CN117363647A - 敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用 - Google Patents

敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用，通过将PtoMYB142敲除植物载体导入毛白杨中，获得了PtoMYB142敲除转基因植株；在敲除植株中茎木质部占比显著高于WT，木质部层数也显著增多；该结果说明缺失PtoMYB142后杨树茎形成层活性受到了促进，对杨树的开发利用具有重要意义。

Description

敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用。
背景技术
植物生长发育过程中，通过次生生长产生次生维管组织，为植物提供更强的机械支撑和物质运输能力，从而保证其正常生命活动的维持(Fischer et al.,2019)。植物的次生生长起源于维管形成层(简称形成层)。形成层细胞经过分裂分化，生成次生韧皮部和次生木质部。林木的次生木质部即为木材，是一种重要的可再生资源，对人类生产生活具有重要经济价值(Plomion,C et al.,2001)。
植物的次生生长是包括形成层的分裂，沿径向向外分化成为韧皮部细胞，向内分化成为木质部细胞，继而细胞的膨大，次生细胞壁形成，细胞的程序性死亡等阶段持续动态的过程(Plomion et al.,2001；Elo et al.,2009)。已有的研究表明，形成层可分为未分化的干细胞区和命运决定的木质部或者韧皮部前体细胞区，前体细胞位于干细胞区两侧，径向外侧为韧皮部前体细胞，内侧为木质部前体细胞。前体细胞分别分化为韧皮部细胞和木质部细胞。干细胞分化为前体细胞是不均等的，进而造成木质部持续生长(Nieminen etal.,2015；Shi et al.,2019；Chiang et al.,2019)。
大量的研究表明，R2R3类的MYB成员在植物生长发育、次生代谢、胁迫应答中起着广泛作用(Dubos C et al.2010)。大量MYB转录因子被发现调控树木茎次生发育，作为转录调控网络中的重要节点参与次生壁的转录调控，在植物的次生生长中发挥重要的调控作用(Chen H et al.,2019)。然而MYB转录因子在杨树茎维管组织的发育尤其是其在次生木质部纤维和导管发育的调控作用仍鲜有报道。近期，有研究发现，过表达杨树转录因子PtrMYB161降低了木质部导管及纤维细胞的密度和单位腔面积(Wang Z et al.,2020)，其调控机制仍不清楚。因此，MYB转录因子对植物维管组织发育的调控机制仍有待进一步的挖掘和探索。
杨树(Populus spp.)在我国的种植分布十分广泛，西到新疆，东到沿海，北起内蒙古，南到长江流域都有他的身影。到目前为止，我国已然成为世界上杨树人工林面积最大的国家。不仅如此，杨树的功能多，价值高，其木可以用到多种产品生产的过程中，比如造纸以及复合板等等的生产过程中。而且他的生长周期短，长速快，树干顺直，根系发达，抗盐碱能力强，具有非常显著的经济价值和生态价值(荆晓清，2012)。因此，进一步提高杨树产量对杨树的应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高木材产量中的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用，所述毛白杨PtoMYB142基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的，所述提高木材产量是通过提高茎木质部比例。
本发明优选的，所述提高木材产量是提高木质部层数。
本发明优选的，所述敲除毛白杨PtoMYB142基因的方法是使用CRISPR/Cas9技术。
本发明优选的，所述敲除毛白杨PtoMYB142基因是将PtoMYB142的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化毛白杨，获得PtoMYB142基因编辑突变的转基因植株，获得的转基因植株木材产量提高。
2、一种提高木材产量中的方法，将PtoMYB142的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化毛白杨，获得PtoMYB142基因编辑突变的转基因植株。
本发明优选的，所述转化毛白杨的方法是采用农杆菌介导。
本发明优选的，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
本发明的有益效果在于：本发明提供了敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用，通过将PtoMYB142敲除植物载体导入毛白杨中，获得了PtoMYB142敲除转基因植株；在敲除植株中茎木质部占比显著高于WT，木质部层数也显著增多；该结果说明缺失PtoMYB142后杨树茎形成层活性受到了促进。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为毛白杨PtoMYB240RNAi阳性植株的鉴定(A：野生型与毛白杨PtoMYB240RNAi转基因植株PCR分子检测，以野生型株系和PtoMYB240RNAi转基因株系的DNA为模板，用载体引物pCXSN-F和pCXSN-R进行PCR检测；其中M代表Marker DL2000；WT为野生型植株，L1-L11为PtoMYB240RNAi待鉴定植株；B：毛白杨PtoMYB240RNAi植株表达量分析)。
图2为毛白杨PtoMYB142敲除植株材料的长势情况(A：敲除材料与野生型长势对比；B；敲除材料与野生型株高的数值对比；C：敲除材料与野生型茎粗的数值对比)。
图3为毛白杨PtoMYB142敲除植株表型木质部分析(A：敲除材料与野生型的甲苯胺蓝染色；B：敲除材料与野生型木质部面积的对比；C：敲除材料与野生型木质部层数的对比)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、提取毛白杨总RNA和反转录合成cDNA
使用DEPC水将RNA提取所需要使用的药勺、研钵、研杵等浸泡过夜，高温高压灭菌后烘干备用。RNA提取试剂采用Axygen公司的试剂盒说明书进行操作，将所得RNA保存至-80℃冰箱备用。具体步骤如下：
(1)将取下的新鲜植物组织，迅速用锡箔纸包裹投入液氮中速冻；
(2)在去RNA酶的研钵中，用液氮将样本充分研磨成粉；
(3)将粉末转移至AG buffer中，充分震荡混匀至匀浆状，室温静置5-10min；
(4)4℃冷冻离心，12000rpm/min，10min；
(5)取上清至新的1.5mL EP管中，精确估算上清体积加入0.5倍的无水乙醇，混匀；
(6)将混合液转移至spin clum提取柱中，离心12000rpm/min，1min；
(7)弃收集管中废液，在柱子中加入500μL PG buffer，离心12000rpm/min，1min；
(8)弃废液，在柱子中加入600μL Wash buffer，离心12000rpm，30s；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)弃废液，将空管离心12000rpm/min，1min，除尽滤膜上的液体；
(11)在膜中央加入30-50μL RElution buffer，室温静置2min，离心12000rpm/min，1min，得到总RNA；
(12)取1μL RNA样品跑琼脂糖凝胶电泳，根据28s和18s观察RNA条带完整性检测提取质量。
cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser反转录试剂盒(Takara)说明书进行，步骤如下：
基因组DNA擦除：
(1)根据RNA浓度，加入1-7μL RNA样品(总量不超过1μg)；
(2)加入2μL 5×DNA消化酶buffer，1μL DNA消化酶；
(3)用去RNA酶ddH2O将总体系补齐至10μL；
(4)反应条件为42℃、2min 30s。
第一链cDNA合成：
在第一步反应体系中加入4μL反转录buffer，1μL Oligo dT随机引物，1μL反转录酶，4μL去RNA酶水，最终反应体系为20μL。
反应条件为37℃，15min反转录—85℃，5s终止反应—4℃，5min降温保存。
实施例2、植物表达载体构建
本研究使用的基因敲除载体(pYL-CRISPR/Cas9-DH)。
(1)接头制备：参考PtoMYB142基因序列(SEQ ID NO.1)，编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，利用敲除靶点设计网站，设计能特异性敲除PtoMYB142的靶点引物，并由深圳华大公司进行引物合成，具体引物序列如下：
T1-F:5’GTCAAAGATGATGCTGAGCTGAGG3’(SEQ ID NO.3)
T1-R:5’AAACCCTCAGCTCAGCATCATCTT3’(SEQ ID NO.4)
T2-F:5’ATTGAGAAACAAGCAAGGCACCTT 3’(SEQ ID NO.5)
T2-R:5’AAACAAGGTGCCTTGCTTGTTTCT 3’(SEQ ID NO.6)
T3-F:5’ATTGGAGTGTGATGATGCACTGTA 3’(SEQ ID NO.7)
T3-R:5’AAACTACAGTGCATCATCACACTC 3’(SEQ ID NO.8)
(2)将靶点引物稀释到1μM经PCR反应完成退火，反应体系如表1所示：
表1、PCR体系
(3)第一次边切边连法：利用BsaI限制性内切酶及T4 DNA连接酶，通过变温循环仪(或PCR仪)将靶点连接至含有gDNA表达盒小载体的BsaI酶切位点之间。其中T1靶点退火产物连接至pYLsgRNA-AtU3b，T2靶点退火产物连接至pYLsgRNA-AtU6-1，T3靶点退火产物连接至pYLsgRNA-AtU6-29反应体系如表2所示，反应条件为：37℃5min，20℃5min，反应5个循环。
表2、PCR体系
(4)第一轮PCR扩增：取步骤(3)中连接产物为模板，使用通用引物U-F/gRNA-R对含有PtoMYB142特异靶点的三个gDNA表达盒分别进行PCR扩增，扩增体系如表3所示。
引物U-F/gRNA-R对序列如下：
引物U-F：5’CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG3’(SEQ ID NO.9)；
引物gRNA-R：5’CGGAGGAAAATTCCATCCAC 3’(SEQ ID NO.10)；
反应程序：98℃1min 10循环，98℃预变性15s，55℃退火15s，68℃延伸10s，17-20循环：94℃预变性15s，60℃退火15s，68℃延伸10s，反应结束后取5μL电泳检查。
表3、PCR体系
(5)第二轮PCR扩增：取步骤(4)中PCR产物为模板，使用带有接头的引物进行第二轮PCR扩增，扩增体系如表4所示。反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃延伸15s，68℃后延伸30s(35个循环)；16℃保存。进一步地，对扩增获得的PCR产物进行凝胶电泳及切胶回收。分别利用引物B1’-F/B2-R以步骤(4)T1的PCR产物扩增，B2’-F/B3-R以步骤(4)T2的PCR产物扩增，B3’-F/BL-R以步骤(4)T3的PCR产物扩增.引物序列如下：
引物B1’-F:5’TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG3’(SEQ ID NO.11)
引物B2-R:5’AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC3’(SEQ ID NO.12)
引物B2’-F:5’TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG3’(SEQ ID NO.13)
引物B3-R:5’AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC3’(SEQ ID NO.14)
引物B3’-F:5’TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG3’(SEQ ID NO.15)
引物BL-R:5’AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC3’(SEQ ID NO.16)
表4、PCR体系
(6)第二次边切边连：取(5)中胶回收产物及pYL-CRISPR/Cas9-DH，利用BsaI限制性内切酶及T4 DNA连接酶，通过变温循环仪(或PCR仪)将含有PtoMYB142靶点的gDNA表达盒连接至pYL-CRISPR/Cas9-DH表达载体的BsaI位点之间。反应体系：37℃5min，20℃5min，反应25个循环。
(7)将步骤(6)中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行大肠杆菌转化流程。
(8)菌落PCR筛选阳性克隆
将平板上的克隆编号，用灭菌的枪头依次挑取微量菌体于PCR管中，作为扩增模板，扩增体系如表5所示。另以基因胶回收片段和ddH2O为模板，分别设置阳性及阴性对照。
表5、PCR体系
反应条件设置为：98℃，1min 30s预变性；98℃，15s变性；56℃，20s退火；72℃，20s延伸；共35个循环；72℃，5min完全延伸；16℃，25min降温保存。产物以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，能够扩增出与阳性对照大小相同条带的菌落即为阳性克隆。
(9)阳性克隆质粒提取与酶切验证
将PCR检测阳性的克隆，挑取至含有卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。采用BioFlux公司的碱裂解法质粒小提试剂盒进行质粒提取。
将质粒送往公司测序，序列测定比对无误后即完成载体构建，构建成功后的PtoMYB142-Cas9重组质粒将其转入农杆菌。
转化农杆菌的操作如下：
1)取3μL PtoMYB142-Cas9重组质粒加入100μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀；
2)在冰上静置5-10min，放入液氮中速冻1min，立即放入37℃水浴5min；
3)于超净台中在感受态细胞中加入800μL YEP液体培养基，混匀后在28℃摇床以200rpm/min条件复苏培养4h；
4)复苏结束后，以3000rpm/min条件下离心10min，在超净台中，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却后的涂布棒将100μL菌液均匀涂于含有40mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃条件下倒置培养48h；
5)将工程菌命名为(GV3101)PtoMYB142-Cas9，加25％甘油经液氮速冻后，保存于-80℃冰箱，用于后续遗传转化实验。
实施例3、毛白杨遗传转化
(1)农杆菌的两次活化培养
1)将工程菌(GV3101)PtoMYB142-Cas9，菌接种于含有40mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基划线，28℃恒温培养箱中培养36h；挑取单菌落接种于至10mL YEP+Rif+kan的双抗液体培养基；
2)28℃，200rpm/min振荡培养36-48小时，使菌液浓度达到OD600＝0.8-1.0；
3)按照1：1000的比例，吸取50μL一活液至50mL新鲜YEP+Rif+kan的双抗液体培养基中，进行二活液培养；
4)28℃，200rpm/min振荡培养12-16小时，使菌液浓度达到OD600＝0.3-0.4，待用。
(2)农杆菌侵染液制备
1)利用50mL离心管收集二活液，4000rpm/min，8min，收集菌体；
2)弃去培养基上清液，利用25mL含有AS的WPM重悬液，将农杆菌重悬，重悬液倒入无菌的玻璃瓶中；
3)重悬液置于28℃，200rpm/min振荡1-2小时，使农杆菌侵染活性增强。
(3)叶盘制备
1)在超净台中，将灭过菌的剪刀、镊子、手术刀柄用酒精灯外焰灼烧15秒，放凉备用；
2)用剪刀将健康的野生型组培苗叶片剪下5-6片，放入培养皿中。皿中加入1/3体积的无菌水，使叶片保持湿润；
3)将无菌手术刀片装入刀柄，火焰灼烧后静置冷却。用刀片将叶片均匀切割成0.5cm2的正方形叶盘。
(4)侵染
1)将叶盘用镊子夹入农杆菌重悬液中，轻轻晃动玻璃瓶使重悬液均匀包裹叶盘，侵染10min；
2)侵染结束后，用镊子小心的将叶盘夹出，放到无菌纸上，吸干叶盘上多余的侵染液；
3)把叶盘平整的贴于共培养平板上，置于暗盒中，25℃暗培养36-48h。
(5)叶盘的选择培养
1)暗培养结束后，根据载体选择合适的植物抗性，配制含抗生素的选择培养基；
2)在超净台中将叶盘转移至选择培养基上，诱导愈伤组织；期间每七天，将叶盘更换至新的培养基上，持续更换3-4周，至叶盘边缘长出白色或淡黄色的愈伤组织；整个过程于暗盒中25℃培养。
(6)愈伤组织诱导生芽
将长出愈伤组织的叶盘转移至含对应抗生素的生芽培养基上，8000Lux，25℃光照培养5-6周，每周更换一次培养基。期间愈伤组织会充分生长膨大，第5周左右，愈伤组织上会长出芽点，生长出丛生芽。
(7)丛生芽诱导生根
当丛生芽长至约3-5cm，用锋利的剪刀将芽剪下，用镊子将丛生芽插入生根培养基中，8000Lux，25℃光照培养7-10天即可获得生根幼苗。此即为候选转基因植株，等待后续鉴定阳性后方可移栽土培。
实施例4、PtoMYB142-Cas9转基因植株的敲除鉴定
(1)野生型和PtoMYB142-Cas9转基因毛白杨的DNA提取
分别选取10～15株转基因的抗性再生植株，提取毛白杨基因组DNA。方法如下：
1)准备CTAB缓冲液于65℃水浴锅预热备用；
2)取约0.5g野生型和PtoMYB142-Cas9转基因毛白杨的叶片，于液氮中磨成粉末，加入上述预热的CTAB抽提液500μL中，混匀；
3)于65℃水浴45min，中途间隔(轻柔)振荡三次混匀。
4)水浴结束后，冷却至室温，加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。4℃，12000rpm/min，离心10min；
5)吸取上清于新的无菌离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀能见白色絮状沉淀；
6)4℃，12000rpm/min，离心10min。去上清液，用500ml 75％(V/V)乙醇漂洗沉淀两次，500ml无水乙醇再漂洗一次，去液体。将沉淀于37℃旋转蒸发仪中干燥至出现半透明；
7)用25μL无菌水溶解沉淀，获得野生型和pYL-PtoMYB142转基因毛白杨叶片DNA粗提物；
8)向DNA粗提物中加入约1μl RNase，于37℃酶解RNA 1h；
9)将DNA样品放置于-20℃冰箱保存备用。
(2)阳性植株PCR扩增及敲除鉴定
测序鉴定敲除结果，结果如图1中B所示。结果显示，L6在第二个靶点处插入C碱基，L9在第一个靶点有19个碱基的缺失，在第二个靶点处缺失C碱基，在第三个靶点插入T碱基。
对转基因型植株进行鉴定，通过将PtoMYB142敲除植物载体导入毛白杨中，获得了2种PtoMYB142阳性敲除转基因植株(图1，A)。利用PtoMYB142特异性扩增引物，以WT和L6、L9的DNA为模板进行扩增，并将扩增获得的片段连接至pMD19载体后进行测序。证明PtoMYB142-Cas9转基因植株的L6、L9株系中，PtoMYB142基因发生了敲除。
利用载体PtoMYB142-F和基因引物PtoMYB142-R引物扩增进行筛选。设计的特异性引物，序列如下：
PtoMYB142-F：5′-CGGGATCCATGAGAGTGGATATCATGTC-3′(SEQ ID NO.17)；
PtoMYB142-R：5′-CGGGATCCGGCTAATACTGGTAAGTTTGTC-3′(SEQ ID NO.18)。
PCR反应体系同表6，反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
表6、PCR反应的体系
实施例5、毛白杨PtoMYB142敲除植株表型分析
将四月龄组培苗移栽至花盆，于25℃长日照条件(16小时光照/8小时黑暗，光强10000lux)的温室中生长三个月(图2，A)。对WT、PtoMYB142-Cas9转基因杨树的株高和茎粗进行测定和统计。
结果如图2中B所示，与WT植株相比PtoMYB142-Cas9 L6和L9植株的株高和茎粗都显著升高。
实施例6、PtoMYB142敲除转基因植株茎次生发育表型分析
本研究又进行了对毛白杨PtoMYB142敲除植株及野生型进行了茎横切片及染色观察，结果如图3所示。通过茎组织切片的甲苯胺蓝染色观察发现，在敲除植株中茎木质部占比显著高于WT，木质部层数也显著增多，促进了毛白杨茎次生发育，增强其木材产量。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.敲除毛白杨PtoMYB142基因在提高木材产量中的应用，其特征在于：所述毛白杨PtoMYB142基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高木材产量是通过提高茎木质部比例。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高木材产量是提高木质部层数。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除毛白杨PtoMYB142基因的方法是使用CRISPR/Cas9技术。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除毛白杨PtoMYB142基因是将PtoMYB142的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化毛白杨，获得PtoMYB142基因编辑突变的转基因植株，获得的转基因植株木材产量提高。
6.一种提高木材产量中的方法，其特征在于：将PtoMYB142的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化毛白杨，获得PtoMYB142基因编辑突变的转基因植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述转化毛白杨的方法是采用农杆菌介导。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述农杆菌为农杆菌GV3101。
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