CN107130018A

CN107130018A - 水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用

Info

Publication number: CN107130018A
Application number: CN201710212967.XA
Authority: CN
Inventors: 金名捺; 丘式浚; 陈竹锋; 周君莉; 邓兴旺; 唐晓艳
Original assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2017-04-01
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2017-09-05

Abstract

本发明提供了一种水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用，属于农业生物技术领域，具体涉及一种水稻氮素高效利用基因qngr9的特异分子标记，以及利用所述引物检测氮素高效利用基因qngr9的方法。本发明为了提高水稻精准育种的效率，开发了一对氮素利用效率的分子检测标记，利用该分子检测标记，可以通过从植株的种子、叶片等组织器官取材，提取DNA，进行分子检测，从检测结果判断该植株是否具有氮素高效利用的性状。本发明所提供的方法可以加速育种进程，提高性状聚集的效率，从而培育出更高产、更适合农业生产化推广的水稻品种，在水稻育种和农业生产中具有重要的应用价值。

Description

水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种水稻氮素高效利用基因qngr9 的特异分子标记，以及利用所述引物检测氮素高效利用基因qngr9的方法。

背景技术

全世界有一半以上的人口以水稻为主食。我国是人口大国，稻谷年产量和消耗量均占世界总量的三分之一左右，随着人口的增加、居民消费水平的提高、农产品工业用途的拓展以及可耕地面积的减少，大幅度提高水稻单位面积的生产能力，已经成为保证我国粮食安全的必由之路。

在过去的几十年中，我国粮食单产和总产均有大幅度的提高，以占世界9％的耕地养活了占世界22％的人口，但同时却消费了世界近35％的化肥。化肥的投入对粮食的增产发挥了非常大的作用，但大量和不合理的施用肥料，导致了当前其利用效率的持续低下。因此，要在实现提高单位面积产量的同时减少肥料的投入，就必须大幅度提高作物养分的利用效率，其中主要并有效的途径之一就是在农业生产中种植养分高效的高产作物品种。

有研究报道，在目前我国的水稻生产中，氮肥过量施用达30％以上；另外综合各地的实验结果，我国每年农田氮肥的损失率是33.3％～73.6％，平均总损失率在60％左右(Peng et al,2010)。利用作物本身的遗传差异，充分发掘、利用氮素高效种质资源和克隆相关基因，培育氮素高效利用品种，是大幅度降低农田氮肥损失率最经济有效的途径。因此，一种新的育种目标应是培育适于低氮投入的新品种(Gallais et al，2005)。

大量研究表明，不同基因型水稻品种对氮肥反应存在很大差异(Zhang et al.,2009；Jiang et al.,2004)。最近，中国科学院遗传与发育生物学研究所傅向东课题组成功克隆到水稻氮素利用相关基因qNGR9，其为一个控制该性状的主效 QTL基因，且该基因与此前报道的DEP1基因为等位基因(Huang et al.,2009； Zhou et al.,2009；Taguchi-Shiobara et al.,2011)。在同等氮肥肥力水平生产条件下，携带突变型基因qngr9(亦即dep1)的植株个体相对于野生型植株个体具有更高的氮肥吸收利用效率，从而提高水稻植株的收获指数和作物产量。

qNGR9编码异三聚体G蛋白的γ亚基，而异三聚体G蛋白由α、β和γ三个亚基组成。Gγ蛋白qNGR9与Gα亚基RGA1和Gβ亚基RGB1发生了互作，导致RGA1活性降低，RGB1活性增高，从而抑制了氮反应(Sun et al.2014)。水稻直立型密穗/氮素高效利用基因dep1/qngr9是由控制水稻产量的关键多效基因 DEP1/qNGR9在第5外显子上有637bp的缺失和12bp的插入而产生的显性等位基因(Huang et al.,2009)。进一步的研究表明，DEP1/qNGR9在所有的物种中都是野生型，即重要性状氮素高效利用的dep1/qngr9突变型是在栽培稻的进化过程中获得并保存下来的。

在传统的水稻育种工作中，只能将植株播种栽培后，通过氮肥使用的对比试验来检测所栽种品种是否具有氮素高效利用的功能。本发明为了提高水稻精准育种的效率，开发了一对氮素利用效率的分子检测标记，利用该分子检测标记，可以通过从植株的种子、叶片等组织器官取材，提取DNA，进行分子检测，从检测结果判断该植株是否具有氮素高效利用的性状。

本发明所提供的方法可以加速育种进程，提高性状聚集的效率，从而培育出更高产、更适合农业生产化推广的水稻品种，在水稻育种和农业生产中具有重要的应用价值。

发明内容

氮素高效利用基因是水稻中与产量密切相关的基因，对作物高产分子育种有重要应用价值。提高水稻的生产能力对于保证粮食安全和发展国民经济都具有举足轻重的作用，然而水稻单产水平在经历矮化育种及杂交育种两次飞越后，一直处于停滞不前的状态，氮素高效利用基因在提高水稻单产的同时降低肥料的损失率，减少肥料流失对环境的污染。研究表明，氮素高效利用基因qngr9是一个显性基因，与野生型相比，其在第5外显子上有637bp的缺失和12bp的插入，从而造成qngr9与野生型在氮素利用效率上的功能差异。因此，qngr9在水稻高产和氮素高效利用育种中具有非常高的应用价值，而分子标记辅助选择在水稻高产聚合育种中具有重要的作用，能够大大提高水稻育种选育的效率。但是，到目前为止报道的许多分子标记往往不是来源于基因本身的DNA序列，在分子标记辅助选择过程中常常因为基因的重组打破了标记与目标基因之间的连锁关系，从而导致目标基因在育种过程中的丢失。因此，为了保证氮素高效利用基因的选择效率，需要针对其功能变异开发一个与表型完全共分离的分子标记。qngr9的野生型与突变体之间在大小上有625bp的差异，从Rice Genome Annotation Project上下载qngr9的基因组序列，在该变异附近设计一对引物qNGR9，因为该变异是氮素高效利用基因qngr9的功能变异，所以该标记能够保证qngr9基因的分子标记辅助选择过程的完全准确无误。

表1、用于qNGR9基因多态性分析的水稻品种

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测氮素高效利用基因dep1/qngr9的方法，本发明提供一对用琼脂糖凝胶的方法用于检测氮素高效利用基因dep1/qngr9的分子标记引物，所述引物根据dep1/qngr9基因编码区的插入/缺失进行设计，可以用于dep1/qngr9基因的辅助选择，以提高水稻分子标记辅助选择以及氮素高效利用品种选育的效率。

本发明提供如下解决方案：

一对用琼脂糖凝胶的方法用于检测水稻氮素高效利用基因dep1/qngr9的分子标记引物，其上、下游序列分别为：

qNGR9-F：5'-TGCTGCTCATGCTGTAAACC-3'(SEQ ID NO:1)；

qNGR9-R：5'-CGCTTCAATGGTTCAACCTC-3'(SEQ ID NO:2)；

上述引物根据水稻基因组在qNGR9基因编码区在武运粳7号与日本晴之间的差异进行设计，与日本晴的基因组序列相比，武运粳7号在qNGR9基因编码区有一个637bp的缺失和一个12bp的插入，最终造成两个品种在基因组序列大小上有625bp的差异。

一种利用琼脂糖凝胶检测氮素高效利用基因dep1/qngr9的方法：利用上述引物扩增24份水稻材料的基因组DNA(如表1)，用琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，结果如下：

通过对24个水稻品种的DNA的qNGR9引物扩增产物的琼脂糖凝胶检测，发现所有的品种都与24号品种武运粳(qngr9基因供体)呈现出了差异，且1 号到23号品种之间都没有显示出多态性。接着，我们对13号到24号品种的扩增产物进行测序，结果如下：

通过对13号到24号品种扩增产物的测序结果进行比对分析发现，与24号品种武运粳相比，其他品种都有一个637bp的缺失和一个12bp的插入，在扩增片段大小上13号到23号品种都为995bp，而武运粳的片段大小为370bp，即引物qNGR9在水稻品种qNGR9基因的野生型与突变体之间的扩增产物的片段大小差异为625bp。

上述扩增产物对应的日本晴核苷酸序列如下(加下划线部分表示与武运粳有差异的部分，其中加粗部分为替换或插入，斜体为扩增片段缺失的碱基序列)：

5'-TGCTGCTCATGCTGTAAACCTAACTGCAGTTGCTGCAAGACCCCTTCTTGCTGCAAACCGAACTGCTCGTGCTCCTGTCCAAGCTGCAGCTCATGCTGCGATACATCGTGCTGCAAACCGAGCTGCACCTGCTTCAACATCT GGGTTGTCGATGCCCACGGTGTCGTAACCCATGCTGTCTCAGTGGTTGCTTATGTTGATCTAGATCCTTTTTTGGTTGTTGTTTTTCTTGTATTTTTTAGTTGTTAGGCCTTTGATTAAGTTCGAACTTTCATAAATATATGGTGTTTATCCTGTAAAGAAATGATGATTTCAAGGATTTTTCATAGCTATGAGACGAGGTTGAACCATTGAAGCG-3'(SEQ ID NO:3)；

一种氮素高效利用水稻材料的分子标记辅助选择方法：以含有氮素高效利用基因qngr9的水稻材料(武运粳)为亲本，与其它不含有氮素高效利用基因qngr9 的水稻品种进行杂交，提取杂交或回交后代分离个体和两个亲本的基因组DNA，用引物qNGR9分别进行PCR扩增，其扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果呈现出三种带型。我们用武运粳7号为供体，用引物qNGR9为分子标记，将水稻氮素高效利用基因通过杂交回交的方法导入到优质籼稻品种黄华占中。在其BC₁F₁和 BC₁F₂代的苗期分别对24个植株进行取样提取DNA，并用引物qNGR9分别进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳的方法对扩增产物进行检测，结果如图3和图4。

在水稻成熟期，对所检测的植株进行穗部表型观察，发现1、2、4、9、10、 11、12、17、19、21、24号植株均表现出与黄华占类似的弯曲穗型，而3、5、6、 7、8、13、14、15、16、18、20、22、23号植株都表现出直立的穗型，这与qNGR9 是一个控制水稻直立穗型和氮素高效利用的多效性显性基因完全符合。

对所检测的BC₁F₂个体植株成熟期的穗部表型进行观察，发现1、4、9、17、 21、22号植株均表现出与黄华占类似的弯曲穗型，而2、3、5、6、7、8、10、 11、12、13、14、15、16、18、19、20、22、23、24号植株都表现出直立的穗型，这些结果与qNGR9是一个控制水稻穗部表型和氮素高效利用的显性基因是完全符合的。

附图说明

图1是引物qNGR9扩增水稻品种的多态性结果。

图2是引物qNGR9扩增产物的测序结果比对。

图3是引物qNGR9扩增黄华占回交武运粳BC₁F₁个体的电泳结果。

图4是引物qNGR9扩增黄华占回交武运粳BC₁F₂个体的电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。

实施例1：氮素高效利用基因qngr9分子标记辅助选择的必要性

氮素高效利用是一个很难通过肉眼来观察的表型，在传统的水稻杂交或回交育种中对其进行选择是非常不容易的；虽然氮素高效利用基因qngr9还控制一个直立穗的表型，但是在水稻扬花之前直立穗与弯曲穗的表型也是无法直接分辨的。基因组分子标记具有不受基因表达的限制和外界环境条件影响的特性，能够在幼苗期对目标基因进行高效率的选择，因此开发氮素高效利用基因qngr9的紧密连锁标记，在育种中对其进行分子标记辅助选择是十分必要的。

实施例2：qngr9基因的插入缺失多态性分析

分子标记对目标基因选择的准确性直接决定了分子标记选择的效率，它是分子标记辅助选择育种的前提。但是，目前报道的许多分子标记并不是来源于目标基因本身的DNA序列，常常因为基因重组而打破了分子标记与目标基因的连锁关系，从而导致目标基因的选择并不是完全可靠，甚至造成目标基因在分子标记辅助选择过程中的丢失。因此，根据基因本身的序列差异开发功能性分子标记，能够保证标记辅助选择育种的完全准确无误。研究发现，DEP1/qNGR9在所有的物种中都是野生型的，即重要性状氮素高效利用的dep1/qngr9突变型是在栽培稻的进化过程中获得并保存下来的。DEP1/qNGR9在野生型与突变体之间的 625bp的插入/缺失突变是造成氮素高效利用的功能性变异，因此可以根据该变异来开发完全连锁的功能性分子标记(如图1和图2)，从而应用于水稻的氮素高效利用的分子标记辅助选择育种实践，确保对qngr9基因选择的准确无误。

实施例3：qngr9基因完全共分离分子标记的引物设计与扩增产物检测

(1)引物设计

根据引物设计原则，在qngr9基因野生型与突变体之间插入/缺失625bp变异两端的相同序列处设计了一对基因特异性分子标记引物，引物对碱基序列如下：

qNGR9-F：5'-TGCTGCTCATGCTGTAAACC-3'(SEQ ID NO:1)；

qNGR9-R：5'-CGCTTCAATGGTTCAACCTC-3'(SEQ ID NO:2)；

(2)扩增产物的琼脂糖凝胶检测

通过qngr9特异性完全共分离分子标记引物qNGR9对含有纯合型qngr9基因的水稻材料武运粳7号、水稻两系不育系、水稻三系保持系、恢复系、常规稻以及其它水稻抗病亲本的DNA模板进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳的方法来进行检测(如图1)，武运粳7号的扩增产物与其他水稻材料都呈现出了多态性，而其他所有水稻材料的PCR扩增产物都没有显示出大小的差异。

PCR扩增反应体系如下：

ddH₂O：补足至10μL。

为了防止体系蒸发，在PCR扩增前需滴加15μL-20μL矿物油覆盖。

PCR扩增条件如下：

qNGR9：95℃3分钟；95℃30秒、54℃30秒、72℃1分钟，40个循环；72℃3 分钟。

PCR反应结束后，向每个扩增产物中加入3微升的6×Loading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳的电压为130V，大约20分钟左右，将凝胶置于观片仪中进行扫描。

实施例4：qngr9完全共分离分子标记在辅助育种中的应用分析

以含有氮素高效利用基因qngr9的水稻材料(本专利为武运粳7号)为亲本，与其它不含有氮素高效利用基因qngr9的水稻品种(本专利为黄华占)进行杂交和回交，提取杂交和回交后代个体和两个亲本的基因组DNA，以引物qNGR9-R 对所需分析的DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳的方法对其扩增产物进行检测，检测结果会呈现出三种类型，其中阳性对照“武运粳7号”呈现出大小为370bp的条带，另一对照亲本黄华占呈现出大小为995bp的条带(如图1)，两亲本的杂交后代个体也即杂合型个体则呈现出大小分别为995bp和370bp的两条条带(如图3和图4)。我们利用本专利中的引物qNGR9对含有qngr9基因的水稻材料武运粳7号与不含有该基因的水稻材料黄华占两亲本的BC₁F₁和 BC₁F₂代各24个个体植株以及其他不含有qngr9基因的22个水稻两系不育系、水稻三系保持系、恢复系、常规稻和其它水稻抗病亲本的DNA样品分别进行分子检测，它们的分型结果与植株个体的穗部表型完全一致(如图1、图3和图4)，因为qNGR9是一个同时控制水稻穗型和氮素利用效率的多效性显性基因，说明本发明所开发提供的共分离分子标记引物qNGR9可以高效、精确的用于鉴定水稻材料中是否含有氮素高效利用基因qngr9，同时可以进一步应用于水稻氮素高效利用基因qngr9的分子标记辅助选择的育种实践。

该功能标记的建立为水稻氮素高效利用品种的培育提供了一种新途径，同时也为分子标记辅助选择育种提供了有力的技术保障。与传统育种方法相比，分子标记辅助选择可以大大提高育种的效率。研究表明，氮素高效利用基因qngr9是一个显性基因，遗传力强，比较容易转育到其他品种中，但同时该基因具有多效性，转育到其他品种中后可能会使受体亲本产生一些不利的农艺性状，比如穗长变短、结实率下降、株高变矮等。因此，在育种实践中，首先我们尽可能的通过回交来减少供体的遗传背景，同时加大杂交回交育种的规模，选择具有目的基因且性状优良的后代，从而达到对受体亲本进行目标基因改良的同时，引入其他一些优良的性状。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳兴旺生物种业有限公司

深圳市作物分子设计育种研究院

<120> 水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgctgctcat gctgtaaacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgcttcaatg gttcaacctc 20

<210> 3

<211> 995

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

tgctgctcat gctgtaaacc taactgcagt tgctgcaaga ccccttcttg ctgcaaaccg 60

aactgctcgt gctcctgtcc aagctgcagc tcatgctgcg atacatcgtg ctgcaaaccg 120

agctgcacct gcttcaacat cttttcatgc ttcaaatccc tgtacagctg cttcaagatc 180

ccttcatgct tcaagtccca gtgcaactgc tctagcccca attgctgcac ttgcaccctt 240

ccaagctgta gctgcaaggg ctgtgcctgt ccaagctgtg gatgcaacgg ctgtggctgt 300

ccaagctgcg gatgcaacgg ttgtggctgt ccaagctgcg gttgcaacgg ctgtggcctt 360

ccaagctgcg gttgcaacgg ctgcggctcg tgctcttgcg cccaatgcaa acccgattgt 420

ggctcgtgct ctaccaattg ctgtagctgc aagccaagct gcaacggctg ctgcggcgag 480

cagtgctgcc gctgcgcgga ctgcttctcc tgctcgtgcc ctcgttgctc cagctgcttc 540

aacatcttca aatgctcctg cgctggctgc tgctcgagcc tgtgcaagtg cccctgcacg 600

acgcagtgct tcagctgcca gtcgtcatgc tgcaagcggc agccttcgtg ctgcaagtgc 660

cagtcgtctt gctgcgaggg gcagccttcc tgctgcgagg gacactgctg cagcctcccg 720

aaaccgtcgt gccctgaatg ttcctgtggg tgtgtctggt cttgcaagaa ttgtacagag 780

ggttgtcgat gcccacggtg tcgtaaccca tgctgtctca gtggttgctt atgttgatct 840

agatcctttt ttggttgttg tttttcttgt attttttagt tgttaggcct ttgattaagt 900

tcgaactttc ataaatatat ggtgtttatc ctgtaaagaa atgatgattt caaggatttt 960

tcatagctat gagacgaggt tgaaccattg aagcg 995

Claims

1.一种氮素高效利用基因dep1/qngr9的检测引物，其特征在于所述引物的正向引物是5'- TGCTGCTCATGCTGTAAACC -3'，反向引物是5'- CGCTTCAATGGTTCAACCTC -3'。

2.一种氮素高效利用基因dep1/qngr9的PCR检测方法，其特征在于所述PCR检测方法包含一对检测引物，所述检测引物的正向引物是5'- TGCTGCTCATGCTGTAAACC -3'，反向引物是5'- CGCTTCAATGGTTCAACCTC -3'。

3.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a）提取待测样本DNA；

b）用检测引物对进行PCR扩增；和

c）对PCR产物进行电泳分析。

4.一种氮素高效利用基因dep1/qngr9的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中包含下述检测引物，其中正向引物是5'- TGCTGCTCATGCTGTAAACC -3'，反向引物是5'-CGCTTCAATGGTTCAACCTC -3'。

5.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其中所述的试剂盒还包含PCR试剂。

6.权利要求4-5之任一所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述使用方法包括如下步骤：

a）提取待测样本DNA；

b）配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂盒的反应体系进行PCR扩增；

c）对PCR产物进行分析。

7.权利要求1所述的引物、权利要求2-3之任一所述的PCR检测方法、权利要求4-5之任一所述的试剂盒在检测水稻氮素高效利用基因dep1/qngr9中的应用。