CN117286160A - 一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用。一种天山雪莲光合基因片段，所述的天山雪莲光合基因片段为sikFBA4所示。本发明还公开了一种天山雪莲光合基因的表达载体、蛋白质、或细胞系、或宿主菌，以及其在植物育种中的应用。本发明所述的一种天山雪莲光合基因片段，提供了天山雪莲果糖1,6‑二磷酸醛缩酶基因sikFBA4，其编码产物sikFBA4蛋白，以及通过构建植物表达载体获得sikFBA4转基因植物，将该基因进行过表达后可显著提高转基因植物的光合效率和生物量，对于增加植物光合效率，提高植物产量具有十分重要的应用价值。

Description

一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用。

背景技术

在植物的生长过程中，光合作用是作物产量形成的基础。在光合作用过程中，植物不仅能将无机碳同化为有机碳，还会将太阳能转化为化学能储存在所合成的有机物当中。除了为植物本身的生长发育提供能量外，植物的光合作用还是所用异养型生物能量的来源。此外，光合作用过程中所释放的氧气还为动物的有氧呼吸提供了条件，对维持大气中的碳氧比有重要的作用。因此提高植物的光合作用效率对于维持生物圈中大气碳/氧的循环，缓解环境的变化、解决粮食产量不足以及资源短缺等问题有着重要的意义。

但是在自然条件下，植物通常仅能将2％～4％的太阳能转化为供给植物生长的能量，转化效率低下，而且植物的最大光合效率与实际光合效率之间也存在着很大的差距。因此，提升植物的光合效率、提高作物产量将会对自然环境的调节以及人类社会的进步有着十分重要的现实意义。

植物的光合作用由光反应阶段和暗反应阶段两部分构成。其中，卡尔文循环是暗反应过程中的重要组成部分，由一系列的酶促反应构成。现代分子生物学和转基因实验结果表明，卡尔文循环对于调控植物的光合效率和碳代谢等过程起着十分关键的作用。在卡尔文循环中，果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBAase)能够可逆的催化甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸二羟丙酮丙酮(DHAP)合成果糖-1,6-二磷酸(FBP)反应，是植物卡尔文循环和糖质新生代谢过程中必不可少的关键调控酶。

作为新疆的特色植物，新疆天山雪莲属菊科风毛菊属，为多年生一次性开花结实的高山冰缘草本植物，生活在高山悬崖峭壁的雪线附近，具有极强的耐寒和抗缺氧能力，能够在极其严酷的环境条件下进行高效率的光合作用。因此天山雪莲可作为一种优秀光合基因资源库，为植物基因工程改造提升植物光合效率提供优秀的基因资源。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种天山雪莲光合基因片段，对基因工程育种具有价值。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种天山雪莲光合基因片段，所述的天山雪莲光合基因片段为sikFBA4所示。

本发明的第二个目的在于提供一种天山雪莲光合基因的表达载体，所述的表达载体有上述的天山雪莲光合基因片段。

进一步的，所述的表达载体为重组质粒pCAMBIA2300-sikFBA4，在植物中进行表达，提高转基因植物的光合效率。

本发明的第三个目的在于提供一种蛋白质，所述的蛋白质由上述的天山雪莲光合基因片段编码而成。

本发明的第四个目的在于提供一种细胞系，有上述的天山雪莲光合基因片段。

本发明的第五个目的在于提供一种宿主菌，有上述的天山雪莲光合基因片段。

本发明的第六个目的在于提供上述的天山雪莲光合基因片段、或上述的表达载体、或上述的蛋白质、或上述的细胞系、或上述的宿主菌在植物育种中的应用。

进一步的，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

进一步的，所述的应用为提高植物的光合效率。

再进一步的，所述的应用为：将上述的天山雪莲光合基因片段倒入目的植物中，以得到光合效率高于野生型目的植物的转基因植物；

或提高植物中上述的蛋白质含量或活性，从而提高转基因植物在低温胁迫条件下的光合效率。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次发现并克隆了来源于新疆天山雪莲的果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因sikFBA4，将其构建到植物表达载体上并在烟草中进行过表达后，可以显著提高转基因烟草在低温下的光合效率。这对于揭示新疆天山雪莲的抗寒机理以及植物抗寒育种有着重要的意义。

附图说明

图1为天山雪莲sikFBA4基因PCR扩增图及表达载体酶切鉴定图；图1,A:天山雪莲基因克隆电泳图，B:sikFBA4-2300-OCS表达载体酶切鉴定图；

图2转基因烟草分子鉴定图；图2-A转基因烟草DNA的PCR鉴定，B转基因烟草的RT-PCR鉴定；

图3为转基因烟草与野生型烟草之间光合指数的比较；图3-A转基因烟草与野生型烟草净光合速率的比较(Pn，μmol m-2s-1)，B转基因烟草与野生型烟草最大光量子产量的比较；

图4为转基因烟草与野生型烟草之间光合相关酶活力的比较；图4-A转基因烟草与野生型烟草叶片FBA酶活力比较，B转基因烟草与野生型叶片烟草FBP酶活力比较，C转基因烟草与野生型烟草叶片GAPDH酶活力比较；

图5为转基因烟草与野生型烟草之间叶片可溶性糖和淀粉含量的比较；图5-A转基因烟草与野生型烟草叶片可溶性含量比较，B转基因烟草与野生型烟草叶片中淀粉含量比较；

图6为转基因烟草与野生型烟草之间生物量相关指标的比较；图6-A转基因烟草与野生型烟草株高的比较，B转基因烟草与野生型烟草茎粗的比较，C转基因烟草与野生型烟草种子产量的比较；

图7为转基因烟草与野生型烟草之间株型的比较。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体的实施例，对本发明一种天山雪莲光合基因片段、表达载体及应用做进一步的详细介绍：

本发明从天山雪莲的转录组数据库中共筛选出7个叶绿体定位的果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因，其中一个转录本在经过冷胁迫后表达水平显著上升，将其命名为sikFBA4。为研究sikFBA4基因的功能，构建了该基因的植物表达载体，并将其导入烟草中，结果提高了转基因烟草光合作用的效率。

本发明的目的之一是为基因工程育种提供有价值的FBA基因sikFBA4；发明目的还在于构建植物过表达载体：pCAMBIA2300-sikFBA4，并转入植物中进行表达，提高转基因植物的光合效率，并最终获得光合效率增加的转基因植物。本发明的技术方案为：

一种天山雪莲光合基因片段，所述的天山雪莲光合基因片段为sikFBA4所示。

上述的技术方案中，天山雪莲光合基因片段为1,6-二磷酸醛缩酶基因sikFBA4，为：(a)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；(b)与(a)的核苷酸序列具有85％以上同源性且编码植物光合相关蛋白的DNA分子。

一种天山雪莲光合基因的表达载体，是光合相关基因sikFBA4的植物表达载体，所述的表达载体有上述的天山雪莲光合基因片段。

优选的，所述的表达载体为重组质粒pCAMBIA2300-sikFBA4，在植物中进行表达，提高转基因植物的光合效率。

上述的技术方案中，重组表达载体可具体为重组质粒pCAMBIA2300-sikFBA4，该重组质粒是将pCAMBIA2300-35s-OCS载体中序列3所示序列取代为序列1所示DNA分子得到的重组质粒。

携带有sikFBA4基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。

一种蛋白质，所述的蛋白质由上述的天山雪莲光合基因片段编码而成。

上述的技术方案中，由上述天山雪莲光合基因片段所编码的蛋白质，来源于新疆天山雪莲，命名为sikFBA4蛋白，为(1)由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列2的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸的取代、缺失或者添加而得到的与植物光合相关的由序列2所衍生的蛋白质。

上述(b)中蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质编码基因可通过将序列2所示DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，或/和进行一个或几个碱基对的错义突变后得倒。

该蛋白质的应用为：(I)调控植物的光合作用；(II)增强植物的光合效率。

一种细胞系，有上述的天山雪莲光合基因片段，为光合相关基因sikFBA4的细胞系。

一种宿主菌，有上述的天山雪莲光合基因片段，为光合相关基因sikFBA4的宿主菌。

上述的天山雪莲光合基因片段、或上述的表达载体、或上述的蛋白质、或上述的细胞系、或上述的宿主菌在植物育种中的应用。

上述的技术方案中，本发明保护sikFBA4蛋白、sikFBA4基因、以及上述任一的重组表达载体或上述任一所述方法在植物育种中的应用。植物育种的目的为培育抗寒植物。

优选的，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

优选的，所述的应用为提高植物的光合效率。

进一步优选的，所述的应用为：将上述的天山雪莲光合基因片段倒入目的植物中，以得到光合效率高于野生型目的植物的转基因植物；

或提高植物中上述的蛋白质含量或活性，从而提高转基因植物在低温胁迫条件下的光合效率。

实施例1：天山雪莲sikFBA4基因的克隆

具体操作步骤如下：

A天山雪莲总mRNA的提取

1)将实验所需研钵、枪头、离心管使用0.1％的DEPC水浸泡后进行高压灭菌；

2)取天山雪莲幼嫩叶片约0.1g于研钵中，加入液氮后充分研磨至粉末状；

3)将研磨的叶片粉末转移至1.5mL离心管中，加入1mL的Trizol提取试剂，进行漩涡震荡后，室温下静止5min；

4)在4℃，10000rpm条件下离心5min，将上清转移至新的离心管中，加入200μL氯仿并剧烈震荡混匀；

5)在4℃，10000rpm条件下离心5min，将上清转移至新的离心管后，加入600μL预冷的异丙醇，于-20℃沉淀30min；

6)在4℃，10000rpm条件下离心10min，弃上清，管底白色沉淀即为所提总mRNA；

7)使用70％的乙醇将沉淀漂洗两次后，吸干离心管中液体，并加入适量的DEPC处理过的水对沉淀进行溶解，所得溶液置于-80℃备用。

B cDNA第一链的合成

1)向DEPC水处理过的离心管中按顺序加入无核酸酶的超纯水5μL，OligodT 1μL，提取的总mRNA 6μL，将混合液顺离后，于65℃孵育5min，冰上冷却；

2)将混合液顺离后，按顺序加入5×ReactionBuffer4μL，RibilockRNA酶抑制剂1μL，10mM的dNTPMix 2μL，RevertAidM-Mulv逆转录酶1μL，用移液枪将混合液轻轻混匀后进行顺离，并置于42℃孵育60min；

3)将混合液转移到72℃中加热5min终止反应；

4)将产物置于-80℃备用。

C cDNA第二链的合成

1)以天山雪莲cDNA为模版，使用P1和P2为引物进行扩增，以得到目的基因；同时以去离子水作为阴性对照。

P1为：5′-GGTACCATGGCCTCAACATTTCTCTTC-3′；

P2为：5′-TCTAGACTTAGTAGACATAGCCCTTAACG-3′

2)PCR反应体系(20μL)为：PCRMix 10μL，去离子水8μL，模版cDNA1μL，上游引物P10.5μL，下游引物P20.5μL；

3)PCR反应程序为95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸70s，30个循环；72℃，7min；

4)PCR反应结束后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切下符合大小的目的条带，如附图1中A图所示，说明成功克隆出天山雪莲sikFBA4基因片段，对该基因片段进行回收并连接pMD19-T载体转化大肠杆菌DH5α，经测序成功后，将其命名为pMD19-T-sikFBA4。

实施例2：pCAMBIA-2300-sikFBA4植物表达载体的构建

1)分别使用KpnI和XbaI酶切pMD19-T-sikFBA4和pCAMBIA-2300-OCS载体，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段；

2)利用T4连接酶将目的片段于载体大片段进行连接并转化大肠杆菌DH5α；如附图1B的表达酶切鉴图所示，说明已成功构建植物表达载体。

3)将菌落PCR鉴定为阳性的菌落扩繁并提取质粒后进行测序，将测序成功的质粒命名为pCAMBIA-2300-sikFBA4质粒。

根据本发明的这一实施方案，构建植物表达载体所使用的除pCAMBIA-2300-OCS载体之外，还可选用其它植物表达载体。

实施例3:根瘤农杆菌GV3101的转化

①农杆菌感受态的制备

1)取-80℃保存的甘油菌活化后在平板上划线，待有菌落长出后挑取单菌落于LB液体培养基(5mL)+Rif(50μg/mL)+Gen(50μg/mL)中，28℃、220rpm振荡培养48h；

2)取500μl菌液于50mL含有Rif(50μg/mL)和Gen(50μg/mL)的LB液体培养基中，28℃、220rpm条件下培养至OD600为0.6～0.8后冰浴30min；

3)将菌液分装之离心管中，4℃用、5000rpm离心10min，弃上清，收集农杆菌细胞；

4)将上一步所得沉淀用750μl预冷的0.05mol/LCacl₂进行重悬，之后4℃，5000rpm离心10min；

5)弃上清，用含有10％甘油的0.05mol/L的Cacl₂重悬菌体，经液氮速冻后，于-80℃保存。

②植物表达载体转化根瘤农杆菌

1)吸取5μl鉴定成功的pCAMBIA-2300-sikFBA4重组载体质粒，加入到75μl的农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，然后液氮速冻5min；

2)将速冻的菌液置于37℃水浴5min后，冰浴2min；

3)向离心管中加入600μl的LB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养3h；

4)使用移液枪吸取200μl菌液涂布于含有Kan(50μg/mL)、Rif(50μg/mL)和Gen(50μg/mL)的LB固体平板培养基上，28℃培养48h；

5)挑取单菌落于加有相应抗生素的液体LB培养基中，通过菌液PCR筛选阳性克隆，将筛选出的阳性克隆命名为pCAMBIA-2300-sikFBA4-GV3101。

在本发明中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。该方法为植物基因工程的常规操作，并非本发明的关键。

实施例4:烟草的遗传转化及再生

本发明中所使用的对于靶植物的转化方法并非关键所在，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA转入待转化的植物组织细胞。这些方法包括但不限于农杆菌侵染法、微粒轰击法、显微注射法、共沉淀法等方法。

本发明中所使用的转化方法，可以使用以用于转化其它靶植物。最好使被转化的序列稳定整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代过程中不被丢失。此外，用于转化靶植物的核酸序列可以以线性化、环状、或其它重组载体的形式存在。

A农杆菌侵染液准备

1)从-80℃冰箱中取出pCAMBIA-2300-sikFBA4-GV3101根瘤农杆菌，接种于5mL的加有Kan(50μg/mL)、Rif(50μg/mL)和Gen(50μg/mL)的LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养24h；

2)吸取500μl菌液，加入到含有Kan(50μg/mL)、Rif(50μg/mL)和Gen(50μg/mL)的LB液体培养基中，8℃、220rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；

3)将菌液5000rpm离心10min，收集到的菌体使用50mL液体MS培养基进行重悬，所得重悬液即为转化用侵染液。

B烟草的侵染

1)在超净工作台中将烟草无菌苗剪成1cm²大小的方块，放入到加有空白固体MS培养基的培养皿中，暗培养2d；

2)将暗培养后的叶片放入侵染液中，振荡侵染10min；

3)取出叶片，使用无菌的滤纸吸干叶盘上附着的菌液；

4)在培养基上覆一张无菌滤纸后，将上一步叶片转移到滤纸上，于26℃黑暗条件下共培养2-3d；

C抗性愈伤组织筛选及出芽诱导

将共培养过的烟草叶盘转移至加有2mg/L6-BA+0.3mg/LIAA+50mg/LKan+500mg/LCb的MS固体诱导选择培养基上，使叶盘伤口充分接触培养基。每15d左右进行一次转接，转接1-2次后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至长出丛生芽。

D转化植株的生根培养和移栽

待丛生芽长至2-3cm时，将其切下转移至加有固体MS+0.3mg/LIAA+50ng/LKan+500mg/LCb的锥形瓶中，进行生根培养。

在生根选择培养基中培养15d左右时，开始有根生成，此时揭去锥形瓶封口膜，在室温条件下培养7d左右，然后洗去幼苗根部培养基，将其移栽至基质(蛭石：腐殖土＝2:1)中，26℃、16h光照、70％相对湿度进行培养，前2-3d需遮光、保湿。

实施例5:转基因烟草的分子检测

(1)转基因烟草的PCR检测

1)取新鲜的烟草叶片0.1g，在研钵中加入液氮进行充分研磨；

2)将研磨所得粉末转移到离心管中，并加入400μL提起缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min；

3)洗去300μL上清于新的离心管中，加入300μL的异丙醇，室温下静置20min，12000rpm离心10min，收集沉淀；

4)将沉淀充分风干后，加入400μL的TE溶解沉淀，之后加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀后静置20min，12000rpm离心10min；

5)吸取上清至新的离心管中，加入40μL的NaAC(3M、pH5.2)，800μL的无水乙醇，-20℃条件下沉淀过夜；

6)4℃下12000rpm离心15min，弃上清。将所得沉淀有70％乙醇洗涤两次，待乙醇彻底挥发后，使用超纯水溶解沉淀，所得溶液即为转基因烟草基因组DNA；

7)以提取的转基因烟草基因组DNA为模版，以P1和P2为引物进行PCR扩增，同时以空白烟草基因组DNA为模版作为阴性对照，扩增体系以及反应程序如实施例2；PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，如附图2A所示，说明天山雪莲sikFBA4基因已成功转入烟草基因组DNA中。

(2)转基因烟草的RT-PCR检测

1)转基因烟草总mRNA的提取以及cDNA第一链的合成方法如实施例1。

2)以上一步所得cDNA为模版，在离心管中加入PCRMix 10μL，去离子水8μL，模版cDNA1μL，上游引物P10.5μL，下游引物P20.5μL进行PCR反应，反应条件同实施例1。

3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如附图2B所示，进一步表明，天山雪莲sikFBAA4基因成功转入至烟草基因组DNA中。

实施例6:转基因烟草生理指标的测定

选取野生型和转基因烟草各3个株系，移栽至18cm深，25cm宽的花盆中，于25℃，16h光照的培养箱内进行培养。培养65-70d，分别记录各阶段烟草的表型变化并进行生理指标的测定。

使用便携式荧光仪Mini-Pam对PSII光化学最大量子效率Fv/Fm进行测定；使用GFS-3000光合仪对转基因烟草的光合作用速率进行测定。结果如图3所示，附图3A表明转基因烟草的净光合速率Pn显著高于野生型烟草WT(非转基因烟草)；附图3B表明转基因烟草的最大光量子产量Fv/Fm也高于WT，附图3表明，转基因烟草的光合指数显著优于WT。

采用分光光度计对叶片中光合相关酶活性以及淀粉和可溶性糖含量进行测定。结果如附图4和附图5所示，附图4说明转基因烟草的光合相关酶(FBA酶活、FBP酶活、GAPDH酶)的酶活性均显著优于WT，进一步说明转基因烟草的光合效率高于WT。附图5说明转基因烟草的可溶性糖含量以及光合作用产物淀粉的积累均显著优于WT，进一步说明天山雪莲sikFBA4基因在烟草中的表达，显著的增加了转基因烟草植株光合作物产物的积累。

实施例7:转基因烟草农艺性状的测定

选取野生型烟草和转基因烟草各3个株系，对其生物量相关指标进行测定：分别测定其株高、茎粗、和种子重量；数据均为每株植株测定三次后取平均值。

结果如附图6所示，转基因烟草植株的株高、茎粗和种子产量均显著高于WT；附图7为转基因烟草和WT烟草形态特征之间的比较，以上数据均说明，转天山雪莲sikFBA4基因烟草显著增强了光合作用效率。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种天山雪莲光合基因片段，其特征在于，所述的天山雪莲光合基因片段为sikFBA4所示。

2.一种天山雪莲光合基因的表达载体，其特征在于，所述的表达载体有权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，

所述的表达载体为重组质粒pCAMBIA2300-sikFBA4，在植物中进行表达，提高转基因植物的光合效率。

4.一种蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质由权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段编码而成。

5.一种细胞系，其特征在于，所述的细胞系有权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段。

6.一种宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌有权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段。

7.权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段、或权利要求2-3所述的表达载体、或权利要求4所述的蛋白质、或权利要求5所述的细胞系、或权利要求6所述的宿主菌在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，

所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，

所述的应用为提高植物的光合效率。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，

所述的应用为：将权利要求1所述的天山雪莲光合基因片段导入目的植物中，以得到光合效率高于野生型目的植物的转基因植物；

或提高植物中权利要求4所述的蛋白质含量或活性，从而提高转基因植物在低温胁迫条件下的光合效率。