggaatttt 4920

ttgttgttgt tgttgttgtt gaacgtgctc gatcttggat atgagccttg ttttttaagg 4980

tttgtgtcag gttgcttggt gtgctatatg catgcatgag atgaatagcc ccctgccccc 5040

ggccctgggg agtggggatt cttctctctc tcgcgtgtgc gcgggcgctc tccattattg 5100

gcatggagag agagagagag agagagttta tgaacgtcgc ctaacattct atgtgctgga 5160

agagatcgaa gagggcatag aaaaatggag gagaggattg gggccgggcc aggggtgacg 5220

tgaatgtgat agacggagaa ggagacccac gtcgtccttg aatgaaggtg atgtgacaga 5280

aagcagggca gggcgccgtt gcaacgaaga aagcagatgt ttgttgttac aatatactag 5340

cctctctctc gctttttttc agctttttgc atgcagagag gctggagctg gagcctgggc 5400

ctgggcgggc gcgcgcctat gtttggattc tctgaataac ggtacatatt taatagtttt 5460

tgtctgtgcg ccatggaaat tgcacgaacc cttcaatgta tacctgttcc tgatctaaag 5520

acca 5524

<210> 2

<211> 505

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Cys Asp Tyr Phe Leu Pro Arg Met Glu Gly Asp Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asp Leu Thr Asp Ile Val Arg Ser Gly Gly Ala Ile Pro Gly Asn

20 25 30

Ala Ala Asp Thr Pro Ser Thr Ala Ala Ala Asp Glu Trp Gln Leu Gln

35 40 45

Gly Asp Ala Thr Met Leu Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ser Thr Thr Ala

50 55 60

Ser Glu Val Gly Cys Ala Ala Val Phe Gly Thr Asp Pro Phe Ser Gly

65 70 75 80

Leu Val Asp Pro Phe Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Ala Asp Phe Leu

85 90 95

Asp Ala Met Pro Asp Ala Met Ala Lys Val Gly Phe Asp Thr Thr Ala

100 105 110

Ile Cys Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Cys Arg Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Gln Leu Ile Asp Met Ser Arg Lys Gln Gln Pro Leu Leu Pro Arg

130 135 140

Gly Leu Gln Met Pro Ala Val Gly Gly Val Leu Thr Pro Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Pro Ser Pro Leu Ser Pro Arg Glu Ile Arg Pro Tyr Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Gly Asp Met Val Lys Leu Gly Ile Thr Ala Gly Gln Val Ala Gly

180 185 190

Cys Ala Ile Asp Ala Ala Val Val Asp Met Gln Met Ser Ser Pro Arg

195 200 205

Ala Ala Gly Gly Ile Lys Arg Arg Lys Asn Gln Ala Arg Lys Val Val

210 215 220

Cys Ile Pro Ala Pro Thr Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Glu Val

225 230 235 240

Val Pro Ser Asp Leu Trp Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile

245 250 255

Lys Gly Ser Pro Tyr Pro Arg Gly Tyr Tyr Arg Cys Ser Ser Ser Lys

260 265 270

Gly Cys Ser Ala Arg Lys Gln Val Glu Arg Ser Arg Asn Asp Pro Asn

275 280 285

Met Leu Val Ile Thr Tyr Thr Ser Glu His Asn His Pro Trp Pro Thr

290 295 300

Gln Arg Asn Ala Leu Ala Gly Ser Thr Arg Asn His His Ser Lys Asn

305 310 315 320

Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Lys Asn Glu Lys Gln Gln Gln Gln Ser

325 330 335

Asn Thr Asp Val Lys Glu Glu Pro Asn Lys Asp Pro Ala Thr Thr Thr

340 345 350

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr Met Thr Thr Ser Ala

355 360 365

Ser Pro Ala Ala Val Val Lys Glu Glu Thr Leu Ala Ala Gly Ser Ser

370 375 380

Glu Ala Pro Leu Gly Gln Val Met Asp Thr Ala Ala Ala Ala Val Asp

385 390 395 400

His Ser Ile Glu Leu Met Asp Gln Val Phe Ser Cys Glu Ser Tyr Lys

405 410 415

Pro Met Met Ile Pro Glu Ala Gly Gly His Ser Ser Asp Asp Phe Phe

420 425 430

Ser Asp Leu Ala Glu Leu Glu Ser Asp Pro Met Ser Leu Ile Phe Ser

435 440 445

Arg Glu Tyr Met Glu Ala Lys Pro Ser Gly Gly Asp Gly Asp His Arg

450 455 460

Gly His Gln Glu Lys Ala Met Thr Ser Lys Asp Leu Asp Pro Leu Phe

465 470 475 480

Asp Met Leu Asp Trp Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ser Ala Val Ser Ser

485 490 495

Ser Phe Glu Gln Gln Gly Asn Arg Gly

500 505

<210> 3

<211> 1518

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 3

atgtgcgact acttccttcc gaggatggag ggcgaccagg ccggcggcgg agacctcacg 60

gacatcgtcc ggtccggcgg agccatccct ggaaacgccg cggacacgcc gtccacggcc 120

gccgcggacg agtggcagct ccagggggac gcgacgatgc tcttcccgcc gcttccctcg 180

tcgacgacag catcggaagt aggctgcgcc gccgtcttcg gcaccgaccc tttctccggc 240

ctcgtggacc cgttcagtac cgactactcc tcgggcgccg acttcctgga cgccatgccg 300

gacgcgatgg ccaaggtcgg cttcgacacg acggctatct gtggcggcag cggcagcggc 360

agcggctgca gaggaggagg cggaggccaa ctcatagaca tgagccggaa gcagcagcct 420

ctcttgccgc gggggttgca gatgccggcg gttggaggag tgctgacgcc gagggtggtg 480

ctgccgtcgc cgttgtcgcc gagggagata cgaccgtacc cggcgttagc cggagacatg 540

gtcaagctcg gaatcacggc cgggcaggtg gccgggtgcg ccatcgacgc cgccgttgtc 600

gacatgcaga tgtcttcgcc tcgcgccgcg ggcgggatca agcgcaggaa gaaccaagca 660

aggaaggtgg tatgcatccc agcgccgaca gcagcagggg ggagaccaac tggagaggtg 720

gttccttctg atctctgggc ctggaggaag tacggccaga agcctatcaa gggttctcct 780

tatccaagag ggtactacag atgcagcagc tcgaaaggat gctcggcgcg gaagcaagtg 840

gaacgaagtc ggaatgaccc caacatgctc gtcatcacct acacctccga gcacaaccat 900

ccatggccga ctcagcgcaa cgccctggcc gggtcaactc ggaaccacca cagcaagaac 960

agcggcggca gctcaggttc caagaacgag aagcaacagc agcaatccaa caccgacgtc 1020

aaggaagagc ccaacaagga tccagccacc accacgacga cgacgacgac cactagcacg 1080

atcactacaa tgacaaccag tgcttctccg gcagcggtcg tgaaagagga gactctggca 1140

gctgggtcgt cagaggcgcc gctggggcaa gtcatggata cagcagcagc agcagtagac 1200

cacagtatcg agctcatgga ccaggtgttc agctgtgaga gctacaagcc gatgatgatc 1260

ccggaggccg gcggccactc atctgacgac ttcttctccg acctcgcgga gctggagtcg 1320

gatcccatga gcctaatctt ctccagagag tacatggaag cgaagccaag cggtggcgat 1380

ggtgaccatc gtgggcacca ggagaaagcg atgacgtcca aggacctgga tccactgttc 1440

gacatgctgg actggtctgc caattcctcg tcgtcagcag tgagctcgtc gtttgagcaa 1500

caaggaaaca gagggtaa 1518

Claims

1.降低蛋白质含量的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用；

所述蛋白质是如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表中序列2所示的蛋白质；

（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

或，抑制DNA分子表达的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用；

所述DNA分子是如下（b1）或（b2）的DNA分子：

（b1）编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

（b2）编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶点为序列1第1580-1598位；

所述sgRNA2的靶点为序列1第1633-1651位；

2）表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体；

所述植物为玉米。

2.一种培育对干旱敏感转基因植物的方法，为如下1）或2）或3）：

1）为包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质含量，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物；

2）为包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述DNA分子的表达，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物；

3）为包括如下步骤：对目的植物中权利要求1中所述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性低于所述目的植物的转基因植物；

所述降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质含量、所述抑制目的植物中权利要求1中所述DNA分子表达或所述对目的植物中权利要求1中所述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将权利要求1中所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中；

所述植物为玉米。