CN107937416B

CN107937416B - 提高水稻氮肥利用效率和产量的基因及其应用

Info

Publication number: CN107937416B
Application number: CN201711498519.7A
Authority: CN
Inventors: 傅向东; 李姍; 吴昆�; 田永航; 叶亚峰; 刘倩
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107937416A

Abstract

本发明公开一种控制氮肥利用效率和产量性状的基因OsGRF4与其等位基因及其应用。OsGRF4可以促进水稻氮肥吸收、转运和同化基因的表达和酶活性，进而提高水稻氮肥利用效率；同时，OsGRF4可以促进细胞分裂，提高光合作用效率，进而提升水稻产量。等位基因OsGRF4^ngr2在不影响株高性状的条件下，实现水稻氮肥利用效率和产量的协同提高。本发明还公开了OsGRF4^ngr2在小麦高产品种中表达可进一步提升小麦氮肥利用效率和产量增加。OsGRF4基因的启动子和编码区的SNP多态性可以作为鉴定水稻氮肥高效利用和高产品种的分子标记。OsGRF4对基于提高水稻和小麦氮肥利用效率及产量的育种有广泛的应用前景。

Description

提高水稻氮肥利用效率和产量的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种控制作物氮肥利用效率和产量的基因与其等位基因及其应用。本发明还涉及该基因的启动子序列和该基因编码的多肽序列，以及利用分子标记辅助选育、基因组编辑和转基因技术培育高产和氮肥高效利用水稻品种的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上十分重要的粮食作物，其总产量占世界粮食总产量的1/4，全球一半以上的人口以水稻为主食。一方面，因世界人口逐年增加，粮食刚性需求也不断增加；另一方面，耕地面积逐年减少、水资源短缺、自然灾害频繁发生、工业化程度加剧和人类活动造成环境破坏等问题越来越严重。因此，如何持续提高水稻单产是目前育种面临的巨大挑战。

上世纪60年代初，掀起了以半矮化育种为特征的第一次“绿色革命”。在过去的50年，半矮杆基因semi-dwarf(sd1)在籼稻育种中被广泛利用。半矮杆基因sd1增加了水稻的种植密度和抗倒伏能力，提高了收获指数，解决了因大量施肥导致的植株倒伏和减产问题，从而实现了水稻单产的大幅度提升。但是，半矮杆水稻品种表现出其生长发育对氮肥响应的减弱，也降低了水稻对氮肥的利用效率(nitrogen use efficiency，NUE)。半矮杆水稻品种的大面积推广与应用，导致化肥、农药的大量使用和土壤退化。

20世纪70年代以来，中国的氮肥使用量快速增长，从1980年每年施氮肥量为1269.4万吨增加到2014年每年施氮肥量为5995.9万吨，增长了3.7倍，年均增长率为4.67％。这期间，粮食产量的快速增长主要是由于施氮量的增加引起的。但是，过多的施加氮肥，不仅使农产业的生产成本提高，经济效益下降，而且会引起大气、江河、湖泊被污染等一系列的生态环境问题。因此，在不减产的条件下，如何减少氮肥的使用量是水稻育种与生产中必须要考虑的因素，以便于解决水稻产量提升与生态环境冲突问题。

目前，人们对植物氮吸收与利用的遗传调控机制的认识获得了较大的进展，例如，氮的转运蛋白(Crawford and Glass 1998；Forde 2000；Howitt and Udvardi 2000；Glasset al.2001；Williams and Miller 2001)的发现，以及负责将氮转变为氨基酸和其他化合物的酶类的功能研究(Campbell 1988；Lam et al.1996；Hirel and Lea 2001)。近年来，随着植物分子生物学和功能基因组学的迅速发展，利用QTL定位、GWAS分析和基因图位克隆等技术，成功地分离并鉴定了多个参与氮吸收与代谢调控相关的关键基因/主效QTL。例如，在玉米中，鉴定到一些参与低氮胁迫应答响应的QTL位点(Agrama et al.1999)；在水稻中，检测到了几个参与氮同化的酶(Yamaya et al.2002；Obara et al.2001，2004)、不同氮水平下植物剑叶中蛋白及氮含量、植物株高以及幼苗期耐低氮胁迫响应相关的一些QTL位点(Fang and Wu 2001；Lian et al，2005)等。尽管在水稻和玉米中已获得了几个氮高效利用相关的候选基因(Gallais and Hirel，2004；Martin et al.，2006；Obara et al.2001；Tabuchi et al.，2005)，但是人们对控制植物氮吸收与利用效率的遗传调控网络的认识还非常有限。

发明内容

本发明人利用¹⁵N同位素标记的铵根离子(¹⁵NH₄ ⁺)，筛选并鉴定了一些具有较高氮肥吸收能力的水稻品种。在此基础上，利用QTL定位和图位克隆的方法，分离并克隆了提高水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其优异等位变异OsGRF4^ngr2和OsGRF^RD23，鉴定了一批携带OsGRF4不同等位变异的近等基因系材料。通过对水稻近等基因系材料的表型分析及遗传互补实验，证明了该基因的功能。

本发明人的研究将为从分子水平揭示植物氮肥利用效率的遗传调控网络，为包括水稻、小麦在内的主要农作物氮高效利用和高产分子育种提供理论依据及具有重要育种利用价值的新基因资源。

因此，总的来说，本发明提供一种控制水稻氮肥利用效率和产量性状的基因及其应用。具体地，本发明涉及OsGRF4及其优异等位变异OsGRF4^ngr2和OsGRF^RD23，在不影响株高性状的条件下，实现水稻氮肥利用效率和产量的协同提升。本发明的目的在于提供一个可同时提高主要农作物(例如，水稻、小麦等)产量和氮肥利用效率的重要功能基因及其应用。

具体而言，本发明人利用¹⁵N同位素标记的铵根离子，通过对携带“绿色革命”基因sdl的半矮杆高产水稻品种材料进行铵态氮吸收速率的测定，鉴定到一个育种中间材料NM73(安徽荃银高科种业股份有限公司提供)具有较高的铵态氮吸收速率。利用NM73与籼稻品种南京6号(NJ6，中国水稻研究所钱前研究员提供)杂交所构建的遗传群体，通过QTL定位和图位克隆技术，成功地分离并克隆了一个控制水稻氮肥利用效率的关键基因OsGRF4(Growth-Regulating Factor4)。在此基础上，构建了水稻NJ6品种背景下的一对近等基因系NJ6-OsGRF4和NJ6-OsGRF4^ngr2，以及高产水稻品种9311背景下的一对近等基因系9311-OsGRF4和9311-OsGRF4^ngr2。通过多年多点的大田试验，证实了优异等位基因OsGRF4^ngr2能显著提高水稻氮肥利用效率和产量。本发明人还将优异等位基因OsGRF4^ngr2导入到高产粳稻品种武运粳7号(WYJ7-dep1，江苏武进水稻研究所钮中一研究员提供)和小麦高产品种科农199(KN199，中国科学院遗传发育所李俊明研究员提供)中。大田试验结果表明，在高产水稻和高产小麦中导入OsGRF4^ngr2，能实现氮肥高效利用和产量进一步提升。

本发明的第一方面，通过对携带“绿色革命”基因sd1的不同水稻资源材料进行¹⁵N同位素标记的铵态氮吸收速率的测定，鉴定到了一个水稻新品系NM73，它具有较高的铵态氮吸收速率。利用NM73与铵态氮吸收速率较低的籼稻品种南京6号杂交所构建的群体，通过QTL分析，鉴定到了两个控制水稻铵态氮吸收能力的主效QTL位点，qNGR1(Nitrogen GrowthResponses inChromosome l)和qNGR2(Nitrogen Growth Responses in chromosome 2)。在此基础上，我们对qNGR1的卡位区间进行精细定位和图位克隆，候选区段所有基因测序比较分析发现qngr1就是控制水稻株高的“绿色革命”基因sd1。同时，我们通过回交NJ6，开展qngr2的精细定位和图位克隆，并将qngr2卡位到了水稻第二条染色体的长臂端的一个2.7kb的物理范围内。对候选基因测序分析发现qngr2就是基因OsGRF4。通过构建南京6号背景下的近等基因系NJ6-OsGRF4^ngr2和遗传互补实验证实OsGRF4基因就是控制水稻氮肥吸收的关键基因。

本发明的第二方面涉及控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其优异等位基因，本发明人将所述优异等位基因命为OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23。

在一个实施方案中，提供所述控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其等位基因，其为一种分离的多核苷酸，编码SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其等位基因包含从下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：2-3、5-6或8中的任何一个所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列，

其中(2)和(3)中定义的核苷酸序列具有控制水稻氮肥利用效率和产量的功能。

在研究中，本发明人将OsGRF4的等位基因命名为OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23，其中OsGRF4^RD23与OsGRF4仅在基因组DNA中的启动子区存在差异，其cDNA序列与OsGRF4的cDNA序列完全一致，编码相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)；而OsGRF4^ngr23与OsGRF4在启动子区和cDNA序列中都存在差异，编码不同的氨基酸序列(即，OsGRF4^ngr23编码的氨基酸序列如SEQID NO：10所示)。具体地，与NJ6中的OsGRF4序列相比，OsGRF4^ngr2基因1kb范围内的启动子区域存在8个SNPs的差异，具体见SEQ ID NOs：1或4所示的核苷酸序列。与NJ6中的OsGRF4序列相比，OsGRF4^RD23基因1kb范围内的启动子区域也存在8个SNPs的差异，具体见SEQ ID NOs：1或7所示的核苷酸序列

在一个实施方案中，所述控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其优异等位基因的开放阅读框内包含从下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)编码SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；

(4)编码(1)中的氨基酸序列、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs：9或10所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9或10所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs：9或10所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，OsGRF4(编码SEQ ID NO：9，优选为SEQ ID NOs：2-3)既能控制水稻氮肥吸收与利用效率，也能控制氮肥用量对水稻生物量及产量增加的影响。具体地，水稻植株OsGRF4基因表达量增加，能够提高水稻氮肥吸收与利用效率，也能提高水稻生物量和产量。同样地，该基因的优异等位变异OsGRF4^ngr2(编码SEQ ID NO：10，优选为SEQ ID NOs：5-6)既能增加水稻的氮肥利用效率，同时还能增加水稻的产量。

优选地，本发明涉及的控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4如SEQ IDNOs：2-3所示，及其等位基因OsGRF4^ngr2如SEQ ID NOs：5-6所示，另一个等位基因OsGRF4^RD23如SEQ ID NO：8所示，OsGRF4^RD23的cDNA序列与OsGRF4的cDNA序列完全相同，二者编码的氨基酸序列也完全相同，核苷酸序列差异仅在启动子区。

具体而言，与OsGRF4基因的1kb启动子(SEQ ID NO：1)，OsGRF4^ngr2基因的1kb启动子(SEQ ID NO：4)具有8个SNPs，与OsGRF4基因的gDNA序列(SEQ ID NO：2)相比，OsGRF4^ngr2基因的gDNA序列(SEQ ID NO：5)具有14个SNPs。经进一步研究发现，OsGRF4^ngr2基因启动子区有3个特异的SNPs位点(即，c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T)与该基因的转录水平提高相关。OsGRF4^ngr2gDNA中的两个SNP位点(即，g.1187T＞A，g.1188C＞A)是在OsmiR396的识别位点区域，等位突变之后，导致OsmiR396不能够识别OsGRF4^ngr2的靶序列，进而导致OsGRF4的mRNA不能够被降解。

与OsGRF4基因的1kb启动子(SEQ ID NO：1)相比，OsGRF4^RD23基因的1kb启动子序列(SEQ ID NO：7)具有8个SNPs。其中，OsGRF4^RD23基因启动子区有3个特异的SNPs位点(即，c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T)与该基因的转录水平提高相关。

利用上述特异性的SNPs位点能够鉴别具有高氮肥利用率和高产量的水稻品种。例如，如果在水稻植株中能够检测到OsGRF4基因的启动子区域存在选自下述的任意一个、两个或全部三个特异的SNPs：A(c.-884)，T(c.-847)和T(c.-801)，或者能够检测到OsGRF4基因的编码区存在选自下述的任意一个或全部两个特异的SNPs：A(g.1187)和A(g.1188)，则能够判断所述水稻品种具有高氮肥利用率和高产量的潜力。通常可以利用PCR扩增酶切或者测序方法检测OsGRF4基因的启动子区域或编码区的SNPs差异。

本发明的第三方面涉及分离的多肽(也称蛋白质)，其由本发明所述的OsGRF4或其等位基因编码，其包含从下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列；

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列；

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；

(5)由本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

与OsGRF4基因编码的OsGRF4蛋白(SEQ ID NO：9)相比，OsGRF4^ngr2基因编码的OsGRF4^ngr2蛋白(SEQ ID NO：10)具有2个氨基酸的差异。进一步研究发现OsGRF4^ngr2对其下游目标基因具有较强的转录激活能力。OsGRF4基因的另一个等位基因OsGRF4^RD23由于cDNA序列与OsGRF4 cDNA序列完全一致，其也编码SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面提供所述控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4及其等位基因的启动子，其长度约为1kb，所述启动子包含从下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：1，4，7中的任何一个所示的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，OsGRF4的启动子序列如SEQ ID NO：1所示，等位基因OsGRF4^ngr2的启动子序列如SEQ ID NO：4所示，等位基因OsGRF4^RD23的启动子序列如SEQ IDNO：7所示。

在一个优选的实施方案中，OsGRF4和其等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23的相关序列如SEQ ID NOs：1-10所示，具体参见下表1。

表1.SEQ ID NOs：1-10的序列名称及其来源

本发明的第五方面涉及一种重组构建体，其含有本发明所述的控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的多核苷酸序列。其中所述构建体所用的载体可以是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

本发明的第六方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明所述的重组构建体，或在其基因组中整合有本发明所述的控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的多核苷酸序列。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。

本发明的第七方面涉及本发明的多核苷酸(即，控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因)或多肽或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在改良作物植物性状(例如，提高作物产量)和氮肥利用效率中的用途。

本发明还涉及改良水稻农艺性状(例如，提高水稻氮肥利用效率和产量)的方法，该方法包括培育含有本发明的控制水稻氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的多核苷酸序列或本发明的构建体的水稻植物。例如，所述方法可以包括：从含有本发明的控制水稻氮肥利用效率和产量基因OsGRF4或其的重组水稻细胞再生转基因水稻植株，或者将含有本发明所述的控制水稻的氮肥利用效率和产量的基因OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交，或者利用包含等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的重组农杆菌细胞转染水稻植株获得转基因水稻植株。所述性状包括但不限于：水稻的氮肥利用效率和产量等。也就是说，在水稻中过量表达OsGRF4基因或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23能够提高水稻的氮肥利用效率和水稻产量。

在本发明的第八方面中，本发明提供所述OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的用途，其用于控制水稻的氮肥利用效率和产量；调控氮的吸收和利用，但不仅限于此。

本发明的第九方面涉及一种培育改良的水稻品种的方法。该方法包括：利用包含OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的重组农杆菌细胞转染水稻植株获得转基因水稻植株，或者将OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23或OsGRF4经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交获得后代水稻植株，其中所获得的水稻植株优选是氮肥利用效率和产量得到改良的水稻植株。

在一个实施方案中，本发明还提供一种聚合育种方法，利用本发明的提高水稻氮肥利用率和产量的基因或其等位基因和dep1基因进行聚合育种。在水稻植株中共表达本发明的提高水稻氮肥利用率和产量的基因或其等位基因和dep1基因，能够进一步提高水稻的氮肥利用率和产量。

具体地，所述聚合育种方法可以包括：在携带dep1基因的水稻植株中过量表达OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23或OsGRF4经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因。在一个实施方案中，在携带dep1基因的水稻植株中过量表达OsGRF4基因。在另一个实施方案中，在携带dep1基因的水稻植株中过量表达OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23基因。在一个优选的实施方案中，在携带dep1基因的水稻植株中过量表达OsGRF4^ngr2基因。

其中dep1基因是一种直立密穗基因，还具有提高氮肥利用效率、增强光合作用效率和控制株高抗倒伏方面的功能。关于dep1基因，可以参见本申请人已授权的专利申请200810111529.5和20111002759.9，上述专利文件通过引用完全结合在本文中。

在本发明更优选的实施方案中，根据更详细的实验验证，本发明人发现可以利用OsGRF4基因及其优异等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23通过以下三种方式进行培育具有增加氮肥利用效率和产量的育种实验：

(1)改变水稻中OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23的表达水平；

(2)改变作物中OsGRF4或等位基因OsGRF4^ngr2和OsGRF4^RD23所编码的蛋白质的含量和活性；

(3)改变作物中OsGRF4基因的启动子序列或gDNA序列。

本发明的第十方面涉及一种培育提高氮肥利用效率和产量的小麦品种的方法。该方法包括：利用包含OsGRF4或优异等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23的重组农杆菌细胞转染小麦植株获得转基因小麦植株，其中所获得的小麦植株优选是氮肥利用效率和产量得到提升改良的小麦植株。

所述培育提高氮肥利用效率和产量的小麦品种的方法也可以包括：将含有OsGRF4或优异等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23的小麦植株与另一小麦植株杂交得到杂交小麦植株，使得在所述杂交小麦中OsGRF4或优异等位基因OsGRF4^ngr2或OsGRF4^RD23的表达量增加，从而获得具有高氮肥利用率和高产量的小麦。

综上所述，本发明提供下述实施方案：

1.控制氮肥利用效率和产量的基因，其编码SEQ ID NO：9或10示的氨基酸序列。

2.根据第1项所述的基因，其中所述基因如SEQ ID NOs：2-3、5-6或8中任一个所示。

3.包含权第1项或第2项所述的基因的重组构建体。

4.包含第1项或第2项所述的基因或权利要求3所述的重组构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物细胞，优选为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

5.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的作物的方法，所述方法包括：将第1项或第2项所述的基因转染到作物细胞中获得转基因作物植株，使得在所述转基因作物中第1项或第2项所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的表达量增加，从而获得具有高氮肥利用率和高产量的作物，其中所述作物为水稻或小麦。

6.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的作物的方法，所述方法包括：将含有第1项或第2项所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的作物植株与该作物另一植株杂交得到杂交作物植株，使得在所述杂交作物中第1项或第2项所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的表达量增加，从而获得具有高氮肥利用率和高产量的作物，其中所述作物为水稻或小麦。

7.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的水稻的方法，所述方法包括：在水稻植株中共表达第1项或第2项所述的基因和dep1基因，或在携带dep1基因的水稻植株中过量表达第1项或第2项所述的基因。

8.一种鉴别具有高氮肥利用率和高产量的水稻品种的方法，所述方法包括：分析OsGRF4基因的启动子区域是否存在选自下述的任意一个、两个或全部三个特异的SNPs：c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T，或者分析OsGRF4基因的编码区是否存在选自下述的任意一个或全部两个特异的SNPs：g.1187T＞A，g.1188C＞A，来判断所述水稻品种具有高氮肥利用率和高产量的潜力。

9.根据第8项所述的方法，其中利用PCR扩增酶切或者测序方法检测OsGRF4基因的启动子区域或编码区的SNP。

10.第1项或第2项所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NOs：1、4或7所示。

以下是对本发明中所用的一些术语的定义。除非另外指明，本发明所用的术语具有本领域普通技术人员已知的意思。

“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。

“嵌合基因”是重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。

“编码序列”是转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。

“杂交稻”是指两个遗传组成不同的水稻品种(系)间杂交产生的具有杂种优势的第一代杂交种的统称。目前生产上广泛使用的有三系杂交稻和两系杂交稻。三系杂交稻种子的生产需要雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的相互配套。不育系的不育性受细胞质和细胞核的共同控制，需与保持系杂交，才能获得不育系种子；不育系与恢复系杂交，获得杂交稻种子，供大田生产应用。两系杂交水稻的生产只需不育系和恢复系。其不育系的育性受细胞核内隐性不育基因与种植环境的光长和温度共同调控，并随光、温条件变化产生从不育到可育的育性转换，其育性与细胞质无关。利用光温敏不育系随光温条件变化产死育性转换的特性，在适宜的光温时期，可自交繁殖种子。

在本发明上下文中，“对应于”意指当不同OsGRF4基因或蛋白质的核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时，“对应于”一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对，但不必是在相对于特定OsGRF4各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。同样，当特定OsGRF4的编码或氨基酸序列与参照OsGRF4的编码或氨基酸序列比对时，“对应于”参照OsGRF4序列一些计数位置的该特定OsGRF4序列中核酸或氨基酸是与参照OsGRF4序列的这些位置比对，但不必是在该特定OsGRF4蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。

这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列非天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。

“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。

“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核酸序列，包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。

“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。

“同源重组”是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。

当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的多肽时，该核酸序列与参照核酸序列是“同类编码”。

“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境如，例如重组宿主细胞或转基因植物中。

“天然基因”指在未转化细胞的基因组中存在的基因。

术语“天然存在”用于描述可以在自然界中发现的客体，其与人工产生的客体不同。例如，可以从自然来源分离，并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是“天然存在”的。

“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。

“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。

“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。

“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。

“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。

这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。

“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶II的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。

“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。

“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。

“改组的”核酸是通过改组方法，如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人工的和可选地循环的方式(物理地或实际上)重组两个或多个核酸(或字符串)产生改组核酸。一般地，在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸；可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。在一些(但不是所有)改组实施方式中，期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地，可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上下文，改组可以指重组和筛选的全部过程，或可替代地，可以仅指全部过程的重组部分。

在两个核酸或蛋白质序列比对中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60％，优选80％，更优选90％，甚至更优选95％和最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。

为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。

例如，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或通过目测(通常参见，Ausubel等，下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。

适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对(HSPs)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值(Altschul等，1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列，用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于零)和N(错配残基的罚分值；总是小于零)计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11，期望值(E)10，截断值100，M＝5，N＝-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长值(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵为缺省值(参见，Henikoff&Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。

除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，那么认为检测核酸序列与参照序列相似。

两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。

在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic AcidProbes，第I部分第2章″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。

Tm是(在限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于Tm。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有1mg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15M NaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2x SSC漂洗15分钟(参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1x SSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6x SSC漂洗15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度，通常约0.01到1.0M Na离子浓度(或其它盐)，通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。

下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，2X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1％SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗。

两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此，蛋白质通常与第二蛋白质基本相同，例如，其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。

“合成的”指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，称更密切地类似双子叶和/或单子叶植物基因G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。

“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。

“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。

本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，GreenePublishing Associates&Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。

“植物转化”是指在植物中表达至少一种外源基因，目的是赋予转化的植物一种或多种理想的表型性状。

在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的水稻氮肥利用效率和产量性状的基因。具体地，可将本发明的水稻氮肥利用效率和产量性状的基因的核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，通过将所述水稻氮肥利用效率和产量性状的基因的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中而转染到植物的细胞或愈伤组织中，进而获得转化的植物，也叫转基因植物。

按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应控制氮肥利用效率和产量性状蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸不变的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35％，优选多于约45％，更优选多于50％，最优选多于约60％GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列，但可以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已被证明是不同的(Murray等，Nucl.Acids Res.17：477-498(1989))。此外，可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP 0 385 962(Monsanto)，EP 0 359 472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法，用本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变，如上述那些改变。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示提高水稻氮肥利用效率的主效QTL定位。(a)，从36种携带“绿色革命”基因sd1的水稻品种材料中筛选具有较高铵态氮吸收速率的水稻材料；(b)，利用NJ6和NM73杂交所构建的BC₁F₂群体，QTL分析鉴定到了控制水稻氮肥利用效率的主效QTL位点。

图2显示sd1影响水稻氮肥吸收与利用效率。(a)，株高比较；(b)，铵态氮吸收速率比较。

图3显示OsGRF4的1kb启动子区域SNPs分析。(a)，OsGRF4的1kb启动子区域的SNPs的单倍型分析；(b)，不同单倍型对OsGRF4的转录水平分析的影响；(c)，不同单倍型对铵态氮的吸收速率的影响。

图4显示SLR1蛋白调控OsGRF4-OsGIF1蛋白复合体的转录活性。(a)，OsGRF4，OsGIF1和SLR1蛋白之间两两互作；(b)，SLR1蛋白影响OsGRF4-OsGIF1蛋白复合体对下游靶基因启动子的DNA结合能力；(c)，SLR1蛋白降低OsGRF4-OsGIF1蛋白复合体对下游靶基因的转录激活能力。

图5显示在不同施氮水平下，NJ6背景的一对近等基因系NJ6-OsGRF4和NJ6-OsGRF4^ngr2的重要农艺性状表型比较分析。(a)，株型；(b)，铵态氮吸收速率；(c)，硝态氮吸收速率；(d)，株高；(e)，每穗穗粒数；(f)，千粒重；(g)，单株产量。

图6显示在不同施氮水平下，9311背景的一对近等基因系9311-OsGRF4和9311-OsGRF4^ngr2的重要农艺性状表型比较分析。(a)，株型；(b)，铵态氮吸收速率；(c)，硝态氮吸收速率；(d)，株高；(e)，剑叶宽度；(f)，倒一节直径；(g)，小区产量；(h)，每穗穗粒数；(i)，收获指数；(j)，地上部氮分配。

图7显示在不同施氮水平下，WYJ7-dep1背景的过表达OsGRF4^ngr2转基因材料的重要农艺性状表型比较分析。(a)，株型；(b)，铵态氮吸收速率；(c)，硝态氮吸收速率；(d)，株高；(e)，抽穗期；(f)，分蘖数；(g)，每穗穗粒数；(h)，单株产量。

图8显示CRISPR/Cas9技术敲除突变体osgrf4表型分析。(a)，株型；(b)，铵态氮吸收速率；(c)，水培4周幼苗的干重。

图9显示过表达OsGRF4^ngr2的小麦科农199转基因植株的重要农艺性状分析。(a)，株型；(b)，株高；(c)，穗茎节横切图；(d)，维管束数目统计；(e)，穗型；(f)，每穗穗粒数；(g)，硝态氮吸收速率；(h)，地上部氮分配；(i)，单株产量。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。本发明人通过深入研究，确定了一个能够提高水稻氮肥利用效率和增加水稻产量的主效QTL位点：qngr2，它位于水稻第2号染色体的长臂端；经进一步精细定位、图位克隆、遗传互补实验及其生物学功能研究证实其为基因OsGRF4。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，下列实施例仅用于进一步说明本发明，而不用来限制本发明的精神和范围。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

实施例1：鉴定控制水稻氮吸收效率的主效QTL-qNGR2

本发明人对携带有“绿色革命”基因sd1的36种不同的水稻资源材料，进行水培4周；之后测定不同品种材料对¹⁵N标记的铵态氮的吸收速率，筛选并获得了一份具有最高铵态氮吸收速率的水稻品系NM73(图1a)。NM73是安徽荃银高科种业股份有限公司选育的育种中间材料。

研究表明NM73的株高对外施氮肥不敏感：在低氮和高氮两种不同施肥处理后，其株高变化不明显。相反，籼稻品种南京6号(NJ6)材料的株高和产量等多种农艺性状对外源施氮肥很敏感：在低氮处理条件下，南京6号表现为株高较矮、分蘖数少和穗粒数少等性状；但在高氮处理下，南京6号植株的株高明显增高、分蘖数和穗粒数也显著增多。

为了进一步解析控制水稻氮肥利用效率的遗传基础及关键基因，本发明人利用NM73与南京6号杂交后的F₁材料，再与NJ6回交并自交一代，获得了BC₁F₂群体。利用QTL分析，鉴定到了两个控制氮肥吸收与利用的主效QTL位点：qNGR1和qNGR2(图1b)，分别位于第1号染色体和第2号染色体长臂上。经精细定位、图位克隆、候选基因测序比较分析等实验，证实了qngr1就是之前报道的“绿色革命”基因sd1。携带sd1基因的水稻植株表现为对氮肥响应不敏感，具体表现为：在不同氮浓度培养条件下，携带有sd1突变位点的水稻材料的株高变化不明显(图2a)。对NJ6背景下的一对近等基因系材料NJ6和NJ6-sd1进行水培，测定水稻根系对于铵态氮的吸收速率，研究结果显示，与NJ6相比，NJ6-sd1的铵态氮吸收速率明显降低(图2b)。

研究所用的分子标记是以PCR为基础的标记，包括SSR标记和自行设计InDel标记。SSR标记均来自McCouch等(2001，2002)发表的微卫星标记连锁图；STS标记是用SSR分析工具(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)分析克隆序列筛选出微卫星重复性好的SSR目标序列，再用Primer5分析软件对这些目标序列进行引物设计。从这些引物中选择了107对在染色体上均匀分布，且在亲本间多态性好的标记用于遗传背景筛选(QTL分析所用的引物及其序列详见表2)。

PCR程序按照Panaud等(1996)的方法稍加修改进行，具体为每管20μl扩增反应体系，包括：0.15μM SSR引物、200μM dNTPs、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl₂，0.01％明胶)、50～100ng模板DNA，1U Taq酶；反应程序为：94℃DNA变性5min、循环(94℃1min，56℃1min，72℃1min)36次、72℃再延伸5min。扩增出的PCR产物用6％聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳，电泳完毕后，凝胶成像。

表2氮肥利用效率QTL分析所用的引物及其序列

实施例2：qNGR2的精细定位和图位克隆

本发明人利用NM73和NJ6杂交的F₁材料，并以NJ6作为轮回亲本，连续多代回交，构建了BC₄F₂群体。在此基础上，开展精细定位和图位克隆，成功地分离并克隆了候选基因NGR2。精细定位和图位克隆所用的多态性标记引物序列如表3所示，多态性标记的检测方法如实施例1所述。

表3.精细定位和图位克隆所用的引物及其序列

在下述实施例中，通过卡位区段内候选基因测序比较分析和遗传互补验证实验，证实了NGR2候选基因为OsGRF4。

另外，本发明人经序列比对分析发现，能提高产量和氮肥高效利用的优异等位基因OsGRF4^ngr2的核苷酸序列与已经报道控制粒型的等位基因OsGRF4^GS2的核苷酸序列并不是完全相同。与NJ6品种中的OsGRF4基因的1kb启动子和gDNA序列(SEQ ID NO：1或2)相比，OsGRF4^ngr2基因在其1kb启动子和gDNA序列(SEQ ID NO：4或5)存在14个SNPs，其中，OsGRF4^ngr2基因启动子上有8个SNPs差异，基因编码区(gDNA)序列中有6个SNPs差异。

实施例3：优异等位基因OsGRF4^ngr2启动子区域的SNPs分析

与NJ6品种中的OsGRF4基因的1kb启动子(SEQ ID NO：1)相比，等位基因OsGRF4^ngr2在其1kb启动子(SEQ ID NO：4)中存在8个SNPs差异。本发明人对实施案例1中所阐述的不同水稻资源品种中的OsGRF4基因的1kb范围内的启动子区域进行测序分析，结果显示，等位基因OsGRF4^ngr2在其1kb启动子区域内存在3个特异的SNPs(c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T)变化。进一步研究表明这些SNP变化与增加OsGRF4基因的表达水平和水稻根系对氨态氮的吸收速率相关。

在此基础上，本发明人对225个栽培稻品种中的OsGRF4基因的1kb范围内的启动子区域的SNPs进行单倍型分析。研究结果表明存在3种不同的单倍型，分别为Hap.A(如：籼稻高产品种9311)，Hap.B(如：泰国高产籼稻品种RD23)和Hap.C(高产粳稻品种WYJ7)(图3a)。从3种不同的单倍型中选取不同的品种材料进行qRT-PCR分析和铵态氮吸收速率分析，发现携带Hap.B单倍型的水稻品种(我们将其优异等位变异命名为OsGRF4^RD23)具有较高的OsGRF4转录水平和铵态氮吸收能力(图3b，3c)。

鉴定3个特异SNPs(c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T)所用的引物序列如下：

pOsGRF4-F：TCGATGGCAACAGTGCATGAG

pOsGRF4-R：TTGCGTCTAC ATAGAGCGTG

检测OsGRF4基因的启动子区域是否存在选自下述的任意一个、两个或全部三个特异的SNP：c.-884T＞A，c.-847C＞T，c.-801C＞T，能够判断所述水稻品种是否具有高氮肥利用率和高产量的潜力。

实施例4：优异等位基因OsGRF4^ngr2基因编码区的SNPs分析

与NJ6的OsGRF4基因的gDNA序列(SEQ ID NO：2)相比，OsGRF4^ngr2基因的编码区的gDNA序列(SEQ ID NO：5)共存在6个SNPs差异，其中两个SNP位点变化(g.1187T＞A，g.1188C＞A)是在OsmiR396的识别位点。该突变导致mRNA不能被miR396识别，进而提高OsGRF4基因表达水平。

鉴定两个SNP位点变化(g.1187T＞A，g.1188C＞A)所用的引物序列如下：

gOsGRF4-F：gattccaagtactgcgagcg

gOsGRF4-R：ccaaatgagctgggcatgtt

检测OsGRF4基因的编码区是否存在选自下述的任意一个或全部两个特异的SNP：g.1187T＞A，g.1188C＞A，能够判断所述水稻品种是否具有高氮肥利用率和高产量的潜力。

实施例5：SLR1与OsGRF4-OSGIF1调控模块蛋白互作

根据Gateway体系构建载体的方法，设计引物如下：

OsGRF4-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGG CGATGCCGTATGCCTC

OsGRF4-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGTCACCATTA GTTGATCGAG

OsGIF1-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGCAGCAGCAACACCTGAT

OsGIF1-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGCTGCCTTCC TCCTCGGTGC

SLR1-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGAAGCGCGAGTACCAAGA

SLR1-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCGCCGCGGCGACGCGCC ATG

以NJ6的cDNA为模板，利用引物OsGRF4-F和OsGRF4-R、OsGIF1-F和OsGIF1-R、SLR1-F和SLR1-R分别扩增获得OsGRF4、OsGIF1和SLR1的CDS序列。利用Gateway BP Clonase IIEnzyme Mix将PCR产物和pDONOR载体进行重组连接，最适反应温度为25℃。反应1小时之后，转化大肠杆菌DH5α。第二天，挑取单克隆，摇菌，提取质粒，测序。选取测序正确的质粒，利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix将其与终载体p35S::nYFP-nos和p35S::cYFP-nos(由pCAMBIA2300载体改造而来)进行重组连接，最适反应温度为25℃。反应1小时，转化大肠杆菌DH5α，获得测序正确的p35S::OsGRF4-nYFP，p35S::OsGIF1-nYFP，p35S::OsGIF1-cYFP和p35S::SLR1-cYFP载体。

本实施例采用的双分子荧光互补技术BiFC(Bimolecular FluorescenceComplementation)方法简述如下：

1.按照农杆菌感受态细胞的转化方法，将已构建好的p35S::OsGRF4-nYFP，p35S::OsGIF1-nYFP，p35S::OsGIF1-cYFP和p35S::SLR1-cYFP载体转入农杆菌GV3101中，28℃培养。

2.待长出菌斑之后，挑取单克隆。用大约2～3mL含有卡那霉素和利福平抗性的液体LB培养基，对单克隆进行震荡培养，培养条件为28℃，220rpm，8～10小时或过夜。

3.测定菌液的OD₆₀₀。按照1mL反应体系中，p35S::OsGRF4-nYFP，p35S::OsGIF1-nYFP，p35S::OsGIF1-cYFP和p35S::SLR1-cYFP的最终OD₆₀₀为0.5；P19的最终OD₆₀₀为0.3进行计算，混合各组分。

4.室温，6,000rpm，离心2分钟。倒掉上清，用侵染溶液(pH 5.7的MES-KOH 10mM，MgCl₂ 10mM，乙酰丁香酮200μM)将菌体重悬，室温静置4小时。

5.用不带针头的1mL注射器，将重悬液注射在烟草叶片的下表皮中。

6.48小时之后，用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)进行观察。

烟草体系的BiFC实验证实，OsGRF4、OsGIF1和SLR1蛋白两两在细胞核内发生互作(图4a)。

Gateway体系所需中间载体载体pDONOR和Gateway BP Clonase II Enzyme Mix及Gateway LR Clonase II Enzyme Mix酶均购自Invitrogen公司。由pCAMBIA2300载体改造成为p35S::nYFP-nos和p35S::cYFP-nos的方法，是按照

Vector ConversionSystem with One

ccdB Survival^TM 2 T1R Competent Cells (For conversion ofany vector of choice into a

destination vector)所述的方法进行的。

实施例6：SLR1影响OsGRF4-OsGIF1复合体对下游靶基因启动子的DNA结合能力

根据EMSA反应体系的需要，设计引物如下(以OsAMT1.1为例)：WT-F(Biotin)：AGCGAAAACCACATCATTAATCGCGGCCTACAGCTACACATCCAGAT+BiotinWT-R：ATCTGGATGTGTAGCTGTAGGCCGCGATTAATGATGTGGTTTTCGCT

依照试剂盒(LightShift Chemiluminescent EMSA kit，购自Thermo FisherScientific公司，货号为20148)的说明，配制EMSA的反应体系。反应液需要在室温静置20分钟，之后，加入5×loading buffer，终止反应。配制反应液的同时，进行预电泳，约30～45分钟。预电泳结束后，将反应液依次加入点样孔内，待loading buffer至胶板的2/3处，停止电泳。电泳结束后，进行转膜，将条带印记在Hybond-N⁺膜上。之后，按照ChemiluminescentNucleic Acid Detection Module的说明进行封闭、漂洗和显影。用ImageQuant LAS4000进行显影及拍照。

研究结果显示，OsGIF1与OsGRF4蛋白互作，OsGIF1能增强OsGRF4对下游靶基因启动子区的DNA结合能力，而SLR1蛋白则会干扰OsGRF4-OsGIF1复合体对下游靶基因启动子区的DNA结合能力(图4b)。

实施例7：SLR1影响OsGRF4-OsGIF1复合体对下游靶基因的转录激活能力

将实施例5中所获取的OsGRF4全长cDNA，通过酶切连接的方式，利用BamHI和KpnI两个酶切位点将片段重组到效应基因载体(中国科学院遗传与发育生物学研究所陈受宜研究员提供，参见Yu-Jun Hao YJ，Wei W，Song QX，Chen HW，Zhang YQ，Wang F，Zou HF，LeiG，Tian AG，Zhang WK，Ma B，Zhang JS and Chen SY.(2011)Soybean NAC transcriptionfactors promote abiotic stress tolerance and lateral root formation intransgenic plants.Plant Journal.68(2)：302-313)上构建成p35S-GAL4BD-OsGRF4。

将实施例5中所获取的OsGIF1和SLR1全长cDNA通过酶切连接的方式，利用EcoRV和XbaI两个酶切位点将DNA片段重组到pCAMBIA2300载体上分别构建成p35S-OsGIF1和p35S-SLR1。

ChIP-PCR和EMSA的研究结果表明，OsAMT1.1是受OsGRF4直接调控的，设计引物如下：

OsAMT1.1-EcoRV-F：TGGATTGATGTGATATCTTTGGAGTATCTTCTCAACTTG

OsAMT1.1-Xbal-R：CTTGCAGATCCTCTAGACTTCCTCCCT CCCTCACCAA

从WYJ7中扩增OsAMT1.1基因启动子的约1.5Kb序列，通过EcoRV和XbaI重组到报告基因载体上构建成pOsAMT1.1::LUC载体。

通过转录激活实验分析发现，OsGRF4蛋白对下游靶基因具有转录激活活性，而OsGIF1蛋白可以增强OsGRF4对下游靶基因的转录激活能力。相反，SLR1则会抑制OsGRF4-OsGIF1复合体对下游靶基因的转录激活能力(图4c)。

本实施例采用的转录激活实验方法简述如下：取水稻幼苗的胚芽鞘切成条状置于酶解液中，暗处低速震荡裂解5～6小时后，加入等体积的W5溶液(154mM NaCl，125mMCaCl₂，5mM KCl，2mM MES，pH5.7)，200g低速离心5分钟，收集沉淀并用W5重悬清洗，反复清洗2次之后用MMg溶液(0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，4mM MES pH 5.7)重悬。将pOsAMT1.1::LUC、p35S-REN、p35S-GAL4BD-OsGRF4、p35S::OsGIF1和p35S::SLR1载体的质粒DNA按照REN∶LUC∶GAL4BD＝1∶6∶6比例(质量比)加入水稻原生质体。用等体积的PEG4000/Ca²⁺进行转化，静置15分钟之后，加入2倍体积的W5终止反应并进行清洗，置于W5溶液中黑暗培养16小时。收集原生质体后加入裂解液，使用PROMEGA双荧光检测试剂盒对LUC/REN值进行测定。

实施8：构建籼稻品种NJ6背景下的近等基因系NJ6-OsGRF4和NJ6-OsGRF4^ngr2并完成产量等农艺性状比较分析

本发明人在实施例2中所阐述的BC₄F₂群体中，选择携带qngr2位点的材料与NJ6继续进行回交3次，最终获得NJ6背景的一对近等基因系材料NJ6-OsGRF4(NJ6)和NJ6-OsGRF4^ngr2。在大田测产试验中，将NJ6背景的一对近等基因系材料种植在不同施氮量的大田中(施氮量分别为60kg/ha，120kg/ha，210kg/ha，300kg/ha)，观察并统计各种重要农艺性状。统计结果比较显示，不管在高氮还是低氮条件下，优异等位基因OsGRF4^ngr2不影响株高和每穗穗粒数，但能够显著增加千粒重和单株产量(图5)。

具体的统计方法：株高的统计：在水稻成熟后，分别在田间取30株进行测量株高。穗粒数的统计：在水稻成熟后，分别在田间取30株主分蘖上的穗，分别统计每个穗上的穗粒数直接计数并记录。单株产量的统计：在水稻完全成熟后，取小区内40个单株进行脱粒，收获的种子经过37℃恒温干燥后称重得到单株产量数据，需要进行3次重复试验。粒长、粒宽和千粒重的测量：籽粒自然干燥后，浮水冲去秕粒，37℃恒温干燥后，在室温条件下存放3个月及以上，保证籽粒的充分干燥和各株系间含水量的相对一致。从每个株系中随机选取形态正常的种子，以游标卡尺测量其粒宽、粒长，作为粒形的考查指标。籽粒千粒重根据随机选取的1000粒饱满籽粒进行估算，于电子天平上进行称量其总重，取20次的平均值即为千粒重。试验结果允许差：千粒重20g以下的不超过0.4g，千粒重20.1～50g的不超过0.7g，千粒重50.1g以上的不超过1.0g。剑叶宽度的测量：在灌浆完成之时，用直尺测量30株水稻的剑叶的中间部位。倒一节直径的测量：在灌浆完成之时，用游标卡尺测量30株水稻的倒一节的中间部位。

实施例9：构建携带“绿色革命”基因sd1的高产籼稻品种9311背景的一对近等基因系9311-OsGRF4和9311-OsGRF4^ngr2并完成产量等农艺性状分析

本发明人利用NM73与9311(携带“绿色革命”基因sd1的高产籼稻品种)杂交，选择含有qngr2位点的F₂材料，以9311为轮回亲本连续回交3代，获得携带sd1基因的一对近等基因系材料9311-OsGRF4和9311-OsGRF4^ngr2。在大田测产试验中，将9311背景下的一对近等基因系材料种植在不同施氮量的大田中(施氮量分别为60kg/ha，120kg/ha，210kg/ha，300kg/ha)，观察并统计一对近等基因系材料的各种重要农艺性状。统计结果显示，无论在高氮还是低氮条件下，与9311相比，9311-OsGRF4^ngr2的株高和收获指数都没有发生明显改变。但9311-OsGRF4^ngr2的剑叶宽度、倒一节直径、每穗穗粒数和小区产量显著增加(图6)。这些研究结果表明优异等位基因OsGRF4^ngr2和sd1聚合能进一步提升产量和氮肥利用效率。

具体的统计方法参见实施例8中所述。

实施例10：在高产粳稻品种WYJ7中，过量表达OsGRF4^ngr2能进一步提升水稻单量

OsGRF4^ngr2过表达载体的构建与转化方法如下：

根据OsGRF4^ngr2基因的cDNA序列，设计如下引物：

OsGRF4-XbalI-F：GCTCTAGAATGGCGATGCCGTATGCCTCC

OsGRF4-SalI-R：ACGCGTCGACTCAGTCACCATTAGTTGATC

以NM73的cDNA为模板，用引物OsGRF4-XbalI-F和OsGRF4-SalI-R扩增得到OsGRF4^ngr2的CDS片段。利用DNA限制性内切酶XbalI和SalI将片段和pCAMBIA2300载体(购自澳大利亚CAMBIA公司)进行酶切，分别回收酶切之后的片段和载体。利用DNAT4连接将片段和载体进行连接，之后转化大肠杆菌，获得测序正确的p35S::OsGRF4^ngr2-GFP载体。采用农杆菌介导的转化法将p35S::OsGRF4^ngr2-GFP导入到携带dep1基因的高产粳稻品种WYJ7(WYJ7-dep1；水稻转化由发明人实验室完成)。将转基因水稻种植在不同施氮量的大田(施氮量分别为60kg/ha，120kg/ha，210kg/ha，300kg/ha)中，观察并统计转基因材料的农艺性状。研究表明，当施氮量相同时，过量表达OsGRF4^ngr2不影响水稻株高、抽穗期和分蘖数；但是，能够显著增加穗粒数，进而提高氮肥利用效率和增加单株产量(图7)。这些研究结果表明，OsGRF4^ngr2与dep1聚合能进一步提升水稻的产量和氮肥利用效率。类似地，OsGRF4基因和其另外一个优异等位基因OsGRF4^RD23与dep1聚合也能狗进一步提升水稻产量和氮肥利用效率(数据未显示)。因此，本发明的OsGRF4基因与其等位基因可以用于与dep1基因聚合育种，培育产量和氮肥利用效率提高的水稻品种。

其中关于dep1基因，可参见本申请人已授权的专利申请200810111529.5和20111002759.9，上述专利文件通过引用完全结合在本文中。

具体的统计方法：分蘖数的统计：在水稻成熟后，分别在田间取30株进行测量统计分蘖数。其余的统计方法参见实施例8中所述。

实施例11：功能缺失水稻突变体osgrf4植株丧失氮响应能力

CRISPR/Cas9载体的构建与转化方法如下：

根据OsGRF4基因的gDNA序列，设计如下引物：

OsGRF4-CRISPR-F1：gcgtaagcaacgcgaacccg

OsGRF4-CRISPR-R1：CGGGTTCGCGTTGCTTACGC

OsGRF4-CRISPR-F2：GCGGTGGCCG ACCACCGCT

OsGRF4-CRISPR-R2：AGCGGTGGTCGGCCACCGC

以NJ6的gDNA为模板，用引物OsGRF4-CRISPR-F1和OsGRF4-CRISPR-R1，OsGRF4-CRISPR-F2和OsGRF4-CRISPR-R2，扩增得到目的片段，具体构建方法参见华南农业大学刘耀光教授发表的文章(A robust CRISPR/Cas9system for convenient，high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants.(2015)Molecular Plant，8(8)：1274-1284)，采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到WYJ7-dep1中(由发明人实验室完成水稻转化)。比较野生型和转基因水稻的表型分析发现，敲除OsGRF4的水稻突变体植株(osgrf4)长势弱小，植物生长发育和生物量积累基本丧失了氮肥用量的响应能力(图8)。

实施例12：OsGRF4^ngr2能提高水稻根系吸收氮的能力

将NJ6-sd1和9311背景下的近等基因系材料，WYJ7-dep1背景下的过表达材料和基因敲除系材料用20％的次氯酸钠溶液消毒30分钟。之后，放在37℃培养箱内，浸水吸胀24小时。沥干水分，转移至28℃培养箱内催芽。露白之后，转移至镂空的96孔板中，培养7天。选取长势一致的幼苗转移至盛有40L营养液(1.25mM NH₄NO₃，0.5mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.75mMK₂SO₄，1mM CaCl₂，1.667mM MgSO₄·7H₂O，40μM Fe-EDTA(Na)，19μM H₃8O₃，9.1μM MnSO4·H₂O，0.15μM ZnSO₄·7H₂O，0.16μM CuSO₄，and 0.52μM(NH₄)₃Mo₇O₂₄·4H₂O，pH5.5)的蓝色盒子中。不同氮浓度处理时，需要将标准营养，0.3N(0.375mM NH₄NO₃)和0.15N(0.1875mMNH₄NO₃)，培养4个周，每2天调节一次pH值。

培养4周以后，将水稻根系浸在0.1mM CaSO₄ 1分钟，之后转移至含有2.5mM K¹⁵NO₃或1.25mM(¹⁵NH₄)₂5O₄的营养液中5分钟，最后再转移至0.1mM CaSO₄ 1分钟。用滤纸或纱布吸干根系的水分，剪下根系，烘干，磨碎后，测定¹⁵N含量(由中国农科院李玉中实验室完成，所用仪器为Isoprime 100)。

研究结果显示，携带优异等位基因OsGRF4^ngr2的近等基因系材料或过量表达优异等位基因OsGRF4^ngr2的转基因材料，其根系的氮肥吸收速率明显增强(图5b，5c，6b，6c，7b，7c)。相反，利用CRISPR/Cas9技术敲除OsGRF4的水稻突变体osgrf4材料，其根系的氮吸收速率显著降低，并且丧失了氮响应的能力(图8b)。

实施例13：过量表达OsGRF4^ngr2能够提高小麦产量

将p35S::OsGRF4^ngr2-GFP载体转化小麦高产品种科农199(KN199，由中科院遗传发育所高彩霞实验室完成小麦转化)。在大田试验中，对转基因小麦的植株表型和各种重要农艺性状进行统计分析发现，与野生型KN199相比，KN199OsGRF4^ngr2-GFP过表达株系的株高并没有发生明显变化，但OsGRF4^ngr2-GFP过表达能够通过显著增强小麦根系的硝态氮吸收能力，增加穗茎节的粗度、穗长、每随穗粒数，进而增加单株产量(图9)。

具体统计方法见实例8中所述。

实施例14：测定水稻和小麦地上各组织中氮含量

在大田试验中，将种植在不同氮浓度(60kg/ha，120kg/ha，210kg/ha，300kg/ha)的近等基因系材料9311和9311-OsGRF4^ngr2和种植在正常施氮水平下的小麦品种KN199和转基因材料KN199p35S::OsGRF4^ngr2-GFP，植物成熟后，从根部割下，单株装进网袋中，放入37℃恒温干燥。每个样品割取30株，待植株完全干燥后，分离种子，颖壳和枝梗，茎秆，叶片等部分，磨成粉末，送到中国农科院进行氮浓度和氮含量测定(所用仪器为Isoprime 100)。

研究结果显示，在不同氮浓度培养条件下，9311-OsGRF4^ngr2的地上部分的总氮含量和分配到种子中的氮含量所占植株总氮含量的百分比都高于对照材料9311(图6j)。另外，转基因小麦KN199p35S::OsGRF4^ngr2-GFP植株的地上部分的总氮量和的种子中的氮含量也显著高于对照材料KN199(图9h)。这些研究结果表明优异等位基因OsGRF4^ngr2能提高氮肥吸收与利用效率。

本发明提及的所有文献均引用作为参考。在阅读本发明所阐述的上述内容之后，对本发明所作的各种改动或修改，均视同本发明的等价形式，均属于本发明所附的权利要求书的限定范围。

Claims

1.控制氮肥利用效率和产量的基因，其编码SEQ ID NO:9或10所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其中所述基因如SEQ ID NOs:2-3、5-6或8中任一个所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其中所述基因的启动子序列的核苷酸序列如SEQ IDNOs:1、4或7所示。

4.包含权利要求1或2所述的基因的重组构建体。

5.包含权利要求1或2所述的基因或权利要求4所述的重组构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

7.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的作物的方法，所述方法包括：将权利要求1或2所述的基因转染到作物细胞中获得转基因作物植株，使得在所述转基因作物中权利要求1或2所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的表达量增加，从而获得具有高氮肥利用率和高产量的作物，其中所述作物为水稻或小麦。

8.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的作物的方法，所述方法包括：将含有权利要求1或2所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的作物植株与该作物另一植株杂交得到杂交作物植株，使得在所述杂交作物中权利要求1或2所述的控制氮肥利用效率和产量的基因的表达量增加，从而获得具有高氮肥利用率和高产量的作物，其中所述作物为水稻或小麦。

9.一种培育具有高氮肥利用率和高产量的水稻的方法，所述方法包括：在水稻植株中共表达权利要求1或2所述的控制氮肥利用效率和产量的基因和dep1基因，或在携带dep1基因的水稻植株中过量表达权利要求1或2所述的基因。

10.一种鉴别具有高氮肥利用率和高产量的水稻品种的方法，所述方法包括：分析OsGRF4基因的启动子区域是否存在下述三个特异的SNPs：c.-884T>A，c.-847C>T，c.-801C>T，或者分析OsGRF4基因的编码区是否存在下述两个特异的SNPs：g.1187T>A，g.1188C>A，来判断所述水稻品种是否具有高氮肥利用率和高产量的潜力。

11.根据权利要求10所述的方法，其中利用PCR扩增酶切或者测序方法检测OsGRF4基因的启动子区域或编码区的SNP。