CN103695430A - 应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用。本发明还保护序列1所示RNA在抑制生长调节因子基因表达中的应用；所述生长调节因子如序列表的序列2所示。有望通过应用水稻中的osa-miR396d基因获得抗病毒的植株，造福于农业生产。

Description

应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用制作方法

技术领域：

本发明涉及一种应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用。

背景技术：

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，水稻黑条矮缩病毒)，是水稻上一种危害严重的病毒病，隶属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)，主要由灰飞虱以持久性不经卵的方式传播。病毒粒体球状，主要由灰飞虱传播，田间症状前期主要表现为植矮缩，叶片浓绿，后期在叶片、叶鞘及茎杆上出现蜡滴状突起，而后形成黑条，对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。该病毒除侵染水稻外，还可侵染玉米(玉米粗缩病)、小麦(小麦绿矮)及多种禾本科杂草。上世纪60年代在江浙一带流行，90年代在我国多处玉米和水稻产区再度爆发流行，造成了严重损失，近年来更有日渐严重的趋势，2008年仅江苏省发病面积就达400万亩，致使当地的水稻生产损失严重。

在水稻黑条矮缩病毒侵染植株后，植物调控网络中许多基因或蛋白都会对产生应答，表达发生变化从而影响植物多种生理途径而影响到植株的生长。miRNA是一类长度约为20-24nt的内源单链非编码小分子RNA，在生物体中广泛存在(Voinnet O：Origin，biogenesis，and activity of plant microRNAs.Cell2009，136：669-687.)。近年来大量研究表明，miRNA参与调控植物生长发育以及应答生物和非生物胁迫等许多重要生物学过程(Baulcombe D.2004.RNAsilencing in plants.Nature431：356-63)。目前的植物应答水稻黑条矮缩病毒侵染的相关研究主要集中病毒的病原形态、寄主症状、传毒介体及传播特性等方面，还很少涉及到植物小分子RNA特别是miRNA领域。植物中是否存在着应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA，这些miRNA的作用是什么，目前还没有明确的答案。寻找和鉴定植物体内应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA，对于解析植物应答水稻黑条矮缩病毒侵染的分子机制具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d及其应用。

本发明所示osa-miR396d的序列如下(5’→3’)：

UCCACAGGCUUUCUUGAACUG

(序列表的序列1)。

本发明还保护序列1所示RNA在抑制生长调节因子基因(Os06g02560)表达中的应用；所述生长调节因子如序列表的序列2所示。所述生长调节因子基因可如序列表的序列2自5’末端第1至1071位核苷酸所示。

本发明还保护序列1所示RNA在促进生长调节因子基因(Os06g02560)的mRNA降解中的应用；所述生长调节因子如序列表的序列2所示。所述生长调节因子基因可如序列表的序列2自5’末端第1至1071位核苷酸所示。序列表的序列1所示的RNA可用于水稻种质改良。

本发明采用先进的Solexa高通量测序技术结合生物信息学分析、实时定量PCR、5‘RACE等多种生物学手段，首次从基因组水平鉴定到应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d，并且证实该miRNA在植物体内调控的靶基因。水稻黑条矮缩病毒侵染胁迫下，osa-miR396d表达上调抑制了该生长调节因子表达，实际上起到了延缓生长发育的效果，有利于植株适应水稻黑条矮缩病毒侵染胁迫。本发明将osa-miR396d的表达变化、靶基因的表达变化以及靶基因功能联系起来，发现水稻黑条矮缩病毒侵染胁迫下应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d主要是调控生长调节因子的表达使水稻幼苗适应病毒胁迫。已有研究表明植物生长调节因子能影响细胞分化和叶片发育等(HoriguchiG，Ferjani A，Fujikura U，Tsukaya H Coordination of cell proliferation and cellexpansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana.J Plant Res2006119：37-42.)。植物应对外界胁迫条件的有效免疫策略之一是调控生长发育进程，这一措施不仅可以增加能量储备以更好地抵御胁迫，以减少病毒向新生组织扩散。(Jonathan D.G.Jones，Jeffery L.Dangl，The plant immune system.Nature，2006444：323-328)

本发明揭示了应答水稻黑条矮缩病毒侵染的osa-miR396d在植物受病原菌胁迫中所起的重要作用。将osa-miR396d基因转入水稻中过量表达或将osa-miR396d基因缺失，就可能获得在抗病毒侵染能力方面有明显变化的转基因植株，并有望通过改造获得对病毒胁迫有较强耐受性的植株，造福于农业生产。

附图说明：

图1为Northern杂交检测不同浓度水稻黑条矮缩病毒侵染处理的水稻幼苗中osa-miR396d的表达。

图2为osa-miR396d的的靶基因5’RACE验证；序列上方的箭头表示发生切割的位点，数值表示该切点处发生切割的克隆数与克隆总数比值。

图3为实时定量RT-PCR检测靶基因的表达；误差杆表示相对标准偏差。

具体实施方式：

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

以下实施例中所用水稻品种为籼稻品种9311(Oryza sativaL.ssp indicacv.93-11)，水稻种子购自国家农作物种质保存中心(中国农业科学院作物科学研究所)。这两种水稻品种已经完成基因组测序工作。

实施例1、osa-miR396d响应病毒侵染的发现

一、水稻植株接种水稻黑条矮缩病毒处理

水稻种子经25℃浸泡24h，然后催芽萌发24h。萌发后将水稻种植在25℃培养箱中条件设定为：温度28℃/21℃(白天16h/夜晚8h)，光照强度400μmol/m2·s，相对湿度70％，由营养土提供水稻生长所需的全部营养。待水稻幼苗长到4叶期，用带有水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱接种处理，以无毒灰飞虱接种的水稻幼苗作为对照；2天后将灰飞虱赶出，将接种幼苗移栽至温室(25℃)，待3周后病株呈现矮缩症状时取样。

二、osa-miR396d的发现

1、RNA提取

将水稻样品在液氮中研磨，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，操作步骤按TRIZOL试剂盒自带的说明书进行。使用Nanodrop2000c(Thermo)分光光度计测定提取的RNA在260nm(OD260)和280nm(OD280)波长的吸光度值以及RNA的纯度和浓度。质量合格RNA的OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。

2、小RNA文库的构建

将质量检验合格的水稻幼苗总RNA用于构建小RNA文库。经水稻黑条矮缩病毒侵染处理的水稻样品及对照提取的RNA取30μg用于构建小RNA文库。对照样品提取的RNA取30μg，用于构建水稻幼苗对照小RNA文库。小RNA文库的构建按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法进行，构建好的文库采用Solexa高通量测序(北京百迈客生物公司)，获得高质量的18-30nt的小RNA序列(两个小RNA文库均获得了八百多万条序列)。

3、两个小RNA文库中应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA的鉴定

参考之前国外文献对高通量测序数据分析的成功方法(Jones-Rhoades MW，Bartel D P.Computational identification of plant miRNAs and their targets，including a stress-induced miRNA.Mol.Cell，2004，14：787-799.)，建立一套计算机分析方法用来发现和鉴定测序数据中的水稻miRNA。①将获得的两个小RNA文库中的原始序列通过计算机方法去掉3‘接头，并过滤掉序列长度在18nt以下的序列；②通过SOAP程序(Li R，Li Y，Kristiansen K，Wang J.SOAP：short oligonucleotidealignment program.Bioinformatics，2008，24：713-714.)将序列与水稻93-11基因组(http：//rice.genomics.org.cn/rice/)进行匹配，保留能与基因组完全匹配的序列，进行后续分析；③将与基因组匹配的序列与国际权威的miRNA数据库miRBase(http：//microma.sanger.ac.uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前体序列进行BLAST，从而发现哪些序列来自于已知的水稻miRNA。

由于高通量测序能给出每个miRNA的测序次数，通过比较水稻黑条矮缩病毒侵染的水稻病株小RNA文库和对照小RNA文库中miRNA的测序数(测序数已经根据小RNA文库测序总数进行了标准化)，可以从中发现两个库中测序数相差较大的miRNA，这部分miRNA可能就是应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA。基于此方法，比较了两个小RNA文库中miRNA的测序数，并采用以下两个限制条件来提高发现应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA的成功率：①miRNA在水稻黑条矮缩病毒侵染处理小RNA文库或对照小RNA文库中测序数要大于100，从而可以保证比较的可靠性；②miRNA在水稻黑条矮缩病毒侵染处理小RNA文库和对照小RNA文库中测序数相对差异要大于30％。发现有9个miRNA家族的测序数存在显著差异，可能是应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA家族，其中一个为osa-miR396d。

osa-miR396d的序列如下(5’→3’)：UCCACAGGCUUUCUUGAACUG(序列1)。

水稻黑条矮缩病毒侵染处理小RNA文库的测序次数为322，对照小RNA文库(Q对照)的测序次数为2061，相对差异【(QH202/Q对照-1)×100％】为+640％。

三、miRNA Northern杂交

为了进一步验证osa-miR396d具有应答水稻黑条矮缩病毒侵染的表达模式，采用miRNA Northern杂交检测水稻黑条矮缩病毒侵染之后病株体内(3天、5天、7天、9天后)miRNA的表达情况。

1、制备探针

检测osa-miR396d的探针(5’→3’)的序列：CAGTTCAAGAAAGCCTGTGGA。

采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)对上述序列末端磷酸基团进行同位素(γ-32P ATP)标记，得到探针用于Northern杂交。

2、miRNA Northern杂交

Northern杂交中，每个泳道上样量为301t g低分子量RNA，T6基因作为内参，与miRNA在同一张膜上检测。T6基因的探针序列为：TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。

(1)分别提取步骤一制备的各水稻样品的总RNA。

(2)采用Park等报道的PEG8000/NaCl沉淀法(Park W，Li J，Song R，MessingJ，Chen X.CARPEL FACTORY，a Dicer homolog，and HEN1，a novelprotein，act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana.CTrr.Biol.，2002，12：1484-1495.)从总RNA中富集低分子量RNA(有利于提高miRNA的检测能力)。

(3)miRNA Northern杂交

①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等体积的2×RNA上样缓冲液(95％甲酰胺，18mM EDTA，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，混合后95℃变性5min，得到RNA样品。

②RNA样品用15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后用电转移装置(BIO-RAD)转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences)上。

③转移有RNA样品的尼龙膜经6×SSC溶液短暂漂洗，紫外交联(Stratagene)5min，再80℃烘烤2h，使RNA完全固定在尼龙膜上。

④将转移了RNA的尼龙膜放入杂交管中，加入5ml TLTRAhyb-Oligo杂交液(Ambion)在杂交炉中42℃预杂交2h，然后加入探针，混匀，42℃杂交过夜。

⑤杂交结束后，小心倒出杂交液，加入含0.5％SDS的2×SSC溶液，42℃洗涤三次，每次10min。

⑥洗膜结束后，将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光1周。

⑦曝光结束后，冲洗X光片，进行光密度扫描，以对照组的杂交信号为1，计算各个处理组杂交信号的相对强度。

结果见图1。Northern杂交结果和测序数据很吻合，osa-miR396d水稻黑条矮缩病毒侵染后表达上调。

实施例2、应答水稻黑条矮缩病毒侵染的miRNA的靶基因预测与验证

由于植物miRNA与靶基因mRNA近乎完全互补，因此可以通过生物信息学方法预测osa-miR396d的靶基因。使用psRNATarget程序在水稻全长cDNA库中寻找能与miRNA序列近乎完全互补的cDNA或基因http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/，即为miRNA的靶标；参数设置为：Patscan程序参数为默认设置，允许最大错配数为3个，miRNA的第10和11位碱基不允许有错配，以同源性最高的已知功能基因进行注释。

预测结果见表1。

表1.osa-miR396d的靶基因及功能

osa-miR396d的靶标是生长调节因子(growth-regulating factor)基因Os06g02560(GENBANK ACCESSIONNO.Os06g02560，见序列表的序列3；编码序列表的序列2所示的蛋白质)。生长调节因子参与植物发育调控+过程。

实施例3、miRNA对靶基因mRNA的切割

osa-miR396d对靶基因Os06g02560(见序列表的序列3)mRNA的切割用5’RACE方法进行验证(Jones-Rhoades M W，Bartel D P.Computationalidentification of plant miRNAs and their targets，including a stress-inducedmiRNA.Mol.Cell，2004，14：787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其较为稳定的3’切割产物5’端核苷酸磷酸集团暴露，用T4RNA连接酶在该切割产物5’端连接上5’RACE专用接头；通过反转录反应合成cDNA；通过靶基因特异的巢式外引物和试剂盒所带的巢式外引物进行第一轮PCR，靶基因特异的巢式内引物和试剂盒所带的巢式内引物进行第二轮PCR；

将5’RACE获得的PCR产物连接到pMD19-T载体后测序，就能知道精确的靶基因mRNA切割位点。

1、分别提取实施例1的步骤一制备的各水稻样品的总RNA。

2、按Firstchoice RLM-RACE试剂盒(Ambion)操作说明进行5’RACE，靶基因特异的巢式外引物的序列为：CGTAGGGGAGAAGATGGGGACGAT，靶基因特异的巢式内引物的序列为：TGTACGGGCGAGCCAGCATGTAGTA。

3、PCR产物进行琼脂糖电泳，回收250bp左右的特异条带(图2中泳道1所示)。

4、将回收的PCR产物连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，并转化大肠杆菌DH5α(TaKaRa)。

5、挑单克隆测序，根据测序结果确定靶基因mRNA的切割位点。

测序结果显示的切割位点见图2。osa-miR396d的靶基因在与其互补的区域发生了切割，这个结果强有力的证明了Os06g02560确实是osa-miR396d体内真正调控的靶基因(图2中，有4个切割位点，切割概率比为6∶4。

实施例4、靶基因的表达量分析

为了进一步考察osa-miR396d的功能，用实时定量RT-PCR检测靶基因Os06g02560在水稻黑条矮缩病毒侵染后不同时期(3天、5天、7天、9天后)的水稻植株中的表达情况。

1、分别提取实施例1的步骤一制备的各水稻样品(2g)的总RNA。

2、采用TaKaRa RNA PCR Kit，用RNA合成cDNA模板，操作按试剂盒说明书进行。

3、采用SYBR Green PCR Master Mix(Bio-Rad)在iCycler iQ5multicolor实时定量PCR检测仪(Bio-Rad)上进行PCR扩增反应，通过比较CT值法(ΔΔCT值法)计算靶基因在不同样品中的相对表达量(对照组基因的表达量设定为1)。靶基因的检测设置3个重复，结果取平均值。以水稻β-tubulin基因作为内参。

扩增靶基因的引物如下(5’→3’)：

上游引物：TCTCAGGAGCATCAGGAAACA；

下游引物：CCCTTGGCTTTGACATCG

扩增β-tubulin基因引物如下(5’→3’)：

上游引物：CCTCCAAGGATTTCAAGTCTGC；

下游引物：TTGTAAGGTTCCACCACGGTA。

结果见图3。靶基因Os06g02560在水稻黑条矮缩病毒侵染的病株中表达量发生了明显的变化，通过和osa-miR396d的表达(图1)进行比较，发现Os06g02560的表达和osa-miR396d的表达呈现出明显的负相关性，即osa-miR396d表达上调的时候，Os06g02560的表达就相应下调，这与miRNA对靶基因的负调控作用是完全一致的。osa-miR396d的表达随着水稻黑条矮缩病毒在病株中表达量升高提高而增加；相应地，Os06g02560的表达随着H202处理浓度增加而呈现出先下降后上升的表达模式，与osa-miR396d的表达完全负相关。实时定量PCR的结果进一步证明了Os06g02560确实是osa-miR396d的靶基因。

上述实施不以任何形式限定本发明。

Claims (4)

1.一种应答水稻黑条矮缩病病毒侵染的osa-miR396d，序列表的序列1所示的RNA在抑制生长调节因子基因表达中的应用；所述生长调节因子如序列表的序列2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生长调节因子基因如序列表的序列2自5’末端第1至1071位核苷酸所示。

3.序列1所示RNA在促进生长调节因子基因的mRNA降解中的应用；所述生长调节因子如序列表的序列2自5’末端第1至1071位核苷酸所示。

4.序列表的序列1所示的RNA在水稻种质改良中的应用。

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