CN116731139B - 毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用 - Google Patents
毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用 Download PDFInfo
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- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
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- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Abstract
本发明公开了毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用。所述毛白杨PtoERF15基因编码SEQ ID所示的氨基酸序列的蛋白。通过构建pCXDG‑PtoERF15载体并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型毛白杨(WT)植株后，能够改变毛白杨的次生壁沉积并增强其的抗旱性。本发明对于创制抗旱高木材产量杨树新品种具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用。
背景技术
干旱是导致植物不良发育的主要因素之一。近年来，气候的不稳定性加剧，由于不规律降水造成的干旱问题频频发生，全球范围内几乎每年都有旱灾发生，严重制约了作物及森林产能。根据气候变化模型预测显示，全球范围内受到干旱影响的地区会逐年增加，这可能会对全球植被及经济产生毁灭性的影响(Li et al.,2013)。干旱胁迫是限制我国农林业生产可持续发展的主要因素之一。干旱导致森林减产尤为严重(Barber et al.,2000；Zawaski&Busov,2014)。目前迫切需要开展耐旱林木新品种选育工作。但传统林木育种存在周期长、选育难等多种困难。因此，利用基因工程技术创制抗旱林木新种质具有广阔的发展前景。
杨树(Populus spp.)是世界范围内种植最为广泛的一种速生树木，树干通直，较短年限内便可砍伐利用，是全球速生林的主要种植树种之一。此外，杨树根深枝茂，能够防风固沙，减少水土流失，是营造防林及城乡绿化的理想树种(施恭明.2009)。除了重要的生态价值外，杨树也具有广泛的工业和建筑用途，杨树可以用于制浆造纸、是纤维板、胶合板的原材料，也被作为建筑和家具用材，同时是生物能源产业的重要原料(吴定新等.,1997；傅峰等.,1999；黄北.2013)。
毛白杨是我国特有的乡土树种，因其生长迅速、材质优良、适应性强的特点也成为北方地区广泛种植的用材树种。近年来，毛白杨遗传转化体系和基因敲除技术的建立使深入研究其木材形成和环境适应等重要性状的调控机理成为可能(Fan et al.2015；Xu etal.2017)。随着对杨树抗旱调控机制的深入研究和解析，如果通过基因工程技术创制优良树种，从而提高林木对干旱地区的适应能力具有重要的科学意义和经济价值。
目前，杨树抗旱调控的分子研究主要集中在干旱条件下调节茎导管输水效率(Liet al.2019)，植物对缺水反应的生理和生化过程(曹旭.2015)，氧化应激(李江艳.2014)，叶片的结构功能与干旱胁迫的关系(Song et al.2022)和根系形态与胁迫耐受性(Dash etal.2017)等多个方面的研究
AP2/ERF家族基因被报道广泛参与调控植物干旱响应过程(Xie et al.,2019)。拟南芥中，ERF109通过ROS响应基因提高植物干旱抗性(Wang et al.,2020)，且与ERF018协同调控木质部的发育(Etchells et al.,2012)。在杨树中，PtERF139调控次生木质部的次生壁沉积和细胞膨胀，导致导管孔径变小，并激活大量的水分胁迫响应基因的表达(Wesselset al.,2019)。PtaERF194通过促进次生木质部发育，提高导管密度并降低导管大小，增强杨树在干旱下的水分维持能力(Wang et al.,2022)。这些研究表明，ERF类转录因子在介导干旱胁迫影响树木木质部可塑性发育中具有重要作用，但其整合调控机制尚不清楚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：本发明提供了一种可增强毛白杨抗旱性的新的转录因子及其应用。
本发明的技术方案为：转录因子PtoERF15，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
编码上述所述转录因子PtoERF15的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种表达载体，含有上述所述的基因。
上述所述的基因或表达载体在调控杨树抗旱上的应用。
进一步地，所述应用为在杨树中超表达编码转录因子PtoERF15的基因，从而增强干旱胁迫抗性。
一种构建抗旱性增强的毛白杨株系的方法，包括如下步骤：
(1)将编码转录因子PtoERF15的基因连接至植物表达载体，转化农杆菌，获得PtoERF15过表达载体；
(2)采用农杆菌介导的叶盘法将步骤(1)构建的过表达载体导入野生型毛白杨叶片中；
(3)通过共培养、选择培养、获得丛生芽、获得生根转基因植株以及阳性植株鉴定过程，最终得到抗旱性增强的毛白杨株系。
进一步地，所述植物表达载体为pCXDG质粒。
本发明提供了毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用。通过将PtoERF15过表达植物载体导入毛白杨中，获得了PtoERF15过表达转基因植株。结果显示PtoERF15-OEL8与野生型相比，PtoERF15的表达水平增长了54倍，PtoERF15-OE L3增长了167倍。在正常土壤水分条件下，PtoERF15-OE转基因杨树与WT相比，植物生长减缓。在土壤缺水的条件下，超表达植株长势明显好于野生型，地上部分生物量受干旱胁迫的影响程度也显著小于野生型。本发明的有益效果在于，PtoERF15过表达载体转化毛白杨植株后，能有效增强毛白杨的耐旱性，有利于干旱区域的营造防林，城乡绿化及经济用材种植。
附图说明
图1.毛白杨PtoERF15过表达植株的创制。A：野生型与毛白杨PtoERF15-OE转基因植株PCR分子检测,以野生型株系和PtoERF15-OE转基因株系的DNA为模板，用载体引物pCX-DG-F和ERF15-R进行PCR检测；其中M代表Marker DL5000；WT为野生型植株，L1-L11为PtoERF15过表达待鉴定植株；B：毛白杨PtoERF15过表达植株表达量分析。
图2.毛白杨PtoERF15过表达植株表型分析。其中，A：野生型和转基因毛白杨植株生长3个月后地上部分表型，标尺＝10cm；B：3月龄野生型和转基因毛白杨植株的株高统计；C：3月龄野生型和转基因毛白杨植株。单因素方差分析检测显著性差异，不同字母代表差异显著。
图3.毛白杨PtoERF15过表达植株表型抗旱表型分析。其中，A：野生型和转基因毛白杨植株在不同土壤水分条件下表型分析，标尺＝10cm；B：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下株高统计；C：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下第十节间茎直径统计；D：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下茎相对含水量统计；E野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下茎水势测定。单因素方差分析检测显著性差异，不同字母代表差异显著。
图4.毛白杨PtoERF15过表达植株表型干旱下生理指标分析。其中，A：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下叶绿素含量测定；B：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下过氧化氢含量测定；C：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下MDA含量测定；D：野生型和转基因毛白杨植株对照与干旱下脯氨酸含量测定。单因素方差分析检测显著性差异，不同字母代表差异显著。
具体实施方式
实施例1提取毛白杨总RNA和反转录合成cDNA
使用DEPC水将RNA提取所需要使用的药勺、研钵、研杵等浸泡过夜，高温高压灭菌后烘干备用。RNA提取试剂采用Axygen公司的试剂盒说明书进行操作，将所得RNA保存至-80℃冰箱备用。具体步骤如下：
(1)将取下的新鲜植物组织，迅速用锡箔纸包裹投入液氮中速冻；
(2)在去RNA酶的研钵中，用液氮将样本充分研磨成粉；
(3)将粉末转移至AG buffer中，充分震荡混匀至匀浆状，室温静置5-10min
(4)4℃冷冻离心，12000rpm/min，10min；
(5)取上清至新的1.5mL EP管中，精确估算上清体积加入0.5倍的无水乙醇，混匀；
(6)将混合液转移至spin clum提取柱中，离心12000rpm/min，1min；
(7)弃收集管中废液，在柱子中加入500μL PG buffer，离心12000rpm/min，1min；
(8)弃废液，在柱子中加入600μLWash buffer，离心12000rpm，30s；
(9)重复步骤8一次；
(10)弃废液，将空管离心12000rpm/min，1min，除尽滤膜上的液体；
(11)在膜中央加入30-50μL RElution buffer，室温静置2min，离心12000rpm/min，1min，得到总RNA；
(12)取1μL RNA样品跑琼脂糖凝胶电泳，根据28s和18s观察RNA条带完整性检测提取质量。
cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNAEraser反转录试剂盒(Takara)说明书进行，步骤如下：
基因组DNA擦除：
(1)根据RNA浓度，加入1-7μLRNA样品(总量不超过1μg)；
(2)加入2μL5X DNA消化酶buffer，1μL DNA消化酶；
(3)用去RNA酶ddH2O将总体系补齐至10μL；
(4)反应条件为42℃2min 30s。
第一链cDNA合成：
在第一步反应体系中加入4μL反转录buffer，1μLOligo dT随机引物，1μL反转录酶，4μL去RNA酶水，最终反应体系为20μL。
反应条件为37℃，15min(反转录)—85℃，5s(终止反应)—4℃，5min(降温保存)。
实施例2设计目的基因特异性引物和PCR扩增获得目的片段
本研究克隆的基因和启动子的序列参照毛白杨基因组序列。根据参考序列设计相应的引物，其中基因片段克隆以cDNA为模板，启动子片段以Genomic DNA为模板，使用PrimeSTAR高保真酶(Takara)进行PCR扩增，反应体系为：
反应条件设置为：98℃，1min 30s预变性；98℃，15s变性；56℃，20s退火；72℃，20s延伸；共35个循环；72℃，5min完全延伸；16℃，25min降温保存。产物以1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
由于PCR反应及酶切反应均含有多种组分，为了避免各组分对连接反应造成影响，降低连接效率，须对PCR产物进行胶回收纯化以获得纯净的DNA片段。目的片段胶回收用BioFlux公司的胶回收试剂盒。
实施例3构建PtoERF15-pCXDG载体和转化农杆菌GV3101
本研究使用的超表达载体(pCXDG)是一套TA克隆载体，经过XcmI酶切后产生T尾的粘性末端，胶回收后可以与带A尾的DNA片段直接进行TA连接反应。
(1)酶切反应体系如下：
反应条件设置为：37℃水浴或金属浴，4-8h。酶切后的质粒经胶回收作为载体骨架备用，保存于-20℃
(2)目的片段和载体骨架的回收纯化
由于PCR反应及酶切反应均含有多种组分，为了避免各组分对连接反应造成影响，降低连接效率，须对PCR产物和酶切产物进行胶回收纯化以获得纯净的DNA片段。目的片段和载体骨架的胶回收用BioFlux公司的胶回收试剂盒。
(3)片段与载体的TA克隆
由于目的片段使用PrimeSTAR高保真酶扩增，产物末端为平末端，为了与pCXDG载体骨架进行TA克隆，需对扩增片段使用Taq酶进行加“A”,反应体系如下：
混匀后置于PCR仪中，72℃延伸50min，产物保存于4℃备用。
将加“A”后的DNA片段与XcmI酶切后的pCXDG载体骨架进行连接，连接选用Takara公司的Solution I试剂盒，反应体系如下：
16℃连接4-8h，连接产物用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
(4)菌落PCR筛选阳性克隆
将平板上的克隆编号，用灭菌的枪头依次挑取微量菌体于PCR管中，作为扩增模板。另以基因胶回收片段和ddH2O为模板，分别设置阳性及阴性对照。
PCR体系：
反应条件设置为：98℃，1min 30s预变性；98℃，15s变性；56℃，20s退火；72℃，20s延伸；共35个循环；72℃，5min完全延伸；16℃，25min降温保存。产物以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，能够扩增出与阳性对照大小相同条带的菌落即为阳性克隆。
(5)阳性克隆质粒提取与酶切验证
将PCR检测阳性的克隆，挑取至含有卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。采用BioFlux公司的碱裂解法质粒小提试剂盒进行质粒提取.
将质粒送往公司测序。序列测定比对无误后即完成载体构建。构建成功后的pCXDG-PtoERF15重组质粒将其转入农杆菌。
转化农杆菌的操作如下：
1)取3μLpCXDG-PtoERF15重组质粒加入100μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀；
2)在冰上静置5-10min，放入液氮中速冻1min，立即放入37℃水浴5min；
3)于超净台中在感受态细胞中加入800μLYEP液体培养基，混匀后在28℃摇床以200rpm/min条件复苏培养4h；
4)复苏结束后，以3000rpm/min条件下离心10min，在超净台中，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却后的涂布棒将100μL菌液均匀涂于含有40mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃条件下倒置培养48h；
5)将工程菌命名为(GV3101)pCXDG-PtoERF15，加25％甘油经液氮速冻后，保存于-80℃冰箱，用于后续遗传转化实验。
实施例4毛白杨遗传转化
(1)农杆菌的两次活化培养
1)将(GV3101)pCXDG-PtoERF15菌种于含有40mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基划线，28℃恒温培养箱中培养36h；挑取单菌落接种于至10mL YEP+Rif+kan的双抗液体培养基；
2)28℃，200rpm/min振荡培养36-48小时，使菌液浓度达到OD600＝0.8-1.0；
3)按照1：1000的比例，吸取50μL一活液至50mL新鲜YEP+Rif+kan的双抗液体培养基中，进行二活液培养；
4)28℃，200rpm/min振荡培养12-16小时，使菌液浓度达到OD600＝0.3-0.4，待用。
(2)农杆菌侵染液制备
1)利用50mL离心管收集二活液，4000rpm/min，8min，收集菌体；
2)弃去培养基上清液，利用25mL含有AS的WPM重悬液，将农杆菌重悬，重悬液倒入无菌的玻璃瓶中；
3)重悬液置于28℃，200rpm/min振荡1-2小时，使农杆菌侵染活性增强。
(3)叶盘制备
1)在超净台中，将灭过菌的剪刀、镊子、手术刀柄用酒精灯外焰灼烧15秒，放凉备用；
2)用剪刀将健康的野生型组培苗叶片剪下5-6片，放入培养皿中。皿中加入1/3体积的无菌水，使叶片保持湿润；
3)将无菌手术刀片装入刀柄，火焰灼烧后静置冷却。用刀片将叶片均匀切割成0.5cm2的正方形叶盘。
(4)侵染
1)将叶盘用镊子夹入农杆菌重悬液中，轻轻晃动玻璃瓶使重悬液均匀包裹叶盘，侵染10min；
2)侵染结束后，用镊子小心的将叶盘夹出，放到无菌纸上，吸干叶盘上多余的侵染液；
3)把叶盘平整的贴于共培养平板上，置于暗盒中，25℃暗培养36-48h。
(5)叶盘的选择培养
1)暗培养结束后，根据载体选择合适的植物抗性，配制含抗生素的选择培养基；
2)在超净台中将叶盘转移至选择培养基上，诱导愈伤组织。期间每七天，将叶盘更换至新的培养基上，持续更换3-4周，至叶盘边缘长出白色或淡黄色的愈伤组织。整个过程于暗盒中25℃培养。
(6)愈伤组织诱导生芽
将长出愈伤组织的叶盘转移至含对应抗生素的生芽培养基上，8000Lux，25℃光照培养5-6周，每周更换一次培养基。期间愈伤组织会充分生长膨大，第5周左右，愈伤组织上会长出芽点，生长出丛生芽。
(7)丛生芽诱导生根
当丛生芽长至约3-5cm，用锋利的剪刀将芽剪下，用镊子将丛生芽插入生根培养基中，8000Lux，25℃光照培养7-10天即可获得生根幼苗。此即为候选转基因植株，等待后续鉴定阳性后方可移栽土培。
实施例5PtoERF15-pcxDG转基因植株PCR分子鉴定
(1)野生型和pCXDG-PtoERF15转基因毛白杨的DNA提取
分别选取10～15株转基因的抗性再生植株，提取毛白杨基因组DNA。方法如下：
1)准备CTAB缓冲液于65℃水浴锅预热备用；
2)取约0.5g野生型和pCXDG-PtoERF15转基因毛白杨的叶片，于液氮中磨成粉末，加入上述预热的CTAB抽提液500μL中，混匀；
3)于65℃水浴45min，中途间隔(轻柔)振荡三次混匀。
4)水浴结束后，冷却至室温，加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。4℃，12000rpm/min，离心10min；
5)吸取上清于新的无菌离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀能见白色絮状沉淀；
6)4℃，12000rpm/min，离心10min。去上清液，用500ml 75％(V/V)乙醇漂洗沉淀两次，500ml无水乙醇再漂洗一次，去液体。将沉淀于37℃旋转蒸发仪中干燥至出现半透明；
7)用25μL无菌水溶解沉淀，获得野生型和pCXDG-PtoERF15转基因毛白杨叶片DNA粗提物；
8)向DNA粗提物中加入约1ul RNase，于37℃酶解RNA 1h；
9)将DNA样品放置于-20℃冰箱保存备用。
(2)阳性植株PCR扩增
由于野生型植株不含外源转入的PCXDG载体序列，故利用载体pCX-DG-F和基因引物ERF15-R引物扩增进行阳性植株筛选。以野生型DNA模板作为阴性对照，转基因植株对应的测序正确的载体质粒为阳性对照，对转基因植株的DNA进行PCR扩增及凝胶电泳成像，以鉴定转基因阳性株系(图1中A)。发现仅在PCXDG-PtoERF15质粒DNA和L1-L9的DNA中扩增出1kb大小的目的条带。证明PtoERF15-OE L1-L9植株中成功转入了PCXDG-PtoERF15。
利用载体pCX-DG-F和基因引物ERF15-R引物扩增进行筛选。设计的特异性引物，序列如下：
pCX-DG-F：5′-AAGAGTGCCATGCCCGAAGG-3′(SEQ ID No.3)；
ERF15-R：5′-TCAATCTTGCCGCCGCTTC-3′(SEQ ID No.4)。
PCR反应体系同表2，反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
PCR反应的体系
实施例6PtoERF15-pcxDG转基因植株表达量分析
在超表达植株中鉴定基因表达量实验需要使用荧光定量PCR方法，对相应基因的表达量进行定量分析。荧光定量PCR采用特殊的含有SYBR荧光染料的DNA聚合酶，该染料能够渗入DNA双链，使得DNA的含量转换为荧光值被仪器检测到，在一定循环的PCR反应后即可根据荧光信号比值，定量计算模板中相应基因的表达水平。
具体步骤如下：
(1)定量引物设计
参考3.3.4引物设计方法，对需要检测的基因设计特异性引物，扩增长度控制在100-200bp，引物之间跨内含子可提高准确性。
(2)定量PCR体系及反应条件
PCR体系：
反应条件：
第一步，95℃预变性30s；
第二步，95℃变性5s；
第三步，60℃退火+延伸1min；
第四步，第二至第三步循环40次；
第五步，溶解曲线95℃15s，60℃30s，95℃15s。
结果如图1中B所示，与WT相比，在PtoERF15-OE L1-L9植株中除L4株系外，其余植株中PtoERF15基因的表达量显著升高。
实施例7毛白杨PtoERF15过表达植株表型分析
将一月龄组培苗移栽至花盆，于25℃长日照条件(16小时光照/8小时黑暗，光强10000lux)的温室中生长三个月。对WT、PtoERF15-OE转基因杨树的株高和茎粗进行测定和统计。
结果如图2中A所示,与WT植株相比PtoERF15-OE L8和L3植株的株高和茎粗都显著降低。
实施例8PtoERF15-pcxDG转基因植株抗旱性分析
对3月龄WT、PtoERF15-OE转基因杨树进行干旱处理实验。采用土壤水分仪(TZS-1K-G,Zhejiang Top Cloud,China)对土壤水分进行检测。通过控制土壤相对含水量(SRWC)从70％±5％降低到20％±5％，然后再浇水2d，对整体植株进行观察，对其株高直径等指标进行测量，并对植株进行拍照。在土壤含水量达到25％时，对干旱组和对照组杨树第十节间进行取材，进行细胞学切片观察、及生理指标测定。对照组的SRWC维持在70％以上。
结果发现，过表达PtoERF15基因后，毛白杨在土壤含水量仅19％的条件下，仍然生长良好，而WT已经出现顶芽和叶片枯萎的症状(图3A)。对干旱前后，WT和PtoERF15-OE植株的株高(图3中B)、直径(图3中C)测定发现，过表达PtoERF15基因后，可以减少干旱对毛白杨茎生长的抑制作用。进一步对正常浇水和干旱处理下WT和PtoERF15-OE毛白杨的茎相对含水量(图3中E)和茎水势(图3中F)测定可见，过表达PtoERF15基因后，可以降低干旱对毛白杨茎含水量和运输水分的影响。此外，也测定了正常浇水和干旱处理下WT和PtoERF15-OE毛白杨叶绿素、过氧化氢、丙二醛和脯氨酸的含量等生理指标。PtoERF15-OE叶片的叶绿素含量高于WT(图4中A)。PtoERF15-OE叶片的过氧化氢(图4中B)和脯氨酸(图4中C)含量在干旱下显著低于WT叶片，减少了干旱下活性氧造成的植物损伤。游离脯氨酸的积累可以提高细胞的渗透压以耐受脱水。与WT相比，游离脯氨酸的积累在PtoERF15-OE系中显著增加(图4中D)。
Claims (4)
1.PtoERF15基因或含有PtoERF15基因的表达载体在调控毛白杨抗旱上的应用，所述PtoERF15基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为在毛白杨中超表达PtoERF15基因，从而增强干旱胁迫抗性。
3.一种构建抗旱性增强的毛白杨株系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1中所述的PtoERF15基因连接至植物表达载体，转化农杆菌，获得PtoERF15过表达载体；
（2）采用农杆菌介导的叶盘法将步骤（1）构建的过表达载体导入野生型毛白杨叶片中；
（3）通过共培养、选择培养、获得丛生芽、获得生根转基因植株以及阳性植株鉴定过程，最终得到抗旱性增强的毛白杨株系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为pCXDG质粒。
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Also Published As
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