CN108660245B - miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用 - Google Patents

miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108660245B
CN108660245B CN201810488927.2A CN201810488927A CN108660245B CN 108660245 B CN108660245 B CN 108660245B CN 201810488927 A CN201810488927 A CN 201810488927A CN 108660245 B CN108660245 B CN 108660245B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
mir396f
mir396e
type
encoding gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810488927.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108660245A (zh
Inventor
苗春波
柳参奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang A&F University ZAFU
Original Assignee
Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang A&F University ZAFU filed Critical Zhejiang A&F University ZAFU
Priority to CN201810488927.2A priority Critical patent/CN108660245B/zh
Publication of CN108660245A publication Critical patent/CN108660245A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108660245B publication Critical patent/CN108660245B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用。本发明首次发现和公开了miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的作用。本发明还对miR396e和miR396f调控水稻株型的机理进行了探究，发现mir396ef双突变体通过GA通路促进叶片和叶鞘的伸长；而GA通路的激活则通过增加MVA的含量来实现。

Description

miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
技术领域
本发明涉及水稻基因工程技术领域，尤其涉及miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制。miRNA在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。
miR396(microRNA396)是植物体内的一类保守miRNA，它通过其靶基因GRFs(Growth regulating factors)参与细胞增殖和分化的协调，在植物生长发育过程中发挥着重要的调节作用。GRFs是植物特有的一类转录因子，参与众多的细胞分裂和器官发育过程。在拟南芥、水稻和番茄中，过表达miR396导致严重矮小的植株形态。
近年的研究显示miR396调控花和果实的大小，从而使miR396显示出巨大的应用价值。在番茄中采用STTM(short tandem target mimic)技术干扰miR396的表达，可以显著增大花器官和果实。籽粒大小和穗型是影响稻谷产量的关键因素。miR396/GRF遗传模块调控水稻的籽粒大小和每穗粒数。水稻种子粒型控制QTL(quantitative trait locus)基因GS2/GL2编码GRF4，GS2/GL2序列上的一个稀有变异(TC→AA)破坏了miR396在GRF4 mRNA上的结合位点，致使GRF4表达量增加；GRF4表达的增加促进油菜素内酯(brassinosteroid，BR)响应基因的表达从而使籽粒变大。miR396还通过GRF6调控水稻穗型。过表达miR396b导致植株形体矮小、稻穗缩短、穗二次分枝缺失以及颖花数目严重减少；过表达miR396类似物(MIM396)或GRF6增加稻穗二次枝梗和颖花数目，从而增加每穗粒数，提高产量。miR396/GRF遗传模块同时负调控穗型和粒型，因此通过控制miR396/GRF遗传模块的表达可能同时增加千粒重和每穗粒数，打破产量三要素(分蘖数、每穗粒数和千粒重)之间的矛盾关系。
此外，申请公布号为CN103387981A、CN103387984A和CN103387983A的发明专利申请依次公开了microRNA396d或其编码基因在调控水稻开颖、株高以及叶夹角中的应用，指出microRNA396d的超表达株系与未转入该基因的水稻相比表现出明显的开颖变大、降低株高和叶夹角变大的表型。
水稻株型也是水稻产量的关键因素。在过去的30年间，研究者已从分子遗传学的角度对株型进行了大量的研究，鉴定出了几个调控株型并被应用于生产的基因，如sd1、IPA1、DEP1和osdrawf4等。其中sd1又被称为绿色革命基因，它通过适当降低株高，提高了水稻的收获指数和抗倒伏性，从而大幅度提高了水稻产量。IPA1又被称为理想株型基因，它可以通过降低水稻分蘖数、增大穗型、增加千粒重而提高产量。DEP1被称为直立穗基因，它能使稻穗变密、枝梗数增加、每穗籽粒数增多，从而实现增产。osdrawf4减小叶夹角，有利于密植，从而促进产量的提高。之前的株型研究主要集中在株高、分蘖数、穗型和叶夹角。叶片和叶鞘的长度也是株型形成的重要因素，但对其研究较少，还未见从分子遗传学角度对其进行研究的报道。
发明内容
本发明提供了miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重的新用途。
具体内容如下：
本发明提供了miR396e和miR396f在调控水稻株型中的应用，所述miR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述miR396f的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
其中，miR396e是指microRNA396e；miR396f是指microRNA396f。SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为miRNA396e的成熟序列，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为miRNA396e的前体序列；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为miR396f的成熟序列，SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为miR396f前体序列。
本发明提供了miR396e和miR396f的编码基因在调控水稻株型中的应用，所述miR396e的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miR396f的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述调控水稻株型的模式为MIR396e和MIR396f突变后增加叶片和叶鞘的长度，缩短最上部三个茎节的长度。尤其是缩短穗茎节的长度。
经实验发现，将miR396e编码基因和miR396f编码基因突变后获得的mir396ef双突变体在幼苗期时，与野生型植株幼苗相比，具有更大的鲜重，更长的叶片、叶鞘和苗长；在抽穗期时，与野生型植株相比，所有的叶片、叶鞘和稻穗的长度也明显增加。
本发明还提供了miR396e和miR396f在调控水稻穗型和粒重中的应用，所述miR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述miR396f的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了miR396e编码基因和miR396f编码基因在调控水稻穗型和粒重中的应用，所述miR396e的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miR396f的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述调控水稻穗型为负调控水稻的主穗一次分枝数和穗长。
进一步地，所述调控水稻粒重为负调控水稻种子的粒长、粒宽和厚度以及千粒重。
经实验发现，将miR396e编码基因和miR396f编码基因突变后获得的mir396ef双突变体种子粒型增大，粒长、粒宽和粒厚均比野生型植株的种子大；并且mir396ef双突变体主穗的一次分枝也比野生型植株的更多。
此外，为进一步研究miR396e和miR396f调控水稻株型和粒重的机理；本发明观测了mir396ef双突变体和野生型植株的颖壳细胞、叶细胞、穗茎节细胞，结果表明：与野生型植株相比，mir396ef双突变体具有更大的种子颖壳细胞，更长的叶片和叶鞘细胞，但穗茎节细胞的伸长却受到抑制。
本发明检测了mir396ef双突变体幼苗中GA和MVA的含量以及GA受体基因、GA失活基因、GA合成的关键基因的表达量，结果表明：mir396ef双突变体通过GA通路促进叶片和叶鞘的伸长；而GA通路的激活是通过增加MVA的含量来实现的。
CRISPR/Cas9技术是近几年兴起的一种基因编辑技术。2013年首次发表以后，该技术迅速被广泛应用于动植物的基因编辑。在该技术体系中，Cas9核酸酶在短的sgRNA(single guide RNA)引导下，去切割与sgRNA识别区互补的DNA序列；在一个细胞中表达多个sgRNA可同时对多个基因进行编辑。
本发明还提供了一种调控水稻株型、穗型和粒重的方法，包括：
(1)构建至少同时靶向miR396e编码基因和miR396f编码基因的CRISPR/Cas9载体；
(2)采用CRISPR/Cas9技术将水稻基因组中miR396e编码基因和miR396f编码基因进行定点突变，获得miR396e编码基因和miR396f编码基因均沉默的水稻突变体植株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次发现和公开了miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的作用。
(2)本发明还对miR396e和miR396f调控水稻株型的机理进行了探究，发现mir396ef双突变体通过GA通路促进叶片和叶鞘的伸长；而GA通路的激活则通过增加MVA的含量来实现。
附图说明
图1为实施例1中MIR396基因的编辑情况；
其中，A为MIR396d、MIR396g和MIR396h的寄生结构图，箭头表示基因的方向；黑色实心框表示编码区，灰色实心框表示UTR区；B为MIR396多基因编辑策略；C为MIR396基因编辑的靶位点选择，下划线表示Cas9的靶位点，框内字体部分对应于成熟miR396序列。
图2为在水稻mir396突变体幼苗期的表型观察与分析结果；
其中，A为幼苗期，野生型(XS134)与移码突变的mir396h/grf1和非移码突变的mir396h/grf1的表型对比，标尺，10cm；B为成熟期，野生型(XS134)与mir396h/grf1移码突变体的表型对比，标尺，10cm；C为幼苗期，野生型与mir396ef的表型对比；D为幼苗期，野生型与mir396ef的苗长；E为幼苗期，野生型与mir396ef的鲜重；F为幼苗期，野生型与mir396ef第三叶的叶鞘长度；G为幼苗期，野生型与mir396ef第三叶的叶片长度；H为幼苗期，野生型、mir396ef、mir396abef和mir396acef的表型对比，标尺为10cm。***表示与野生型对比的P值小于0.001。
图3为突变体mir396ef和野生型XS134的叶片、叶鞘、茎节和穗长度的检测结果；
其中，A为野生型、mir396ef、mir396aef、mir396abef的株型对比结果；B为野生型和mir396ef主分蘖对比；C为野生型和mir396ef主分蘖节间长度对比；D为野生型和mir396ef旗叶鞘和叶片对比；E为成熟期，野生型和mir396ef各叶片长度；F为成熟期，野生型和mir396ef各叶鞘长度；G为野生型和mir396ef各节间和穗的长度；H为野生型和mir396ef主分蘖穗茎到旗叶枕的距离；I为野生型和mir396ef旗叶宽。标尺为10cm；***，与野生型对比的P值小于0.001；**，与野生型对比的P值小于0.01。
图4为突变体mir396ef和野生型XS134的种子粒型和穗型的检测结果；
其中，A为野生型和mir396ef的种子对比，标尺为2cm；B为野生型和mir396ef种子粒长；C为野生型和mir396ef的种子粒宽；D为野生型和mir396ef的种子粒厚；E为野生型、mir396ab、mir396c、mir396ef、mir396abef和mir396acef种子的千粒重；F为野生型和mir396ef的主穗对比,标尺为10cm；G为野生型和mir396ef主穗一次分枝数数；H为野生型和mir396ef主穗二次分枝数；I为野生型和mir396ef主穗小花数；J为野生型和mir396ef单株分蘖数；H为野生型和mir396ef单株产量对比(2017年海南测试)。***，与野生型对比差异的P值小于0.001；*，与野生型对比差异的P值小于0.05。
图5为突变体mir396ef和野生型XS134的颖壳细胞、叶细胞和穗茎节细胞的检测结果；
其中，A为旗叶片上表皮细胞，标尺为20μm；B为旗叶片上表皮细胞长度；C为旗叶片上表皮细胞宽度；D为旗叶鞘外表皮细胞长度；E为旗叶鞘外表皮细胞宽度；F为旗叶鞘外表皮细胞，标尺为20μm；G为旗叶片维管束处的纵切，标尺为50μm；H为旗叶片维管束细胞的长度；I为旗叶细胞的横切面细胞对比，标尺为100μm；J为穗茎节纵切面细胞对比，标尺为100μm；K为穗茎节细胞长度；L为野生型和mir396ef的颖壳对比，断续线表示图5M的横切位置，标尺为0.5cm；M为野生型和mir396ef的颖壳横切面的细胞对比，标尺为100μm；N为颖壳表皮细胞的电子扫描显微镜观测照片，标尺为100μm；O为颖壳外表皮细胞长度；P为颖壳外表皮细胞宽度。***，与野生型对比的P值小于0.001。
图6为mir396ef促进幼苗生长和叶伸长的机理研究结果；
其中，A为GA相关基因在野生型和mir396ef(两个独立的株系)幼苗间的相对表达量；B为不同GA在野生型和mir396ef幼苗中的含量水平,#表示未检测到；C为在野生型和mir396ef幼苗间含量差异最大的20种代谢物质；FC为代谢物含量在mir396ef和野生型间的比值，即mir396ef/XS134；D为TPS基因在野生型和mir396ef间的相对表达量；E为ABA和CKs在野生型和mir396ef中的含量水平。20天幼苗的地上部分被用来进行该部分实验。
图7为野生型和mir396ef穗茎节中SD37的相对表达量和GA含量；
其中，A为SD37在野生型和mir396ef穗茎节间的相对表达量；B为穗茎节中的GA含量；#表示未检测到。
图8为mir396ef影响株型的机理模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。下文所述的幼苗是指水稻秧苗。小写字母和数字的组合(如mir396ef)表示的是编码基因经CRISPR/Cas9编辑后获得的突变株，例如：mir396ef是指经特异性靶向MIR396e和MIR396f基因的CRISPR/Cas9载体编辑后获得的mir396ef突变株；大、小写字母和数字组合(如MIR396e)表示的是miR396e的编码基因。下列实施例中XS134是指野生型，mir396h/grf1是指MIR396h基因发生突变的突变体(MIR396h基因位于GRF1基因的外显子上，所以突变会同时引起MIR396h和GRF1的突变，因此mir396h突变体被记为mir396h/grf1)。
实施例1水稻MIR396基因家族的系统突变
在水稻基因组中有8个miR396的表达基因(表达基因序列见miRBase数据库，http://www.mirbase.org/)。通过序列分析，发现这8个基因中，MIR396a、MIR396b、MIR396c、MIR396e和MIR396f位于基因间区域，而MIR396d、MIR396h和MIR396g寄生于其靶基因的编码区内(图1A)。
针对此种情况，我们构建了一个特异靶向MIR396a、MIR396b、MIR396c、MIR396e和MIR396f的多基因编辑CRISPR/Cas9载体(图1B；图1C显示了Cas9的靶位点)。在该载体中，Cas9由玉米Ubiquitin启动子介导表达；四个sgRNA分别由OsU3-1、OsU6-1、OsU3-2、OsU6-2启动子介导表达(启动子序列见序列SEQ ID NO.7到序列SEQ ID NO.10)，四个sgRNA表达盒在载体上串联排列(图1B)。为特异性地靶向水稻MIR396基因，我们合成了特异识别靶基因的引物，其包含20bp的目标识别序列和4-5bp的标签序列。引物退火后形成带黏性末端的双链DNA(20bp双链区)。该双链DNA与启动子及下游序列在T4连接酶作用下无缝连接，从而构建sgRNA表达盒。串联排列的sgRNA表达盒先被构建于PUC19中间载体，然后被亚克隆于带Cas9表达盒的PCAMBIA1300骨架。
另外，我们还构建了7个单sgRNA表达的载体，其中一个载体靶向MIR396e和MIR396f，其他6个载体靶向单基因(图1C显示了Cas9的靶位点)。
通过农杆菌介导的转化方法，我们将载体转化进了粳稻品种秀水134(XS134)。秀水134是中国东南地区大面积推广的优良粳稻品种。通过这些载体，共获得了199个突变株系，其中包含mir396a、mir396b、mir396c、mir396d、mir396g、mir396h、mir396ab、mir396ef、mir396aef、mir396abef、和mir396acef等突变体。mir396ab和mir396acef各有两个独立的株系，其他的突变体都含有至少5个株系，其中mir396ef有70个株系。
实施例2
1、mir396ef双突变株促进水稻幼苗生长
在连续三季的大田观测中，mir396a、mir396b、mir396ab、mir396c、mir396d和mir396g未呈现与野生型(XS134)明显差异的表型。mir396h/grf1的移码突变株系表现出矮小的生长表型，而非移码突变株系的表型与野生型(XS134)相似(图2A和2B)。
幼苗期，mir396ef表现出比野生型更壮的表型(图2C)，具有比野生型更大的鲜重，更长的叶片、叶鞘和苗长(图2D-2G)。幼苗期mir396abef和mir396acef的表型与mir396ef类似(图2H)。
2、mir396ef双突变株促进叶片、叶鞘、穗子的伸长，但抑制茎节的伸长
抽穗期后，mir396ef表现出一种奇特的株型，即群体水平上，突变体穗子比野生型明显低，但旗叶比野生型微高(图3A)。
为仔细鉴定mir396ef株型，我们测量了抽穗期后的叶片、叶鞘、茎节和穗子的长度。发现与野生型相比，mir396ef所有的叶片和叶鞘的长度明显增加(图3B、3D、3E和3F)，而叶宽无明显变化(图3I)。mir396ef稻穗的长度也明显增加，但上部的茎节特别是穗茎节的长度明显缩短(图3G)。叶鞘长度明显增加，但茎节的缩短导致严重的包穗现象，主分蘖稻穗大约有8厘米被叶鞘半包裹(图3D和3H)。mir396aef、mir396abef和mir396acef的株型与mir396ef相似(图3A)。
3、mir396ef双突变株增加稻谷千粒重，增大穗型
mir396ef的种子粒型增大，粒长、粒宽和粒厚均比野生型大(图4A–4D)。与野生型相比，mir396ef的千粒重增加约40％(图4E)。mir396ef的穗型增大(图4F)。细致的穗型分析显示，mir396ef主穗的一次分枝增多，但二次分枝和小花的数目与野生型一致(图4G–4I)。因此增大的穗型主要被mir396ef用于容纳更大的种子而非更多的种子。
mir396aef、mir396abef和mir396acef具有与mir396ef相近的千粒重(图4E)和穗型。实际上，在整个生育期，mir396aef、mir396abef和mir396acef与mir396ef在株型和种子粒型上无明显差异，这表型表明在MIR396基因中，MIR396e和MIR396f是调控生长发育的主要基因。
mir396ef与野生型的分蘖数无明显差异(图4J)。2017年在海南陵水的产量测试显示mir396ef能使单株产量提高14％–17％(图4K)。但杭州的产量测试未发现产量的提高。仔细观察发现稻穗下部被叶鞘包裹的部位结实率较低，种子灌浆较差，说明包穗严重影响了产量潜力的发挥。
实施例3mir396ef增大颖壳细胞，促进叶细胞伸长，但抑制穗茎节细胞伸长
为进一步鉴定叶片和叶鞘伸长的原因，我们还观察了抽穗期水稻叶片和叶鞘的表皮细胞。表皮细胞观测采用以下方法：将新鲜的叶片和叶鞘于开水中煮10分钟，然后于95％的酒精中煮60–90分钟，直至叶片和叶鞘完全褪色；然后置于96℃的85％乳酸中，浸泡8分钟；冷却后，用刀片将组织刮薄，然后可在光学显微镜下直接观察表皮细胞。
表皮细胞观测发现：mir396ef的旗叶片和旗叶鞘的表皮细胞增长，但细胞宽度没有变化(图5A–5F)。纵切显示mir396ef旗叶片的维管束细胞变长(图5G和5H)。mir396ef旗叶片横切面细胞大小与野生型类似(图5I)。
此外，mir396ef种子颖壳横切面的细胞比野生型大(图5L和5M)。扫描电子显微镜观测显示mir396ef颖壳表皮细胞的长度和宽度均比野生型增大(图5N–5P)。茎秆纵向切片显示，mir396ef穗茎节的细胞长度大约只有野生型的58％(图5J和5K)。
结果表明，mir396ef突变增大种子颖壳细胞，促进叶片和叶鞘细胞伸长，但抑制穗茎节细胞伸长。
实施例4 mir396ef通过赤霉素通路促进幼苗生长和叶的伸长
(1)为探索mir396ef促进幼苗生长和叶伸长的机理，我们对幼苗地上部分(由叶片和叶鞘组成)进行了转录组分析。
发现：在两个独立的mir396ef株系中，GA受体基因和GA失活基因的表达显著上升(ratio≥2or≤0.5)(图6A)，这些基因包含2个GA受体基因(GID1L2和GID1L3)和6个GA失活基因(GA 2-oxidases，包括GA2ox1、GA2ox3、GA2ox6、GA2ox7、GA2ox8和GA2ox9)。
随后，我们检测了幼苗地上部分的GA含量，发现在mir396ef中，生物活性GAs包括GA3、GA4和GA7的含量大大增加(GA3，0.2385ng/g VS 5.1792ng/g；GA4，0ng/g VS 4.3289ng/g；GA7，0.0935ng/g VS 4.4438ng/g)，活性GA前体GA24呈现更大程度的水平上升(0ng/g VS23.7807ng/g)(图6B)。促进细胞和器官伸长是GA最显著的作用之一，因此这些结果表明mir396ef通过GA通路促进叶片和叶鞘的伸长。
(2)为探索GA含量增加的原因，我们对GA合成的关键基因，包括GA20oxs、GA3oxs、CPS1、KS1、KAO和KO2，进行了表达分析。水稻中有4个GA20oxs(GA20ox1、GA20ox2、GA20ox3和GA20ox4)和2个GA3oxs(GA3ox1和GA3ox2)，这两类基因编码的酶催化GA合成的后期步骤。
表达分析结果显示：在mir396ef中，4个GA20oxs的表达未呈现明显的上调，甚至呈现整体的下调(图6A)；GA3ox1在幼苗中不表达，GA3ox2的表达在野生型和mir396ef间未有显著变化(图6A)。
催化GA合成早期步骤的酶由单基因编码，这些基因包括CPS1、KS1、KAO和KO2。表达分析结果显示，这四个基因的表达在野生型和mir396ef间的变化不明显(图6A)。因此GA合成类基因的表达变化不是GA水平上升的原因。
(3)为了探索mir396ef中GA水平上升的原因，我们进一步对幼苗的地上部分进行了代谢组分析。结果显示：在mir396ef中，GA合成前体甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)的水平增加了大约29000倍(log2FC＝14.83；FC，mir396ef/XS134)(图6C)。表明mir396ef通过增加MVA的含量激活GA通路。
在细胞中，MVA通过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway)转化为异戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲烯丙基焦磷酸
(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)。IPP和DMAPP是所有萜类物质(terpenoids)包含GA的合成前体。Terpene Synthase(TPS)家族基因负责多种萜类物质的合成。
与MVA含量的显著增加相对应，转录组分析显示19个TPS基因的表达显著上升(ratio≥2)，Real-time RT-PCR验证结果与其一致(图6D)。细胞分裂素(cytokinins，CKs)使用AMP和IPP作为合成前体。另外，脱落酸(abcisic acid，ABA)也可以使用萜类物质作为合成前体。激素含量测定显示ABA和三种CKs(N6-isopenUenyladenine，iP；Urans-zeaUin，UZ；dihydrozeaUin，DZ)的水平在mir396ef中仅有稍微的提高，而cis-zeaUin(cZ)的水平明显下降。以上结果说明：mir396ef双突变体通过GA通路促进叶片和叶鞘的伸长；而GA通路的激活是通过增加MVA的含量来实现的。
实施例5 mir396ef可能通过SD37影响茎秆伸长
为研究mir396ef影响茎秆伸长的机理，我们对穗茎节进行了激素含量测定、代谢组分析和转录组分析。
激素含量测定显示，活性GA前体GA20的水平有明显的上升(野生型中未检测到，突变体中含量为0.45ng/g)，而GA7、GA19和GA53的水平变化不大(图7B)。在野生型和mir396ef穗茎节中未检测到GA1、GA3、GA4、GA9、GA15和GA24(图7B)。代谢组分析在野生型和mir396ef间未检测到MVA水平的显著差异(log2FC＝0.297；FC，mir396ef/XS134)。转录组分析在野生型和mir396ef间检测到453个差异表达基因(differential expressed genes，DEGs)(ratio≥2or≤0.5)，其中包含许多脂类代谢、糖代谢和细胞壁合成类基因，这几类基因在mir396ef中表达下降。在表达下降的DEGs中，我们发现SD37的表达严重下降(图7A)。SD37参与细胞壁的合成，调控茎杆的伸长，sd37突变会导致茎秆变短。前人的转录组分析显示，sd37中许多脂类代谢、糖代谢和细胞壁合成类基因的表达下降。这些结果显示mir396ef可能通过下调SD37表达而非GA通路来影响茎秆伸长。
以上结果说明，mir396ef通过增加MVA的含量激活GA通路，进而促进生长和器官伸长；可能通过抑制SD37表达而非GA通路抑制茎秆伸长(图8)。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 1
uccacaggcu uucuugaacu g 21
<210> 2
<211> 184
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 2
gcgggcaugc uuuccacagg cuuucuugaa cugugaacuc gugggggugu augugcucau 60
guugggauug uggucggugg ccuccaauuc ucugaaaaga aagcugaauu gucgagcucc 120
ccguucuguc uuuggucguc ucuaccuguu gaugguucaa gaaagcccau ggaaaccaug 180
ccgc 184
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 3
ucuccacagg cuuucuugaa cu 22
<210> 4
<211> 176
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 4
gccaugcucu ccacaggcuu ucuugaacug ugaacucgug ugugcaugcu ccucauauau 60
uguucuagau cccaugcaug augcauaucg aucgaucuga ucugaauuag gucaucgaug 120
cgcaucugga uccccaucuu guugauaguu caagaaaguc cuuggaaaac auggug 176
<210> 5
<211> 184
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 5
gcgggcatgc tttccacagg ctttcttgaa ctgtgaactc gtgggggtgt atgtgctcat 60
gttgggattg tggtcggtgg cctccaattc tctgaaaaga aagctgaatt gtcgagctcc 120
ccgttctgtc tttggtcgtc tctacctgtt gatggttcaa gaaagcccat ggaaaccatg 180
ccgc 184
<210> 6
<211> 176
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 6
gccatgctct ccacaggctt tcttgaactg tgaactcgtg tgtgcatgct cctcatatat 60
tgttctagat cccatgcatg atgcatatcg atcgatctga tctgaattag gtcatcgatg 120
cgcatctgga tccccatctt gttgatagtt caagaaagtc cttggaaaac atggtg 176
<210> 7
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
aaggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta 60
tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca 120
ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga 180
aaccacgtga tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca 240
tgaagccttt caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa 300
caaagactag tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag 360
ttgtgcagat gatccgtggc 380
<210> 8
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tgccacggat catctgcaca actcttttaa accagctttg atctatgtgg atagccgagg 60
tggtactaat actagtcttt gttgtcgtcc aattgcgtaa tgggccggcc catactgcaa 120
tacatgtcct gaaaggcttc atggcccact acgaaatgct tttctcctac agtttatctt 180
actccacatc acgtggtttc caacgtaccc agtgttcccg gcttccagca tttgctggta 240
gcaccagtag aagacgcctg tcttgtgcta tggtccctga ctgcacatct gattcctcca 300
agatccatgc atgcctgata actttaagtt gcttcagaag aactttaagt gatctgttcg 360
tatgtttaaa gatccctt 378
<210> 10
<211> 437
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ttttttcctg tagttttccc acaaccattt tttaccatcc gaatgatagg ataggaaaaa 60
tatccaagtg aacagtattc ctataaaatt cccgtaaaaa gcctgcaatc cgaatgagcc 120
ctgaagtctg aactagccgg tcaactatac aggctatcga gatgccatac acgagacggt 180
agtaggaact aggaagacga tggttgattc gtcaggcgaa atcgtcgtcc tgcagtcgca 240
tctatgggcc tggacggaat aggggaaaaa attggccgga taggagggaa aggcccaggt 300
gcttacgtgc gaggtaggcc tgggctctca gcgcttcgat tcgttggcac cggggtagga 360
tgcaatagag agcaacgttt agtaccacct cgcttagcta aactggactg ccttatatgc 420
gcgggtgctg gcttggc 437

Claims (4)

1.靶向miR396e和miR396f的编码基因的载体在调控水稻株型中的应用，其特征在于，所述miR396e的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miR396f的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述调控水稻株型为miR396e编码基因和miR396f编码基因均沉默后增加叶片和叶鞘的长度，缩短最上部三个茎节的长度。
2.靶向miR396e编码基因和miR396f编码基因的载体在调控水稻穗型和粒重中的应用，其特征在于，所述miR396e的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miR396f的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述调控水稻穗型为miR396e编码基因和miR396f编码基因均沉默后增加水稻的主穗一次分枝数和穗长；
所述调控水稻粒重为miR396e编码基因和miR396f编码基因均沉默后增加水稻种子的粒长、粒宽和厚度以及千粒重。
3.一种调控水稻株型、穗型和粒重的方法，其特征在于，包括：
(1)构建至少同时靶向核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的miR396e编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的miR396f编码基因的CRISPR/Cas9载体；
(2)采用CRISPR/Cas9技术将水稻基因组中miR396e编码基因和miR396f编码基因进行定点突变，获得miR396e编码基因和miR396f编码基因均沉默的水稻突变体植株；
所述调控水稻株型为增加叶片和叶鞘的长度，缩短最上部三个茎节的长度；
所述调控水稻穗型为增加水稻的主穗一次分枝数和穗长；
所述调控水稻粒重为增加水稻种子的粒长、粒宽和厚度以及千粒重。
4.如权利要求3所述的调控水稻株型、穗型和粒重的方法，其特征在于，所述miR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述miR396f的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
CN201810488927.2A 2018-05-21 2018-05-21 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用 Active CN108660245B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810488927.2A CN108660245B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810488927.2A CN108660245B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108660245A CN108660245A (zh) 2018-10-16
CN108660245B true CN108660245B (zh) 2021-09-21

Family

ID=63777158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810488927.2A Active CN108660245B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108660245B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109721648B (zh) * 2019-03-11 2021-04-16 中国农业科学院作物科学研究所 一种水稻株型相关蛋白及其编码基因和应用
CN112251433A (zh) * 2019-07-05 2021-01-22 山东舜丰生物科技有限公司 一种miR396或其编码基因的突变体的应用
CN112251434A (zh) * 2019-07-05 2021-01-22 山东舜丰生物科技有限公司 一种miR396或其编码基因的突变体在调控植物农艺性状的应用
CN112322622B (zh) * 2020-11-17 2022-04-22 中国农业科学院植物保护研究所 lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243107A (zh) * 2012-02-10 2013-08-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制水稻穗大小基因、其突变体及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8946511B2 (en) * 2006-10-12 2015-02-03 Monsanto Technology Llc Plant microRNAs and methods of use thereof
US20080313773A1 (en) * 2007-05-14 2008-12-18 The Rockefeller University Production of artificial micrornas using synthetic microrna precursors
CN103387984B (zh) * 2012-05-08 2014-12-31 中国科学院植物研究所 microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用
CN103695430A (zh) * 2014-01-03 2014-04-02 江苏省农业科学院 应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用制作方法
CN106676106B (zh) * 2015-11-05 2019-12-10 中国科学院上海生命科学研究院 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243107A (zh) * 2012-02-10 2013-08-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制水稻穗大小基因、其突变体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108660245A (zh) 2018-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108660245B (zh) miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
CN109844107B (zh) 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
Boss et al. A grapevine TFL1 homologue can delay flowering and alter floral development when overexpressed in heterologous species
CN107287208A (zh) 花期调控基因和相关载体及其应用
JP5259717B2 (ja) トマトの収穫量を増加させるためのプロモーター配列および遺伝子構築物
CN111304216B (zh) 水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用
US11603537B2 (en) Method for improving rice yield by jointly knocking out ABA receptor PYL family genes and use thereof
EP3368677B1 (en) Inhibition of bolting and flowering of a beta vulgaris plant
CN109161551B (zh) 甘蓝BoMS1基因及其在创制不育材料中的应用
US9029635B2 (en) Method for increasing sucrose yield in agricultural production of sugar beet and sugar cane
WO2012039159A1 (ja) 塊茎生産能または匍匐枝形成能が野生株に比して向上している匍匐枝形成植物の作製方法、当該方法によって作製された匍匐枝形成植物
CN102337276B (zh) 水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因及其应用
CN107523584B (zh) 提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用
CN110724703A (zh) 一种短花柱番茄的创制方法
US20220162632A1 (en) Delayed harvest of short stature corn plants
CN112592391B (zh) 番茄雄性不育基因SlSAUR54及其应用
CN111893123B (zh) 水稻基因ljs3-1及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN115058399B (zh) mF3H突变体及其相关产品和用途
CN115710588B (zh) 超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用
US20220411809A1 (en) Gene mutations in tomato to yield compact and early yielding forms suitable for urban agriculture
KR20230086123A (ko) 작물의 초형을 조절하는 OsHDSTART1 유전자 및 이의 용도
CN115851777A (zh) 颖壳发育相关基因OsAPx5及其蛋白的应用
CN118256518A (zh) 一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3及其应用
CN118271411A (zh) 番茄RNA甲基化修饰识别蛋白SlECT2及其应用
JP2024078049A (ja) 自家和合性を有するアブラナ科植物の作出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant