CN112251434A - 一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的应用。本发明的突变体可显著在低氮条件下改良植物的农艺性状。

Description

一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的 应用

技术领域

本发明涉及作物遗传学领域，具体地涉及一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国第一大粮食作物。20世纪50年代末至60年代初的矮化育种和70年代三系杂交籼稻的成功应用，使我国水稻单产实现了两次大的飞跃，为满足我国粮食自给自足的作出了巨大贡献。进十几年来，随着我国人口数量的不断增加，对水稻总产的要求日渐提高。在现代农业生产过程中，人们对化学肥料的使用，尤其是氮肥的施用，对促进农业生产的发展起到了举足轻重的作用。但是，在人们大量施用氮肥的同时，也带来了诸多问题和影响，不仅对经济和资源造成巨大的浪费，还导致生态环境受到严重威胁，过量的使用氮肥导致土壤酸化、次生盐渍化，还会导致温室效应和臭氧层空洞，水体的富营养化等。因此，培育在低氮条件下，能够维持或提高现有水稻单产的新品种，是遗传育种家的重要课题。

microRNA(miRNA)是一类20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制。miRNA在植物中通过调控编码蛋白基因在原位细胞中的积累来控制植物的生长、发育、耐逆性等。

而目前的miRNA靶标在改良植物农艺性状方面的能力有限。

因此本领域迫切需要开发一种能够显著改良植物农艺性状的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够显著改良植物农艺性状的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物或其编码基因的突变体的用途，用于低氮条件下调控植物农艺性状或制备用于低氮条件下调控植物农艺性状的组合物或制剂，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：

(a)产量和/或生物量；

(b)穗型和/或粒型发育；

(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)粒长；

(e)粒宽；

(f)穗长；

(g)千粒重；

(h)叶长；

(i)叶宽；

(j)有效分蘖数；

(k)果荚数；

其中，所述核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-X2-X3 (I)

式中，X1选自SEQ ID NO.:1的1-12位或SEQ ID NO.:2的1-9位；

X2选自miR396的成熟序列/保守序列；

X3选自SEQ ID NO.:1的44-184位或SEQ ID NO.:2的41-176位；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述调控植物的农艺性状包括：

(a)提高产量和/或生物量；

(b)促进穗型和/或粒型发育；

(c)增加果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)增加粒长；

(e)增加粒宽；

(f)增加穗长；

(g)增加千粒重；

(h)增加叶长。

在另一优选例中，所述miR396的成熟序列/保守序列包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g、和/或miR396h的成熟序列/保守序列。

在另一优选例中，所述miR396的成熟序列/保守序列包括miR396e、和/或miR396f的成熟序列/保守序列。

在另一优选例中，所述X2选自SEQ ID NO.:1的13-43位或SEQ ID NO.:2的10-40位。

在另一优选例中，所述低氮条件指所述培养基或大田生长条件的氮含量N_L与全素培养基或大田生长条件下中氮含量N0之比(N_L/N0)为0-1，较佳地，0.01-0.9，较佳地0.1-0.9，较佳地0.3-0.8，更佳地0.5-0.8，更佳地0.6-0.8。

在另一优选例中，所述核酸构建物选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1或2所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(c)在SEQ ID NO.:1或2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

在另一优选例中，所述编码基因编码权利要求1中所定义的核酸构建物。

在另一优选例中，所述编码基因包括MIR396a、MIR396b、MIR396c、MIR396d、MIR396e、MIR396f、MIR396g和/或MIR396h。

在另一优选例中，所述编码基因包括MIR396e和/或MIR396f。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因来源于水稻。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体来源于水稻。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g和/或miR396h的突变体。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体包括miR396e和/或miR396f的突变体。

在另一优选例中，所述组合物为农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物包含(a)miR396抑制剂；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻或其组合。

在另一优选例中，所述权利要求1中所定义的核酸构建物或其编码基因的突变体是天然的或人工合成的。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体包括对权利要求1中所定义的核酸构建物或其编码基因的碱基的替换、插入、和/或缺失，优选大片段缺失。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体的表达或活性比野生型的核酸构建物或其编码基因的表达或活性降低了≥50％，更佳地，≥70％，更佳地，≥90％或100％。

在另一优选例中，当所述核酸构建物或其编码基因的突变体的活性E1与所述野生型的核酸构建物或其编码基因的突变体的本底活性E0之比≤1/2，较佳地≤1/5，更佳地≤1/10，更佳地，为0。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体降低、沉默或丧失对靶标基因的调控作用。

在另一优选例中，所述靶标基因包括GRF基因。

在另一优选例中，所述GRF基因选自下组：GRF4、GRF6、GRF8、或其组合。

在另一优选例中，所述GRF基因包括GRF8。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变位点至少包括部分成熟序列区或保守序列区。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变位点在成熟序列区或保守序列区。

本发明第二方面提供了一种GRF基因或其编码蛋白促进剂的用途，用于低氮条件下调控植物农艺性状或制备用于低氮条件下调控植物农艺性状的组合物或制剂，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：

(a)产量和/或生物量；

(b)穗型和/或粒型发育；

(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)粒长；

(e)粒宽；

(f)穗长；

(g)千粒重；

(h)叶长；

(i)叶宽；

(j)有效分蘖数；

(k)果荚数。

在另一优选例中，所述GRF基因包括GRF4、GRF6和/或GRF8。

在另一优选例中，所述GRF基因包括GRF蛋白编码基因和GRF基因保守区序列。

在另一优选例中，所述GRF基因包括野生型GRF基因和突变型GRF基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型GRF基因编码的多肽与野生型GRF基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型GRF基因包括与野生型GRF基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型GRF基因包括在野生型GRF基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的GRF基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述GRF4基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:3或4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:5所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:5所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述GRF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述GRF6基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:6所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:7所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述GRF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述GRF8基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:9所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述GRF8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

在另一优选例中，所述GRF4蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:3或4所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:3或4所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:3或4所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述GRF4活性的多肽。

在另一优选例中，所述GRF4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3或4所示。

在另一优选例中，所述GRF6蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述GRF6活性的多肽。

在另一优选例中，所述GRF6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述GRF8蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:8所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:8所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述GRF8活性的多肽。

在另一优选例中，所述GRF8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述GRF基因或其编码蛋白促进剂包括促进GRF基因或其编码蛋白表达或活性的物质。

在另一优选例中，所述GRF基因或其编码蛋白表达或活性指将GRF基因或其编码蛋白的表达或活性提高≥10％，较佳地，≥20％，较佳地，≥50％，更佳地，≥70％。

在另一优选例中，所述GRF基因或其编码蛋白促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述GRF基因或其编码蛋白来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜。

在另一优选例中，所述GRF基因或其编码蛋白来源于水稻。

在另一优选例中，所述组合物为农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物包含(a)GRF基因或其编码蛋白的促进剂；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻或其组合。

本发明第三方面提供了一种改良植物农艺性状的方法，包括：

在低氮条件下，降低植物中miR396的表达或活性或提高植物中GRF基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述GRF基因选自下组：GRF4、GRF6、GRF8、或其组合。

在另一优选例中，所述GRF基因包括GRF8。

在另一优选例中，所述的降低植物中miR396的表达或活性是通过以下方式实现：

(1)使植物体内miR396突变获得权利要求1所述的核酸构建物突变体，和/或

(2)在所述植物中导入miR396的抑制剂。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将miR396的抑制剂导入所述植物或植物细胞，从而获得miR396表达下调的植物或植物细胞。

在另一优选例中，所述miR396的抑制剂包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g和/或miR396h的抑制剂。

在另一优选例中，所述miR396的抑制剂包括miR396e和/或miR396f的抑制剂。

在另一优选例中，所述的miR396的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述“降低”是指miR396的表达或活性降低满足以下条件：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；其中，A1为所述植株中miR396的表达或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同miR396的表达或活性。

在另一优选例中，所述的降低指与野生型MIR396的表达水平E0相比，所述植株中MIR396的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，更佳地，0-30％。

在另一优选例中，所述的降低植株中miR396的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。

在另一优选例中，所述的降低植株中miR396的表达或活性通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR396进行基因编辑。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物GRF基因或其编码的多肽的促进剂。

在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入外源的GRF基因或其编码蛋白。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将GRF基因序列导入所述植物或植物细胞，从而获得GRF基因表达上调的植物或植物细胞。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带GRF基因序列的表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GRF的基因序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入GRF基因序列的植物细胞或组织或器官；和

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

在另一优选例中，所述改良植物农艺性状包括：

(a)提高产量和/或生物量；

(b)促进穗型和/或粒型发育；

(c)增加果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)增加粒长；

(e)增加粒宽；

(f)增加穗长；

(g)增加千粒重；

(h)增加叶长；

(i)增加有效分蘖数。

本发明第四方面提供了一种在低氮条件下改良植物农艺性状的组合物，包括：

(i)miR396抑制剂、和/或GRF基因或其编码蛋白的促进剂；和

(ii)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(a)，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述改良植物农艺性状包括：

(a)提高产量和/或生物量；

(b)促进穗型和/或粒型发育；

(c)增加果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)增加粒长；

(e)增加粒宽；

(f)增加穗长；

(g)增加千粒重；

(h)增加叶长。

本发明第五方面提供了一种本发明第四方面所述的组合物的用途，用于低氮条件下改良植物的农艺性状。

本发明第六方面提供了一种制备经基因编辑的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：

在低氮条件下，降低植物组织或植物细胞中的miR396的表达或活性、和/或提高植物组织或植物细胞中GRF基因或其编码蛋白的表达或活性，从而获得经基因编辑的植物组织或植物细胞。

本发明第七方面提供了一种制备经基因编辑的植物的方法，包括步骤：

将本发明第六方面所述的方法制备的经基因编辑的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得经基因编辑的植物。

本发明第八方面提供了一种经基因编辑的植物，所述的植物是用本发明第七方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了不同mir396e突变类型对种子粒型的影响。

图2显示了野生型和mir396e突变型种子粒型差异。

图3显示了不同氮素条件下，植株的生长态势。

图4显示了低氮条件下，miR396ef突变对种子粒型、千粒重的影响。

其中，(a)miR396ef突变对粒长、粒宽的影响；

(b)miR396ef突变对粒厚的影响；

(c)miR396ef突变对千粒重的影响。

图5显示了种子的切片观察。

其中，(a)miR396ef突变对颖壳细胞长的影响；

(b)miR396ef突变对内稃和外稃细胞数量的影响。

图6显示了mir396ef突变对穗长、主枝、穗粒数的影响。

其中，(a)miR396ef突变对穗长的影响；

(b)miR396ef突变对主分枝数的影响；

(c)miR396ef突变对穗粒数的影响。

图7显示了mir396ef突变对水稻产量的影响。

其中，(a)非低氮条件下，miR396ef突变体的产量；

(b)低氮条件下，miR396ef突变体的产量。

图8显示了miR396ef突变对水稻叶长的影响。

图9显示了mir396ef突变对水稻株高的影响。

图10显示了mir396ef突变对水稻生物量的影响。

图11显示了mir396ef通过miR396-GRF4/6/8-GIF1/2/3途径调控子粒和穗型发育。

其中，(a)mir396靶向抗性基因序列；

(b)np:rGRF4、np:rGRF6和np:rGRF8对籽粒粒型的影响；

(c)np:rGRF6和np:rGRF8对穗长的影响；

(d)GRE-GIF的相互作用；

(e)gif1突变体的株型和种子育型。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现或合成一类新的miR396及其家族成员的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体。本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体可在低氮条件下显著改善植物农艺性状，包括：(a)提高产量和/或生物量；(b)促进穗型和/或粒型发育；(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；(d)粒长；(e)粒宽；(f)穗长；(g)千粒重；(h)叶长；(i)叶宽；(j)有效分蘖数；(k)果荚数等。此外，发明人还意外发现，提高GRF(比如GFR4、6、和/或8)基因或其编码蛋白的表达或活性，可在低氮条件下显著改善植物农艺性状，包括：(a)提高产量和/或生物量；(b)促进穗型和/或粒型发育；(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；(d)粒长；(e)粒宽；(f)穗长；(g)千粒重；(h)叶长；(i)叶宽；(j)有效分蘖数；(k)果荚数，此外本发明首次发现，本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体在低氮条件下通过GRF(如GRF4/6/8)影响植物产量、生物量；穗型和/或粒型发育；果实和/或种子的大小、重量和/或数量；粒长；粒宽；穗长；千粒重；叶长；叶宽；有效分蘖数；果荚数等性状。在此基础上，本发明人完成了本发明。

GRF基因

如本文所用，术语“GRF基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有调控植物农艺性状的基因。

在一优选例中，本发明基因包括GRF4、GRF6、GRF8，优选的，本发明的基因包括GRF8。更佳地，本发明GRF基因来源于水稻。

GRF，全称为growth-regulating factors,是植物特有的一类转录因子。它可以通过N-末端QLQ结构域与GIF(GRF-interaction factor)蛋白中的SNH结构域互作,形成功能复合体,共同参与下游基因的表达调控。不同物种间其成员个数略有不同，拟南芥中含有9个，水稻中含有12个，玉米含有14个。

本发明的GRF基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。基因组DNA可以是与SEQ ID NO.:5、7、9所示的序列相同或者是简并的变异体。本发明的DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:5、7、9所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:3、4、6或8的蛋白质，但与SEQ ID NO.:5、7、9所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:3、4、6或8的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码耐热性能相关多肽的多聚核苷酸。

GRF基因编码的多肽

如本文所用，术语“本发明多肽”、“GRF基因编码的多肽”、“GRF基因编码的蛋白”、“GRF多肽”可以互换使用，都是指本发明的具有在低氮条件下调控植物农艺性状的多肽。

在一优选例中，本发明多肽包括GRF4、GRF6和/或GRF8。更佳地，本发明多肽来源于水稻。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GRF多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GRF多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在优选例中，本发明多肽指具有在低氮条件下调控植物农艺性状的SEQ ID NO.:3、4、6或8的序列的多肽。还包括具有与GRF多肽相同功能的、SEQ ID NO.:3、4、6或8的序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GRF多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SPL多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GRF多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GRF多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GRF多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GRF多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供GRF多肽或其类似物。这些类似物与天然GRF多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GRF多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.:？？的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

GRF基因或其编码蛋白的促进剂

在本发明中，GRF基因或其编码蛋白的促进剂包括能够提高GRF基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。

在本发明中，所述GRF基因或其编码蛋白的促进没有特别限制，只要能够促进GRF的表达或者增强GRF蛋白活性都在本发明的保护范围内。

在一优选实施方式中，所述GRF基因或其编码蛋白的促进剂包括小分子化合物、核酸、酶等。

miR396

miR396是含有20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，主要位于编码序列的5＇端，其5＇端与3＇端配部分碱基相互配对，使其形成颈环结构，其包含8个成员miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g、miR396h。通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制，在植物生长发育过程中发挥着重要的调节作用。

在一优选实施方式中，miR396e的序列如SEQ ID NO.:1所示，miR396f的序列如SEQID NO.:2所示。

miR396的成熟序列/保守序列

在本发明中，成熟序列/保守序列指RNA前体序列经过剪切加工后形成的真正发挥功能的序列。

具体地，本发明中miR396代表RNA前体序列；所述的成熟序列是RNA前体序列经过剪切加工后形成的RNA序列；保守序列是指不同物种间序列一致的RNA片段，成熟序列可以等同于保守序列，成熟序列与保守序列可以存在交叉，保守序列可以比成熟序列长。MIR396代表编码miR396的DNA序列。

在miR396家族中，miR396家族的亚型a、b、c、d、e、f、g、h之间的成熟序列/保守序列的相似度非常高。

本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体

本发明提供了一种核酸构建物或其编码基因的突变体，用于低氮条件下调控植物的农艺性状。

在本发明中，本发明的核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-X2-X3 (I)

式中，X1选自SEQ ID NO.:1的1-12位或SEQ ID NO.:2的1-9位；

X2选自miR396的成熟序列/保守序列；

X3选自SEQ ID NO.:1的44-184位或SEQ ID NO.:2的41-176位；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在本发明中，本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g和/或miR396h突变体。

在本发明中，本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体可以是单一突变，可以是双突变，可以是多突变，优选单突变或双突变，更优选miR396e和/或miR396f的突变。

本发明的构建物中所用的各种元件或者是本领域中已知的，或者可用本领域技术人员已知的方法制备。

将本发明的构建物的编码基因的突变体或GRF基因插入外源载体(尤其是适合转基因植物操作的载体)，就构成了本发明的载体。

将本发明的载体转化植物细胞从而介导本发明的载体对植物细胞染色体进行整合，制得转基因的植物细胞。

将本发明的转基因的植物细胞再生为植物体，从而获得转基因的植物。

将本发明构建好的上述核酸构建物的编码基因的突变体，通过常规的遗传转化技术(例如农杆菌转化技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物的编码基因突变体(或带有所述核酸构建物的编码基因突变体的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的编码基因突变体的植物细胞。

miR396的抑制剂

本发明还提供了一种针对miR396的抑制剂，所述miR396的抑制剂可抑制miR396的表达或活性。在本发明中，所述miR396的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。

用途

本发明还提供了本发明的式I所示核酸构建物或其编码基因的突变体、miR396抑制剂、和/或GRF基因或其编码蛋白促进剂的用途，它们被用于低氮条件下调控植物的农艺性状。在本发明中，本发明的式I所示核酸构建物或其编码基因的突变体来源于水稻。

在本发明中，可通过基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术等技术抑制miR396的表达或活性。

在一优选实施方式中，可通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR396进行基因编辑。

植物(如水稻)改良

本发明还提供了一种改良植物(如水稻)的方法，所述的改良包括：(a)提高产量和/或生物量；(b)促进穗型和/或粒型发育；(c)增加粒长；(d)增加粒宽；(e)增加穗长；(f)增加千粒重；(g)增加叶长；(h)增加叶宽，包括步骤：在低氮条件下，降低植物中miR396的表达或活性、施用miR396的抑制剂、本发明第一方面所定义的核酸构建物或其编码基因的突变体、和/或提高植物中GRF基因或其编码蛋白的表达或活性。

本领域技术人员公知，不同种类作物中同一性状可以采用不同的术语表征，或者同一性状通过多种术语不同的其他性状进行表征，如在小麦、水稻等作物中，其可以通过穗长、穗粒数、粒型等形状反应其产量；在大豆中，可通过果荚数、粒型来反映其产量；在番茄中，可以通过果实大小、数量来反映其产量；因此，本发明对农作物性状的改良不局限于本发明所列举的性状，还包括本发明未列举的在其他农作物中与本发明所述性状相同概念的其他性状。

在本发明中，还可进一步用常规方法将其他可以调控植物性状的物质处理植物或植物种子，从而改良对应植物的性状。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现一类新的的miR396及其家族成员的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体，尤其是miR396e和/或miR396f亚型突变体，可在低氮条件下显著改良植物性状，包括(a)提高产量和/或生物量；(b)促进穗型和/或粒型发育；(c)增加粒长；(d)增加粒宽；(e)增加穗长；(f)增加千粒重；(g)增加叶长；(h)增加叶宽。

(2)本发明首次发现，本发明的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体可上调GRF8基因表达。

(3)本发明首次发现，本发明的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体通过miR396-GRF4/6/8-GIF1/2/3途径调控子粒和穗型发育。

(4)本发明首次发现，本发明的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体可降低氮肥的使用量，提高氮肥的利用率，提高水稻生物质能源积累量，提高水稻的产量和生物量，同时降低氮肥对环境污染。

(5)本发明首次发现，提高植物中GRF(包括GRF4、6、和/或8，尤其是GRF8)基因或其编码蛋白的表达或活性，可在低氮条件下显著改良植物性状，包括(a)提高产量和/或生物量；(b)促进穗型和/或粒型发育；(c)增加粒长；(d)增加粒宽；(e)增加穗长；(f)增加千粒重；(g)增加叶长；(h)增加叶宽。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂或材料均为市售产品。

在本发明中，本发明所用培养基为市售木村B培养基，全素条件为本发明的市售木村B培养基，含有植物生长中所需的各种成分，其中氮素含量为(0.034g/L)；无氮条件为在本发明所用市售木村B培养基的基础上，不含有氮素但含有其他全部分成分。

本发明所述的低氮条件为氮肥用量低于作物生长过程中所施用的常规肥量或土地中不施用额外氮肥，所述的常规肥量为本领域技术人员或农民所知的为保证农作物稳产、高质所施用的肥量。本发明实施例所述的大田操作中，所述的低氮条件为植物生长环境中未额外施加氮肥的情况。

在本发明中，低氮条件的氮素含量为全素条件氮素含量的3/5-4/5。

氮肥的常规用量，比如水稻，小麦，玉米为150-350千克每公顷，不同作物不同地区用量有所不同，常规量可以由本领域技术人员或农民种植经验进行确定。

实施例1在低氮条件下，miR396e单突变可以增加水稻产量

1、基因编辑位点设计

为设计针对miR396e的基因编辑载体，避免同时靶向miR396的其它家族成员。特选取在miR396前体的stem-loop序列上选取靶向位点，针对该靶标位点设计sgRNA序列：GCUCAUGUUGGGAUUGUGGU(SEQ ID NO.:10)。

2、CRISPR-Cas9基因编辑工具的构建

A)ddH₂O溶解引物至10μM，正/反向引物各1μl加入8μl退火溶液(anneal buffer：TE buffer加50mM NaCl)，混匀；

B)将混匀的引物运行annealling program，PCR仪升温至95℃保持5min，然后每1s降0.1℃，降至16℃；

C)用Bsa I酶切CRISPR-Cas9载体，回收载体片段，备用；

D)连接gRNA和Crispr-Cas9载体，

加水至10μl,16℃连接2hr。

E)转化大肠杆菌，挑单克隆M13F测序验证片段成功连入载体。

3、载体遗传转化

A)上述构建质粒直接转化农杆菌EHA105：

1.农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，之后冰浴30min,放入液氮中1min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴2min。

2.取出离心管，加入LB培养基，振荡培养3～5hr。

3.取出菌液与含相应抗生素的LB培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养。2天左右菌落可见。

B)水稻转基因：

1.愈伤组织诱导，去壳种子用NaClO浸泡消毒，无菌水冲洗后接种于NB诱导培养基中，在培养箱中培养10–15天。

2.愈伤组织继代，将诱导出的愈伤组织用单面刀切下，放入继代培养基，相同条件下培养。

3.农杆菌浸染与抗性愈伤组织筛选，将转入目的载体的农杆菌EH105菌株扩繁，后浸泡状态较好的愈伤组织。

4.吸出或倒掉菌液，将愈伤组织放在箱暗培养48–72h。

5.共培养结束后的愈伤组织用Carbenicillin抗性的无菌水浸泡冲洗，以除去农杆菌。

6.愈伤组织吸干液体，将其接种于含抗生素的筛选培养基上，光照培养两周。

7.愈伤组织分化培养，挑选生长旺盛的愈伤组织(抗性愈伤组织)转移到含抗生素的分化培养基上。一周时间内大部分愈伤组织快速生长，并在愈伤组织表明出现绿点，变绿的愈伤组织会快速分化出幼苗。

4、植株培养及突变体筛选

A)将分化出的健壮幼苗转移至含抗生素的生根培养基中生根培养一周，室温练苗2-3天后，温室基质栽培15-20天后移栽入大田。

B)取每株植物的叶片，提取基因组DNA，在靶向位点两侧设计引物。扩增得到的片段进行Sanger测序，确定每株植物的基因型。

C)检测miR396e基因突变类型，在T0代筛选到在miR396e成熟区一系列的突变类型，并经过4-5代的不断扩繁，不断增加突变类型群体。

D)以miR396e作为检测探针，用Northern blot杂交检测mir396e/f突变体中成熟体miR396e的积累水平。

5、实验结果

检测到针对miR396e的多种突变类型，观察分析发现，mir396e突变体表型表现在可以影响水稻粒型(粒长，粒宽和/或粒重)。但不是所有突变体都表现粒型的差异。分析发现，在突变类型是插入，缺失小片段时，转基因株系没有观察到明显的籽粒大小改变的表型。但在大片段缺失突变体中，缺失位置包含miR396e的成熟区位点的突变中，粒型改变明显(图1)。

进一步分析，mir396e突变体植株相比野生型植株，种子粒长增加4.77％，粒宽增加5.58％(图2)。

6、实验结论

miR396e沉默表达，可以改变水稻种子粒型，具体的可以增加其粒长、粒宽和/或粒厚，通过粒型的改变，最终提高水稻的产量。

实施例2在低氮条件下，miR396ef双突变体可以提高水稻的产量

采用实验例1中所述方法获得miR396ef、mir396abcef等不同类型突变体。

(1)在无氮条件下，miR396ef突变体生长态势的影响

对在不同氮素条件下生长的突变体和野生型幼苗进行观察，发现在全素(氮含量0.034g/L)培养条件下，mir396突变体与野生型几乎没有任何差异；但在无氮素(氮含量0g/L)的培养基中，三个mir396e/f突变体生长势明显强于野生型(图3)。本实验结果初步表明，miR396e/f可以参与响应外界的缺氮营养胁迫过程，并且对水稻的生长势有着重要的影响。

(1)在低氮条件下，miR396ef对粒型的影响

大田环境下，低氮条件下(未施用氮肥)，miR396ef成熟区不同突变类型可以增加水稻的粒长8.46％、粒宽7.95％、粒厚8.16％和千粒重26.51％(图4，a－c)。mir396abcef突变体粒型与mir396ef突变体粒型一致，无明显统计学差异。

对野生型和突变型种子进行切片观察，发现粒型的改变主要表现在种子颖壳细胞数目的增多和体积的增大。(图5，a-b)

(2)在低氮条件下，miR396ef突变可以增加水稻的穗粒数

大田条件下，低氮条件下(未施用氮肥)，与野生型相比，mir396ef穗长(20.55±1.83cm VS 17.93±1.64cm)，主枝多(8.8±1.34VS7.33±1.56)。较长的穗长和更多的穗分枝通常与更多的谷粒相关，mir396ef突变体穗粒数高于野生型(77.82±8.89VS 72.35±10.96)。(图6，a-c)

(3)在低氮条件下，miR396ef突变可以增加水稻的产量

我们的大田产量试验表明，正常栽培条件下施用270kg ha-1氮肥的田块(2m×2m)，mir396ef突变体谷物产量相对野生型增加了约4％。

在低氮条件下(未施用氮肥)，mir396ef突变体水稻的谷物产量较野生型显著增加约15％。(图7，a-b)

综上，mir396ef双突变在低氮条件下，相比正常栽培条件下，对水稻粒型、穗粒数、株高等表型的影响更加显著，通过对表型的影响，最后可提高水稻的产量。

实施例3在低氮条件下miR396ef突变体可以提高水稻的生物量

(1)miR396ef突变可以增加水稻叶长

在大田条件下，灌浆中期，每个单株选取主效的三个分蘖，共选取20个单株；将以上选取的每个单株的三个分蘖，在旗叶叶鞘处剪断叶鞘；用刻度尺测量叶片顶端到叶鞘的距离。与野生型旗叶相比，mir396ef双突变旗叶长32.8％(图8)。

(2)miR396ef突变可以增加水稻株高

在大田条件下，灌浆后期，共选取20个单株；用刻度尺测量每个单株由地表到穗的距离。结果显示，mir396ef突变株(74.13±3.54cm)高于野生型(69.33±3.20cm)，但分蘖数与野生型相似。(图9)

(3)miR396ef突变可以增加水稻的地上部生物量积累

在大田条件下，水稻成熟后，选取20个单株；将以上单株由地平面剪断；将剪断的地上部所有植株组织放入60℃烘箱，烘烤两周；称量统计每个单株的干物质重量。与野生植物相比，在低氮栽培条件下，mir396ef突变株每株植物地上干生物量增加了25％(图10)。检测分析发现旗叶单位叶面积的光合速率与野生型相比无显著差异。因此，突变体株高增加；旗叶叶面积增大，总的光合速率增加，可以积累跟多的光合产物；氮素吸收和利用速率增加，这些因素都成为mir396ef突变植株干物质量增加的有利因素。

实施例4mir396ef通过miR396-GRF4/6/8-GIF1/2/3途径调控子粒和穗型发育

水稻中的12个GRF转录因子基因都携带着miR396靶位点。我们发现，与野生型相比，mir396ef突变植物中只有OsGRF4、OsGRF6和OsGRF8上调。RLM-race(5’RNA连接酶介导的cDNA末端的快速扩增)分析表明，miR396在体内可以在miR396配对区的特定位置直接切割OsGRF4和OsGRF6的mRNA。

为了研究mir396介导的OsGRF4、OsGRF6和OsGRF8调控种子和穗的发育，我们构建了OsGRF4、OsGRF6和OsGRF8(分别命名为np:rGRF4、np:rGRF6和np:rGRF8)的mir396靶向抗性基因序列(图11a)，并在它们的本身启动子的调控下转入水稻。我们发现：(1)np:rGRF4、np:rGRF6和np:rGRF8的籽粒比野生型植物大，np:rGRF4的粒型增长最大，np:rGRF6的粒型增长最小(图11b)。(2)np:rGRF6和np:rGRF8的穗长均有所增加(图11c)，np:rGRF4的穗长和分枝数与野生型相似。这些结果表明，mir396ef分子通过调控其靶基因OsGRF4、OsGRF6和OsGRF8来调控种子和穗的发育。

GRF已被证明与转录辅助活化因子GIFs相互作用。为了发现与GRF4和GRF6相互作用的GIF，我们进行了酵母双杂交筛选。发现OsGIF1、OsGIF2和OsGIF3与OsGRF4相互作用，OsGIF3也与OsGRF6相互作用(图11d)。用CRISPR/Cas9技术产生了GIF1突变体，并观察了预期的短叶表型。与野生型相比，gif1突变体也表现出较小的植株和败育种子表型(图11e)。这些结果表明，水稻株型和粒型的发育受miR396EF-GRF4/6/8-GIF1/2/3模块的调控。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> P2019-0896

<130> 一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 184

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gcgggcaugc uuuccacagg cuuucuugaa cugugaacuc gugggggugu augugcucau 60

guugggauug uggucggugg ccuccaauuc ucugaaaaga aagcugaauu gucgagcucc 120

ccguucuguc uuuggucguc ucuaccuguu gaugguucaa gaaagcccau ggaaaccaug 180

ccgc 184

<210> 2

<211> 176

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gccaugcucu ccacaggcuu ucuugaacug ugaacucgug ugugcaugcu ccucauauau 60

uguucuagau cccaugcaug augcauaucg aucgaucuga ucugaauuag gucaucgaug 120

cgcaucugga uccccaucuu guugauaguu caagaaaguc cuuggaaaac auggug 176

<210> 3

<211> 422

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Pro Pro Cys Leu Arg Arg Trp Pro Thr Thr Ala Arg Pro Arg Gln

1 5 10 15

Pro Arg Pro Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ala Ala Pro Pro Arg Ser Pro

20 25 30

Arg Lys Gln Arg Glu Pro Ala Ala Thr Thr His Phe Leu Gly Ser Ser

35 40 45

Gly Ala Cys Asp Asn Thr Val Arg Arg Cys Val Trp Val Gly Gly Cys

50 55 60

Arg Gly Gly Gly Gly Val Ala Met Gly Glu Asp Ala Pro Met Thr Ala

65 70 75 80

Arg Trp Pro Pro Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Pro Phe Thr Ala Ala

85 90 95

Gln Tyr Glu Glu Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ile Tyr Lys Tyr Leu Val

100 105 110

Ala Gly Val Pro Val Pro Pro Asp Leu Val Leu Pro Ile Arg Arg Gly

115 120 125

Leu Asp Ser Leu Ala Ala Arg Phe Tyr Asn His Pro Ala Leu Gly Tyr

130 135 140

Gly Pro Tyr Phe Gly Lys Lys Leu Asp Pro Glu Pro Gly Arg Cys Arg

145 150 155 160

Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser Lys Glu Ala Ala Pro Asp

165 170 175

Ser Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Asn Arg Ser Arg

180 185 190

Lys Pro Val Glu Thr Gln Leu Val Ala Gln Ser Gln Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Val Val Gly Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ser

210 215 220

Ser Phe Gln Asn His Ser Leu Tyr Pro Ala Ile Ala Gly Ser Asn Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Arg Asn Met Pro Ser Ser Phe Gly Ser Ala Leu Gly

245 250 255

Ser Gln Leu His Met Asp Asn Ala Ala Pro Tyr Ala Ala Val Gly Gly

260 265 270

Gly Thr Gly Lys Asp Leu Arg Tyr Thr Ala Tyr Gly Thr Arg Ser Leu

275 280 285

Ala Asp Glu Gln Ser Gln Leu Ile Thr Glu Ala Ile Asn Thr Ser Ile

290 295 300

Glu Asn Pro Trp Arg Leu Leu Pro Ser Gln Asn Ser Pro Phe Pro Leu

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Ser Gln Leu Gly Ala Leu Ser Asp Leu Gly Gln Asn Thr

325 330 335

Pro Ser Ser Leu Ser Lys Val Gln Arg Gln Pro Leu Ser Phe Phe Gly

340 345 350

Asn Asp Tyr Ala Ala Val Asp Ser Val Lys Gln Glu Asn Gln Thr Leu

355 360 365

Arg Pro Phe Phe Asp Glu Trp Pro Lys Gly Arg Asp Ser Trp Ser Asp

370 375 380

Leu Ala Asp Glu Asn Ala Asn Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Gln Leu

385 390 395 400

Ser Ile Ser Ile Pro Met Ala Ser Ser Asp Phe Ser Ala Ala Ser Ser

405 410 415

Arg Ser Thr Asn Gly Asp

420

<210> 4

<211> 394

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

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Ser Ser Pro Ala Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Pro Phe Cys Arg Ser

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35 40 45

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65 70 75 80

Lys Tyr Leu Val Ala Gly Val Pro Val Pro Pro Asp Leu Val Leu Pro

85 90 95

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100 105 110

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Asn Arg Ser Arg Lys Pro Val Glu Thr Gln Leu Val Ala Gln Ser Gln

165 170 175

Pro Pro Ser Ser Val Val Gly Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala

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Ser Asn Gly Ser Ser Phe Gln Asn His Ser Leu Tyr Pro Ala Ile Ala

195 200 205

Gly Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly Arg Asn Met Pro Ser Ser Phe Gly

210 215 220

Ser Ala Leu Gly Ser Gln Leu His Met Asp Asn Ala Ala Pro Tyr Ala

225 230 235 240

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275 280 285

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Ser Phe Phe Gly Asn Asp Tyr Ala Ala Val Asp Ser Val Lys Gln Glu

325 330 335

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340 345 350

Ser Trp Ser Asp Leu Ala Asp Glu Asn Ala Asn Leu Ser Ser Phe Ser

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Gly Thr Gln Leu Ser Ile Ser Ile Pro Met Ala Ser Ser Asp Phe Ser

370 375 380

Ala Ala Ser Ser Arg Ser Thr Asn Gly Asp

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<211> 3825

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

aaagcaccat tactaaagac cgcggcgtgt gcttgcgttg cgagcgagcg agagcgagag 60

agagattgag agagagagag ggaagggatg gcgatgccgt atgcctccct gtctccggcg 120

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tggtggcgtc gcgatggggg aggacgcgcc gatgaccgcg aggtggccgc cggcggcggc 360

ggcgaggctg ccgccgttca ccgcggcgca gtacgaggag ctggagcagc aggcgctcat 420

atacaagtac ctggtggcag gcgtgcccgt cccgccggat ctcgtgctcc ccatccgccg 480

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tttcttgcct ctcctctacc atcgctgcat tgcttttgga tgcttgttta gtgtcggctt 600

ctttgtttat tccgatcagg cgtactttgc ttccatttgt taattggctc cgggtcattt 660

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tttggtaata aaaaggcttg tttttaaatc caaaactcgt gctcgcttca cgattagcgc 780

atcatttttt ttttttgggg gggggggggg ggaagtttgc ccatcattct gtctctgttt 840

gatctgatag aggacgtgca cacgctcttg tctgaaataa aatcttttgt ttatcagtat 900

gcccatggga taagccattt tctctgtgaa ccaacaccct ggcaaactgt ttttttgctc 960

gccatttttg agcgattgct aagaacagat aactatgccc tgcatatgga tcggatatgg 1020

acttctcaaa tattcaaatg ccattctatt aggaactcaa aatgcattac caacaaatgc 1080

attcttgtgt gtaacacggt tgctacgatg tgcctgtttt tgtacagttg gatatggtcc 1140

gtacttcggc aagaagctgg acccagagcc agggcggtgc cggcgtacgg acggcaagaa 1200

atggcggtgc tcgaaggagg ccgcgccgga ttccaagtac tgcgagcgcc acatgcaccg 1260

cggccgcaac cgttcaagaa agcctgtgga aacgcagctg gtcgcccagt cccaaccgcc 1320

ctcatctgtt gtcggttctg cggcggcgcc ccttgctgct gcctccaatg gcagcagctt 1380

ccaaaaccac tctctttacc ctgctattgc cggcagcaat ggcgggggcg gggggaggaa 1440

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ttatgcagct gttggtggtg gaacaggcaa agatctcagg tgattgttca tttctttttt 1560

tttaatcaaa cgccatattt acttgtttag cactgtcttg aatcatgata tgtatccttc 1620

cgttgtctaa aaaaaaggtg ccatgctcta actgattggt gtcaggtgga tgcagttatg 1680

aatctgtatt tttcattgtg atcggttaat aactgtgtcc catttgtttg cattggtggc 1740

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ggcccagtag tttgaaacat gtactgtcca taaagatgat actactacat atttgtgtct 2040

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tatttggccc ttgcaaaata ctgtctctga agatgtctca ccgatcacca ctatacctga 2220

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aatgttgatg attagatttt aacaatgcaa ctctttgatt tatcttccct acaaaaaaaa 2340

aggaactctt tgatttatct tcggtgaatc tcagtctgac cttagtacct agcctcatta 2400

tttacttcac caaatgtata actctacagt gcttgttcgt gttgatttgg tttagtttag 2460

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tatgttttct tatatgaatt catgacaaga atactaactt ttggaaaagg taattttatt 2700

ttttttgtat gataataatg ctttggattc tttctagttt atctgtcgga cttaggttaa 2760

ctacatttcc tccggtacat ggatttattt cattcttaca attgagccct tatgaatatt 2820

ttcttcctaa ttctgttcta aaaagttaga attgacatat tttcgatagg tacatgccta 2880

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actgcttatg gcacaagatc tttggcggat gagcagagtc aactcattac tgaagctatc 3000

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<210> 6

<211> 356

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

Met Leu Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Pro Gly Ile Gly Gly Tyr

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Gln Pro Gln Arg Gly Ala Ala Val Phe Thr Ala Ala Gln Trp Ala Glu

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Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ile Tyr Lys Tyr Leu Val Ala Gly Val Pro

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Val Pro Gly Asp Leu Leu Leu Pro Ile Arg Pro His Ser Ser Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Tyr Ser Phe Ala Asn Pro Ala Ala Ala Pro Phe Tyr His His

65 70 75 80

His His His Pro Ser Leu Ser Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Gly Lys Lys Leu

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Asp Pro Glu Pro Trp Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg

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Cys Ser Lys Glu Ala His Pro Asp Ser Lys Tyr Cys Glu Arg His Met

115 120 125

His Arg Gly Arg Asn Arg Ser Arg Lys Pro Val Glu Ser Lys Thr Ala

130 135 140

Ala Pro Ala Pro Gln Ser Gln Pro Gln Leu Ser Asn Val Thr Thr Ala

145 150 155 160

Thr His Asp Thr Asp Ala Pro Leu Pro Ser Leu Thr Val Gly Ala Lys

165 170 175

Thr His Gly Leu Ser Leu Gly Gly Ala Gly Ser Ser Gln Phe His Val

180 185 190

Asp Ala Pro Ser Tyr Gly Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Ala Lys Ala Asp

195 200 205

Val Gly Glu Leu Ser Phe Phe Ser Gly Ala Ser Gly Asn Thr Arg Gly

210 215 220

Phe Thr Ile Asp Ser Pro Thr Asp Ser Ser Trp His Ser Leu Pro Ser

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Ser Val Pro Pro Tyr Pro Met Ser Lys Pro Arg Asp Ser Gly Leu Leu

245 250 255

Pro Gly Ala Tyr Ser Tyr Ser His Leu Glu Pro Ser Gln Glu Leu Gly

260 265 270

Gln Val Thr Ile Ala Ser Leu Ser Gln Glu Gln Glu Arg Arg Ser Phe

275 280 285

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Met Leu Gly Asn Val Lys His Glu Asn Gln

290 295 300

Pro Leu Arg Pro Phe Phe Asp Glu Trp Pro Gly Arg Arg Asp Ser Trp

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Ser Glu Met Asp Glu Glu Arg Ser Asn Gln Thr Ser Phe Ser Thr Thr

325 330 335

Gln Leu Ser Ile Ser Ile Pro Met Pro Arg Cys Gly Ser Pro Ile Gly

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Pro Arg Leu Pro

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

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ccccctctcc tctccctctc acactcacac gctgcagcag cagcagcagc agcagctttc 60

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accccgcatt ttaccgctgc tagtgagttg gatcagtgat tgcgcctccc ctggttcttt 2940

gttcaattgt atcgtgctat gaactagtta agagaaccct actttttttt tctagtagaa 3000

gagacagaaa actcttatcc atcatcatgt tttaagattc cacgatgttt tgtacctgca 3060

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

Met Leu Ser Ser Cys Gly Gly His Gly His Gly Asn Pro Arg Ser Leu

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Gln Glu Glu His His Gly Arg Cys Gly Glu Gln Gln Gly Gly Gly Gly

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Gly Gly Gly Gln Glu Gln Glu Gln Asp Gly Phe Leu Val Arg Glu Ala

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Arg Ala Ser Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Phe Leu Gly Ser Thr

50 55 60

Ser Ser Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln Met Leu Ser Phe

65 70 75 80

Ser Ser Pro Asn Gly Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ser Ser Gly Gly Ser

85 90 95

Met Gln Gly Val Leu Ala Arg Val Arg Gly Pro Phe Thr Pro Thr Gln

100 105 110

Trp Met Glu Leu Glu His Gln Ala Leu Ile Tyr Lys His Ile Ala Ala

115 120 125

Asn Val Ser Val Pro Ser Ser Leu Leu Leu Pro Ile Arg Arg Ser Leu

130 135 140

His Pro Trp Gly Trp Gly Ser Phe Pro Pro Gly Cys Ala Asp Val Glu

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Pro Arg Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser Arg

165 170 175

Asp Ala Val Gly Asp Gln Lys Tyr Cys Glu Arg His Ile Asn Arg Gly

180 185 190

Arg His Arg Ser Arg Lys His Val Glu Gly Arg Lys Ala Thr Leu Thr

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Ile Ala Glu Pro Ser Thr Val Ile Ala Ala Gly Val Ser Ser Arg Gly

210 215 220

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Ser Asp Pro Phe Ser Arg Gln Ser Asn Arg Lys Phe Leu Glu Lys Gln

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Asn Val Val Asp Gln Leu Ser Pro Met Asp Ser Phe Asp Phe Ser Ser

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Thr Gln Ser Ser Pro Asn Tyr Asp Asn Val Ala Leu Ser Pro Leu Lys

275 280 285

Leu His His Asp His Asp Glu Ser Tyr Ile Gly His Gly Ala Gly Ser

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Ser Ser Glu Lys Gly Ser Met Met Tyr Glu Ser Arg Leu Thr Val Ser

305 310 315 320

Lys Glu Thr Leu Asp Asp Gly Pro Leu Gly Glu Val Phe Lys Arg Lys

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Asn Cys Gln Ser Ala Ser Thr Glu Ile Leu Thr Glu Lys Trp Thr Glu

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Asn Pro Asn Leu His Cys Pro Ser Gly Ile Leu Gln Met Ala Thr Lys

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Phe Asn Ser Ile Ser Ser Gly Asn Thr Val Asn Ser Gly Gly Thr Ala

370 375 380

Val Glu Asn Leu Ile Thr Asp Asn Gly Tyr Leu Thr Ala Arg Met Met

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Asn Pro His Ile Val Pro Thr Leu Leu

405

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

gttggctagt ccaggactag agggtgcagt gcattcaatt gcttgcttcc tcttcctccc 60

ctcctccttc cccaaagcag caaggccagc ctgtgtttcc caaacaccca cagccatcac 120

ctcctcttct tcctctctgc agtaggggtg ctaggctagg gtagctagct agctaccatc 180

atcatgagct caatgccaca agaagccatt gctccccatc cttcctaacc ttcctgctgg 240

ttttgcaaac atcccacaca cacacaaagc agtgacagtg agtgccaatg ctgagctctt 300

gtggtggcca tggccatgga aatccaagaa gcttgcaaga agaacaccat ggcagatgtg 360

gtgagcagca aggtggagga ggaggaggag ggcaagagca agagcaagat gggttcttgg 420

tgagagaggc aagggcatcc ccaccatctc catcttcttc atcatttctt ggatccacaa 480

gctcttcttg ttctggagga ggaggaggag ggcagatgtt gagcttctcc tcccccaatg 540

gaacagcagg tgagatgaac tgatgatgct gatgctgcag tgcaaagaac cagggaaaaa 600

aagatttatt tgcttttttt tttagtcttc tctggtgaat gtactgttgc atccgtggtg 660

tgtgtgtgtc tgtggggttt gatcgatccc cagctggtga ttgtttttgc ccatcatggt 720

ctgagagtct ctcatggcat catcctgcaa aagcccctgc ctttggggtc ttgtcaatag 780

caaaaggagg gctcttctct tgttattccc ctccacacac actcttttgc ttttcttgca 840

acccacctcc acctcaagga tgtgtcttgt ccccaaagat gtgagctttt tcttccccct 900

tcatcccaag aaaaaataaa gctaaagaag gcagcagcag cagcaagcac cgacttgtgt 960

tgtgctgctg tttccttaaa atcttgcatg tgttggaacc aggaaaccat acaccacatg 1020

ctcatgggca tctttggcat caggcctatt tgctcttctt ggctttagta gtgagtactt 1080

catcatttgt gctcatcagt tttgcttgtg ttgtgatgaa gggttgggct tgagctcagg 1140

aggaagcatg cagggggtct tggcaagggt cagggggccg ttcaccccaa cacagtggat 1200

ggagctggag caccaggcac tgatctacaa gcacattgct gcaaatgttt ctgtcccttc 1260

cagcttgctc ctccccatca ggagaagcct ccatccatgg ggtactacct tttttattca 1320

gctcatgtga ttgttattct gttctgcgtc atatcccctt tctgttgtaa atagctcaag 1380

ataggaataa aggaataagt acttagaaaa tatgaaagaa gaaaatgcag gtcatatggt 1440

tgcagttgcc tgttagtttc agatgtataa aggtgtccca gattggggtt ctgttgtgtt 1500

gaggttggta gttatatctt gttgtctttc ttgggacagg atggctttgt gattaattag 1560

tttgtaaagg cagtaatcga agtccctttc tggtactaaa agcagtattg gctgcaaatc 1620

taggcattat aatgatttga agattgcatt gatactagaa atgtactgct tttggatgtt 1680

tgcatgatgc tcatgtgcta atatttccag ttaccaatgt ggtgcttctt gagtttagat 1740

ataaaactct tctcttacat tgggattctg attttttttt agttgtgcct ctagtctttt 1800

ccacaacaag atctccaaat gtagtcataa agtgttctga ttccctttaa ctggcgtcat 1860

gtttggtatg tacaaactaa gttcttatgc agacctggga ggaatgttgc tgaaatagtg 1920

caagaatata tcgttttgag gtggtttata tatttctgac atgaaatggg cattctattt 1980

tgcaccagga tggggatcat tccctcctgg ctgtgctgat gtagaaccca gaagatgccg 2040

ccgcacagac ggcaagaagt ggcggtgctc cagagatgct gttggggatc agaagtattg 2100

tgagcgacac ataaaccgtg gtcgccatcg ttcaagaaag catgtggaag gccgaaaggc 2160

gacactcacc attgcagaac catccacggt tattgctgct ggtgtatcat ctcgcggcca 2220

cactgtggct cggcagaagc aggtgaaagg ctcagctgct actgtctctg atcctttctc 2280

gagacaatcc aacaggtgaa gttgcctgat cctacatgaa tatgcatttt gtgcttcttg 2340

catgatgtgt ggacactgtg aggtggtctt tgtcaaaata aatgacatct gttgccgata 2400

cagtaattta gtccagcatg tggtaatgga ggtgccaaat cctaacaacc tataagtaat 2460

ttatgtatgt atcaggattc taggcagcat aataaaacat ctaacaaata gatattgtac 2520

agaaaagtta agatgaattt gaccaagcta gtgatatcaa tatacagtag gaaagtcctc 2580

acacaattat ttagtttgat tatactccag tttctgtgat tgcattagtc attcatttaa 2640

ttatgagtta atgtccctac aatgaactcc attttttctg ctctctctct ctctctcctt 2700

tgtaatgaag gaaattcatt tcttctttaa cctgctgcaa ttaacagaag gaaaatttgc 2760

acattgttat ctgaactaaa gatctgactc tactttgcag gaaatttctg gagaaacaga 2820

acgttgtcga ccaattgtct cccatggatt catttgattt ctcatccaca caatcttctc 2880

caaactatga caatgtagca ttgtcaccac tgaagttgca ccatgatcat gatgaatctt 2940

acatcgggca tggagcaggc agttcatcag aaaaaggcag tatgatgtac gaaagtcggt 3000

taacagtctc taaggaaaca cttgatgatg gacctttagg tgaagttttc aaaagaaaga 3060

attgccaatc agcttctaca gaaatcttaa ctgaaaaatg gactgagaac cccaacttac 3120

attgcccatc tggaatccta caaatggcta ctaagttcaa ttcaatttcc agcggcaaca 3180

cagtaaatag tggtggcacc gcagtggaga atcttatcac tgataatgga tatcttactg 3240

caagaatgat gaatcctcat attgtcccaa cacttctcta aggctgtgtt tgaaagttca 3300

tgttggattc gcaaatgatt gaaagtacgt ttatggatgg ttctataagt tcctgttgtt 3360

tccttcgtta tgtgttcttg tgttcctcac ctttttatct tttggttgag gttggtatgt 3420

tgtaattttc tcctgtgcta ccttgtaata tgctgaagtt aaatgctctt ctaaaaattt 3480

ctgttgcaat ccaagattca ggatttatgt gtccaattct gaattttaat gaatcatgcc 3540

ccttaaatgt aaagggaatt gtatatttca ttaatttgac aaaaacgttg ccttctgctc 3600

c 3601

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gcucauguug ggauuguggu 20

Claims (10)

1.一种核酸构建物或其编码基因的突变体的用途，其特征在于，用于低氮条件下调控植物农艺性状或制备用于低氮条件下调控植物农艺性状的组合物或制剂，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：

(a)产量和/或生物量；

(b)穗型和/或粒型发育；

(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)粒长；

(e)粒宽；

(f)穗长；

(g)千粒重；

(h)叶长；

(i)叶宽；

(j)有效分蘖数；

(k)果荚数；

其中，所述核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-X2-X3 (I)

式中，X1选自SEQ ID NO.:1的1-12位或SEQ ID NO.:2的1-9位；

X2选自miR396的成熟序列/保守序列；

X3选自SEQ ID NO.:1的44-184位或SEQ ID NO.:2的41-176位；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调控植物的农艺性状包括：

(a)提高产量和/或生物量；和/或

(b)促进穗型和/或粒型发育；和/或

(c)增加果实和/或种子的大小、重量和/或数量；和/或

(d)增加粒长；和/或

(e)增加粒宽；和/或

(f)增加穗长；和/或

(g)增加千粒重；和/或

(h)增加叶长。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR396的成熟序列/保守序列包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g、和/或miR396h的成熟序列/保守序列。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述低氮条件指所述培养基或大田生长条件的氮含量N_L与全素培养基或大田生长条件下中氮含量N0之比(N_L/N0)为0-1，较佳地，0.01-0.9，较佳地0.1-0.9，较佳地0.3-0.8，更佳地0.5-0.8，更佳地0.6-0.8。

5.一种GRF基因或其编码蛋白促进剂的用途，其特征在于，用于低氮条件下调控植物农艺性状或制备用于低氮条件下调控植物农艺性状的组合物或制剂，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：

(a)产量和/或生物量；

(b)穗型和/或粒型发育；

(c)果实和/或种子的大小、重量和/或数量；

(d)粒长；

(e)粒宽；

(f)穗长；

(g)千粒重；

(h)叶长；

(i)叶宽；

(j)有效分蘖数；

(k)果荚数。

6.一种改良植物农艺性状的方法，其特征在于，包括：

在低氮条件下，降低植物中miR396的表达或活性或提高植物中GRF基因或其编码蛋白的表达或活性。

7.一种在低氮条件下改良植物农艺性状的组合物，其特征在于，包括：

(i)miR396抑制剂、和/或GRF基因或其编码蛋白的促进剂；和

(ii)农学上可接受的载体。

8.一种权利要求7所述的组合物的用途，其特征在于，用于低氮条件下改良植物的农艺性状。

9.一种制备经基因编辑的植物组织或植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

在低氮条件下，降低植物组织或植物细胞中的miR396的表达或活性、和/或提高植物组织或植物细胞中GRF基因或其编码蛋白的表达或活性，从而获得经基因编辑的植物组织或植物细胞。

10.一种制备经基因编辑的植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求9所述的方法制备的经基因编辑的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得经基因编辑的植物。

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