CN118256518A - 一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3及其应用，本发明鉴定了一个新的黄瓜不定根形成调控基因CsSUS3，其编辑突变体的不定根形成能力减弱，而过表达突变体的不定根形成能力显著增强。本发明的基因CsSUS3可用于指导黄瓜耐涝种质资源的选育和改良，为黄瓜耐涝品种选育提供技术支撑。本发明通过两种转基因技术，共同探究CsSUS3在诱导涝胁迫黄瓜不定根形成中的应用，为黄瓜耐涝分子遗传改良提供新的基因资源，本发明提供了黄瓜涝胁迫诱导不定根形成的基因CsSUS3，在研究提高黄瓜耐涝性方面具有重要应用价值。

Description

一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativusL.)是广泛栽培的主要蔬菜，广受消费者欢迎。而黄瓜夏秋季生产长期面临雨涝胁迫的危害，由于黄瓜主根不发达，好气性强，且难以形成通气组织，因此淹涝后植株氧气含量急剧下降，极易受害。黄瓜受涝后会产生茎源不定根，新形成的不定根代替受损的原生根系促使植株恢复生长。因此，挖掘调控不定根形成的关键基因是实现黄瓜耐涝遗传改良的基础。

现有技术已经报道了在黄瓜耐淹涝品系Zaoer-N中，CsARN6.1基因通过增加不定根的产生来促进黄瓜对淹涝的适应。这种不定根增加的效应可能是Zaoer-N中CsARN6.1蛋白的coiled-coil结构域的一个非同义SNP突变导致的。CsARN6.1基因调控不定根数依赖于其ATP酶的活性。在拟南芥中异源表达CsARN6.1基因导致种子萌发后主根生长速度显著快于对照株系，且侧根形成时间更早。将来源于Zaoer-N中的CsARN6.1基因转入与不耐涝亲本Pepino等位基因遗传背景一致的品系后，其在淹涝状态下比对照表现出不定根数量增加。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3，本发明鉴定了一个新的黄瓜不定根形成调控基因CsSUS3，其编辑突变体的不定根形成能力减弱，而过表达突变体的不定根形成能力显著增强。本发明的基因CsSUS3可用于指导黄瓜耐涝种质资源的选育和改良，为黄瓜耐涝品种选育提供技术支撑。

本发明还提供所述调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3，所述基因CsSUS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，用于扩增所述基因CsSUS3的引物对为CsSUS3-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’；CsSUS3-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’。

本发明所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的基于调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3的基因敲除载体CRISPR-CsSUS3。

其中，所述基因敲除载体CRISPR-CsSUS3构建方法为设计CsSUS3的靶基因序列sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1:5’-CGATCAGTTCATGATGTTGCAGG-3’；sgRNA2:5’-CCCCATCAGCTAGTTTC CTTCGG-3’；以pCBC-DT1T2(Cm)为模板扩增双靶，将形成的双链sgRNA1/2连接到pkSE402载体上，通过大肠杆菌转化和农杆菌转化，提取质粒，最终得到基因敲除载体CRISPR-CsSUS3。

本发明所述的含有所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3的过表达载体OE-CsSUS3。

其中，所述过表达载体OE-CsSUS3构建方法为以CsSUS3基因的CDS区域设计载体构建的引物，

OE-CsSUS3-F:gagaacacgggggacggatccATGGCAGAACGAGTTCTCAACC；

OE-CsSUS3-R:atggtctttgtagtcggatccCTCATCCACAGCCGGTGGC；

将基因进行扩增，酶切连接到pCAMBIA1305.4载体后，通过大肠杆菌转化和农杆菌转化，提取质粒，最终得到过表达载体OE-CsSUS3。

本发明所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3在诱导涝胁迫黄瓜不定根形成中的应用。

其中，通过CRISPR/Cas9编辑黄瓜CsSUS3基因，使得其涝胁迫诱导不定根形成能力下降；通过过表达黄瓜CsSUS3基因，使得其涝胁迫诱导不定根形成能力升高。

本发明所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3在培育耐涝黄瓜种质中的应用。

本发明以黄瓜“CCMC”品系为材料，通过CRISPR/Cas9技术构建双靶点，获得稳定的CRISPR-CsSUS3基因编辑材料，将CRISPR-CsSUS3转基因材料与对照材料(WT)进行淹涝处理，观察植株表型变化，通过实时荧光定量技术，检测敲除CsSUS3基因后黄瓜涝胁迫不同时间下胚轴的基因表达量变化，结果显示敲除CsSUS3基因后该基因表达量显著低于对照且能够抑制黄瓜涝胁迫下不定根的形成。以黄瓜“XTMC”品系为材料，利用pCAMBIA1305.4为载体构建OE-CsSUS3过表达载体，获得稳定的OE-CsSUS3过表达材料，将OE-CsSUS3转基因材料与对照材料(WT)进行淹涝处理，观察植株表型变化，通过实时荧光定量技术，检测过表达基因后黄瓜涝胁迫不同时间下胚轴的基因表达量变化，结果显示过表达CsSUS3基因后该基因表达量显著高于对照且能够促进黄瓜涝胁迫下不定根的形成。通过两种转基因技术，共同探究CsSUS3在诱导涝胁迫黄瓜不定根形成中的应用，为黄瓜耐涝分子遗传改良提供新的基因资源。本发明提供了黄瓜涝胁迫诱导不定根形成的基因CsSUS3，在研究提高黄瓜耐涝性方面具有重要应用价值。

本发明所述的基于过表达CsSUS3创制黄瓜耐涝新种质的应用。本发明通过过表达CsSUS3基因获得的转基因植株，其不定根形成能力显著高于阴性对照植株，其耐涝性显著强于对照植株。本发明创制的黄瓜耐涝新种质在黄瓜耐涝遗传育种研究中具有重要应用价值。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明鉴定了一个新的调控不定根形成的基因，为黄瓜耐涝分子遗传改良提供新的基因资源。进一步本发明获得了一份耐涝能力增强的黄瓜新种质。本发明通过遗传转化获得黄瓜CsSUS3基因编辑突变体和过表达突变体，与野生型相比，基因编辑突变体不定根形成能力减弱，过表达突变体不定根形成能力增强。

本发明利用分子生物学方法克隆一个基因CsSUS3，并证明了其调控不定根形成的功能。本发明所述的基因挖掘和耐涝植株获取方法操作步骤明确，可复制性强，可以将该基因应用至其它转基因体系成熟的作物中以获取耐涝种质，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为利用实时荧光PCR检测CsSUS3在黄瓜不同器官及淹涝处理不同时期的组织特异性。图1(a)为CsSUS3在黄瓜不同器官的表达量，Root：根，Stem：茎，Leaf：叶，MaleFlower：雌花，Female Flower：雄花，Fruit：果实；图1(b)和图1(c)分别为淹涝处理3天和7天黄瓜幼苗不同组织的表达量，Root：根，Hypocotyl：下胚轴，Leaf：叶。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图2为CsSUS3在黄瓜下胚轴涝胁迫不同时间的表达特性。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图3为黄瓜CsSUS3基因通过CRISPR/Cas9技术被敲除后CsSUS3基因的表达水平分析。(a)CRISPR/Cas9-CsSUS3靶向位点及基因分型示意图；(b)基因编辑植株(cr-1，cr-2，cr-3)与对照植株涝胁迫下基因表达量鉴定。WT为对照植株，cr-1，cr-2，cr-3为基因编辑植株。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图4为黄瓜CsSUS3基因通过CRISPR/Cas9技术被敲除后转基因植株在涝胁迫下的表型。(a)基因编辑植株(cr-1，cr-2，cr-3)与对照植株涝胁迫下不定根数量统计；(b)基因编辑植株(cr-1，cr-2，cr-3)与对照植株涝胁迫下表型观察；(c)表型观察局部图。WT为对照植株，cr-1，cr-2，cr-3为基因编辑植株。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图5为黄瓜CsSUS3基因过表达黄瓜植株的CsSUS3基因的表达水平分析及表型观察。(a)过表达植株(oe-1，oe-2，oe-3)与对照植株涝胁迫下基因表达量鉴定。(b)过表达植株(oe-1，oe-2，oe-3)与对照植株涝胁迫下不定根数量统计；(c)过表达植株(oe-1，oe-2，oe-3)与对照植株涝胁迫下表型观察；(d)表型观察局部图。WT为对照植株，oe-1，oe-2，oe-3为过表达植株。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图6为CsSUS3基因编辑黄瓜植株不定根形成的解剖结构和形态观察。

图7为CsSUS3基因过表达黄瓜植株不定根形成的解剖结构和形态观察。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明采用栽培黄瓜品种“Zaoer-N”进行相关实验，该品种来自于扬州大学园艺园林学院黄瓜遗传育种与分子学创新团队种质资源库(Sugar enhances waterlogging-induced adventitious root formation in cucumber by promoting auxin transportand signaling.Plant Cell and Environment,2020,43,1545-1557.)。

转化受体材料为“CCMC”为公知受体材料(A CsEIL3-CsARN6.1 module promoteswaterlogging-triggered adventitious root formation in cucumber by activatingthe expression ofCsPrx5，The Plant Journal，2023，114,824-835)。

pCBC-DT1T2(Cm)、pkSE402、pCAMBIA1305.4等均为公知或者可直接购买载体，其中pCAMBIA1305.4(The exocyst subunit CsExo70B promotes both fruit length anddisease resistance via regulating receptor kinase abundance at plasmamembrane in cucumber.Plant Biotechnology Journal,2024,22:347–362)。

CsSUS3基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)黄瓜组织cDNA合成：提取黄瓜“Zaoer-N”下胚轴组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

(2)CsSUS3基因的PCR扩增：设计引物(CsSUS3-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’；CsSUS3-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’)，以黄瓜组织cDNA为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

本发明黄瓜CsSUS3基因的编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例1

以黄瓜“Zaoer-N”品系的苗龄45天的植株不同组织(根、茎、叶、雌花、雄花、果实)以及21天苗龄黄瓜“Zaoer-N”幼苗淹涝处理3天和7天的不同组织(根、下胚轴、叶)，采用MiniBEST Plant RNAExtraction Kit(Takara)试剂盒提取各组织总RNA，Prime ScriptRT试剂盒反转录获得cDNA，ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒定量扩增基因后，用Real-Time PCR检测目的基因CsSUS3基因表达，以黄瓜的actin(CsaV3_6G041900)为内参基因。根据所述基因序列设计特异性定量引物。以上述不同组织的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测CsSUS3在黄瓜不同组织的特异性。

以黄瓜的actin(CsaV3_6G041900)作为内参基因:

actin-F:5’-GCTGGATTCTGGTGATGGTG-3’；

actin-R:5’-AGCAAGGTCCAAACGGAGAA-3’；

目的基因CsSUS3设计的引物序列:

CsSUS3-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’；

CsSUS3-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’；

如图1所示CsSUS3在黄瓜“Zaoer-N”各个组织均有表达，在根中优势表达。黄瓜幼苗中，淹涝处理3d时CsSUS3在下胚轴中高表达，其次是根；淹涝处理7d时CsSUS3在下胚轴中依旧是高表达，不定根中次之，最后是根。表明该基因在成熟植株的原生根系中优势表达，并且在淹涝处理的黄瓜幼苗新生根系形成部位和新生根系中优势表达。

实施例2

以黄瓜品系“Zaoer-N”为材料，将种子浸泡后在28℃下催芽，芽长出0.5cm时播种在50孔穴盘，在人工气候培养室中培养至21天苗龄。将黄瓜幼苗随穴孔剪下后置于透明塑料杯中，加水至植株子叶下端进行淹涝实验。以淹涝处理0d、1d、2d、3d、7d下胚轴的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测CsSUS3随淹涝时间的变化，方法同实施例1。

黄瓜的actin(CsaV3_6G041900)作为内参基因:

actin-F:5’-GCTGGATTCTGGTGATGGTG-3’；

actin-R:5’-AGCAAGGTCCAAACGGAGAA-3’；

目的基因CsSUS3设计的引物序列:

CsSUS3-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’；

CsSUS3-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’；

如图2所示淹涝处理0d、1d、2d、3d、7d的黄瓜幼苗下胚轴中CsSUS3被高诱导表达且基因表达量先上升后下降，在2d时表达量最高，进一步说明CsSUS3基因在涝胁迫诱导不定根发生中具有重要作用。

实施例3

以黄瓜CsSUS3基因进行CRISPR/Cas9载体构建。

(1)CsSUS3基因敲除载体的构建：设计2个CsSUS3的靶基因引物序列sgRNA1和sgRNA2。设计的把基因序列分别为：

sgRNA1:5’-CGATCAGTTCATGATGTTGCAGG-3’；

sgRNA2:5’-CCCCATCAGCTAGTTTCCTTCGG-3’；

以pCBC-DT1T2为模板，使用PrimerSTAR高保真酶进行PCR扩增获得双靶产物，反应体系为50μL，包含5×PrimeSTARBuffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，sgRNA1引物1μL，sgRNA2引物1μL，ddH₂O 32.5μL，pCBC-DT1T2(Cm)质粒1μL，PrimerSTAR高保真酶0.5μL。反应程序为95℃5min；95℃15sec、55℃15sec、72℃15sec，35个循环；72℃5min。

将扩增获得的双靶产物sgRNA1/2连接到pkSE402载体上，反应体系为15μL，包含pkSE402载体1.2μL，双靶产物2μL，Bsal 1μL，T4 Liguse 1μL，10×NEB T4 Buffer 1.5μL，ddH₂O 8.3μL。反应程序为37℃5min；16℃5min、60℃5min、12℃保温。将连接产物15μL加入50μL大肠杆菌感受态，两者混合均匀后于冰上冷冻30min，42℃热激30sec，至于冰上静置2min，加入500μL LB液体培养基，混匀后放于37℃恒温振荡器中培养1h，取100μL菌体涂布在Kan+LB固体培养基中，培养基至于37℃培养箱中培养12-16h。挑取单菌落进行阳性检并送至擎科生物技术有限公司测序，选择正确的单克隆进行扩繁，用Plasmid MiniKit质粒DNA小提试剂盒抽提质粒。将质粒转入农杆菌感受态EHA105，将感受态EHA105放在冰上融化，吸取50μL感受态和2μL质粒，混匀后，依次至于冰上5min、液氮5min、37℃5min、冰上5min，加入700μL LB液体培养基，混匀后，在28℃摇床中培养2-3h，取100μL菌体涂布在Kan+Rif LB固体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养2～3天，挑单克隆菌株检测并保存得到基因敲除载体CRISPR-CsSUS3的农杆菌，用于后续遗传转化。

(2)CRISPR-CsSUS3转基因植株的获得及阳性检测

采用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株，转化受体材料为“CCMC”，基本方法如下：“CCMC”种子浸泡在蒸馏水中至于55℃水浴锅中30min，剥去种皮，灭菌水冲洗3～4遍，75％酒精浸泡30sec，经2％次氯酸钠溶液浸泡10min，用灭菌ddH₂O冲4～5遍，将种子播种于SGM培养基上，锡箔纸包裹后放于28℃恒温培养箱中36h；将携带CRISPR-CsSUS3基因敲除载体的农杆菌用含有Kan和Rif抗生素的LB固体培养基培养12h，在40mL IM液体培养基加入菌体，混匀培养后测OD₆₀₀，使OD₆₀₀＝0.2，放于28℃恒温培养箱；将芽撇去，切去种子的1/3后一分为二，于IM液体培养基中浸泡，待处理完种子后一起转移到含有菌液的IM液体培养基中，用KQ5200DE型数控超声波清洗器超声20sec，真空渗透90sec(共两次)，最后用镊子将外植体摆放在IM固体培养基上，锡箔纸包裹后放于25℃恒温培养箱中3d；将外植体转移至SRM培养基，放于26℃光照16h/黑暗8h环境中培养2～3周；荧光显微镜观察并挑选出带有绿色荧光的外植体，切除长度约1cm的假定转化体，剩余部分至于RM培养基中诱导生根，将生根的组培苗转移到基质中驯化培养，最后移至温室中栽培。

通过PCR筛选CRISPR-CsSUS3转基因阳性植株，进一步通过测序来确定敲除植株的基因编辑类型。在CsSUS3靶基因序列附近设计特异引物检测基因敲出片段序列，引物序列如下所示：

CRISPR-CsSUS3-F:5’-CAACCGTATTCATAGCC-3’；

CRISPR-CsSUS3-R:5’-CTGGTTGGGTTCTGATA-3’。

以CRISPR-CsSUS3转基因植株叶片DNA为模板，使用PrimerSTAR高保真酶进行PCR扩增并测序，获得编辑位点。反应体系为50μL，包含5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTPMixture 4μL，CRISPR-CsSUS3-F引物1μL，CRISPR-CsSUS3-R引物1μL，ddH₂O 32.5μL，DNA模板1μL，PrimerSTAR高保真酶0.5μL。反应程序为95℃5min；95℃15sec、55℃15sec、72℃15sec，35个循环；72℃5min。结果如图3(a)所示共有3种编辑类型，测序分析发现cr-1，cr-2和cr-3分别发生了51bp、3bp和25bp碱基缺失。

实施例4

CRISPR-CsSUS3转基因黄瓜植株基因表达量检测及表型观察

(1)CRISPR-CsSUS3转基因黄瓜植株基因表达量检测

将对照植株(WT)和CRISPR-CsSUS3转基因植株(cr-1、cr-2、cr-3)淹涝处理12h、24h、48h、72h后取下胚轴提取RNA进行反转录，通过实时荧光PCR检测(CsSUS3-qRT-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’,CsSUS3-qRT-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’)对照植株和三种编辑类转基因植株中CsSUS3的表达量。如图3(b)所示，随着淹涝时间的增加，CsSUS3基因表达量逐渐上升，三种编辑类型的转基因植株在各个时间点表达量均显著低于对照植株。

(2)CRISPR-CsSUS3转基因黄瓜植株的表型观察

为了确认CsSUS3基因诱导不定根的功能，将对照植株(WT)和CRISPR-CsSUS3转基因植株(cr-1、cr-2、cr-3)淹涝处理12h、24h、48h、72h后进行观察。如图4(a)(b)所示，CRISPR-CsSUS3转基因植株生长状态良好，三种编辑类型的转基因植株在各个时间点不定根数量均显著低于对照植株。

实施例5

以黄瓜CsSUS3基因进行pCAMBIA1305.4过表达载体构建。

以CsSUS3基因的CDS区域(去除终止密码子)设计载体构建的引物，设计的引物序列：

OE-CsSUS3-F:gagaacacgggggacggatccATGGCAGAACGAGTTCTCAACC；

OE-CsSUS3-R:atggtctttgtagtcggatccCTCATCCACAGCCGGTGGC。

首先以CsSUS3基因为模版，使用PrimerSTAR高保真酶进行PCR扩增获得产物，反应体系为50μL，包含5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，OE-CsSUS3-F引物1μL，OE-CsSUS3-R引物1μL，ddH₂O 32.5μL，模板1μL，PrimerSTAR高保真酶0.5μL。反应程序为95℃5min；95℃15sec、55℃15sec、72℃15sec，35个循环；72℃5min。利用同源重组试剂盒(ⅡOne Step Cloning Kit)将纯化后的PCR产物与线性载体重组连接，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer 2μL，纯化PCR产物1μL，pCAMBIA1305.4载体片段1μL，重组酶Exnase II 1μL，5μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌DH5a(全式金，北京)，挑取单克隆，PCR扩增检测并测序，选择正确单克隆进行扩繁并抽提质粒得到过表达载体OE-CsSUS3。将质粒转入农杆菌感受态EHA105，挑单克隆菌株检测并保存得到过表达载体OE-CsSUS3的农杆菌，用于后续遗传转化(方法同实施例3(1))。

(2)OE-CsSUS3转基因植株的获得及阳性检测

采用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株，转化受体材料为“CCMC”，方法同实施例3(2)。

对过表达转基因植株进行阳性检测，通过PCR筛选OE-CsSUS3转基因阳性植株，检测引物序列：

OE-CsSUS3-F:5’-GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGA-3’；

OE-CsSUS3-R:5’-atggtctttgtagtcggatCCCTCATCCACAGCCGGTGGC-3’。

以过表达转基因植株叶片DNA为模板，使用Taq PCR MasterMixⅡ进行PCR扩增。反应体系为20μL，包含2×Taq PCR MasterMixⅡ10μL，OE-CsSUS3-F引物1μL，OE-CsSUS3-R引物1μL，ddH₂O 7μL，DNA模板1μL。反应程序为98℃5min；98℃30sec、55℃30sec、72℃3min，35个循环；72℃10min；经琼脂糖凝胶电泳池检测后筛选出阳性株系OE-CsSUS3转基因植株(oe-1、oe-2、oe-3)。

实施例6

OE-CsSUS3转基因黄瓜植株基因表达量检测及表型观察

(1)OE-CsSUS3过表达转基因黄瓜植株基因表达量检测

将对照植株(WT)和OE-CsSUS3转基因植株(oe-1、oe-2、oe-3)淹涝处理0h、12h、24h、48h、72h和168h后取下胚轴提取RNA进行反转录，通过实时荧光PCR检测(CsSUS3-qRT-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’,CsSUS3-qRT-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’)对照植株和过表达转基因植株中CsSUS3的表达量。如图5(a)所示，随着淹涝时间的增加，CsSUS3基因表达量逐渐上升，过表达转基因植株在各个时间点表达量均显著高于对照植株。

(2)OE-CsSUS3转基因黄瓜植株的表型观察

为了确认CsSUS3基因诱导不定根的功能，将对照植株(WT)和OE-CsSUS3转基因植株(oe-1、oe-2、oe-3)淹涝处理0h、12h、24h、48h、72h和168h后进行观察。如图5(b)(c)所示，OE-CsSUS3过表达转基因植株生长状态良好，过表达转基因植株在各个时间点不定根数量均显著高于对照植株。淹涝168h的过表达植株新叶数量、面积和生长状态优于对照，表明其耐涝性强于对照。

实施例7

CRISPR-CsSUS3转基因黄瓜植株下胚轴解剖结构观察

为了确认淹涝处理后对照植株和CRISPR-CsSUS3转基因植株(cr-1、cr-2、cr-3)不定根的形成过程，对其下胚轴进行横切切片观察。将淹涝处理12h、24h、48h的植株取下胚轴鲜样，使用手动小型植物组织专用切片机MTH-1、0.1M甲苯胺蓝染色剂、体式显微镜，对受涝部位下胚轴的横切面进行观察，CRISPR-CsSUS3转基因植株在淹涝12h和24h几乎没有不定根的发生，淹涝48h后不定根原基从维管束的束中形成层开始分化；而对照植株在淹涝24h后不定根原基从维管束的束中形成层开始分化，淹涝48h后不定根原基突破表皮，形成肉眼可见的不定根。由此可见，CRISPR-CsSUS3转基因植株不定根的形成明显慢于对照植株，如图6所示。

实施例8

OE-CsSUS3转基因黄瓜植株下胚轴解剖结构观察

为了确认涝胁迫对照植株和OE-CsSUS3转基因植株(oe-1、oe-2、oe-3)不定根的形成过程，对其下胚轴进行横切切片观察。将淹涝处理12h、24h、48h的植株取下胚轴鲜样，使用手动小型植物组织专用切片机MTH-1、0.1M甲苯胺蓝染色剂、体式显微镜，对受涝部位下胚轴的横切面进行观察，对照植株和OE-CsSUS3转基因植株在淹涝12h几乎没有不定根的发生，OE-CsSUS3转基因植株淹涝24h其不定根原基从维管束的束中形成层开始分化甚至突破表皮；在淹涝48h后形成肉眼可见的不定根。而对照植株在淹涝24h后不定根原基从维管束的束中形成层开始分化但均未突破表皮，直到淹涝48h后不定根原基突破表皮。由此可见，OE-CsSUS3转基因植株不定根的形成明显快于对照植株，如图7所示。

Claims (10)

1.一种调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3，其特征在于，所述基因CsSUS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3，其特征在于，用于扩增所述基因CsSUS3的引物对优选为CsSUS3-F:5’-CCTGTGGATTGCCTACCTTT-3’；CsSUS3-R:5’-TGGGTCTTCCTTGCTCTTCT-3’。

3.一种权利要求1所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3表达的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种基于权利要求1所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3的基因敲除载体CRISPR-CsSUS3。

5.根据权利要求4所述的基因敲除载体CRISPR-CsSUS3，其特征在于，所述基因敲除载体CRISPR-CsSUS3构建方法为设计CsSUS3的靶基因序列sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1:5’-CGATCAGTTCATGATGTTGCAGG-3’；sgRNA2:5’-CCCCATCAGCTAGTTTCCTTCGG-3’；以pCBC-DT1T2(Cm)为模板扩增双靶，将形成的双链sgRNA1/2连接到pkSE402载体上，通过大肠杆菌转化和农杆菌转化，提取质粒，最终得到基因敲除载体CRISPR-CsSUS3。

6.一种含有权利要求1所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3的过表达载体OE-CsSUS3。

7.根据权利要求6所述的过表达载体OE-CsSUS3，其特征在于，所述过表达载体OE-CsSUS3构建方法为以CsSUS3基因的CDS区域设计载体构建的引物，

OE-CsSUS3-F:gagaacacgggggacggatccATGGCAGAACGAGTTCTCAACC；

OE-CsSUS3-R:atggtctttgtagtcggatccCTCATCCACAGCCGGTGGC；

将基因进行扩增，酶切连接到1305.43*flag载体后，通过大肠杆菌转化和农杆菌转化，提取质粒，最终得到过表达载体OE-CsSUS3。

8.一种权利要求1所述的基因CsSUS3在诱导涝胁迫黄瓜不定根形成中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过CRISPR/Cas9编辑黄瓜CsSUS3基因，使得其涝胁迫诱导不定根形成能力下降；通过过表达黄瓜CsSUS3基因，使得其涝胁迫诱导不定根形成能力升高。

10.一种权利要求1所述的调控涝胁迫诱导黄瓜不定根形成的基因CsSUS3在培育耐涝黄瓜种质中的应用。