CN113265406A

CN113265406A - 大豆fdl12基因编辑位点及其应用

Info

Publication number: CN113265406A
Application number: CN202110507021.2A
Authority: CN
Inventors: 孔凡江; 岳琳; 陈林楠
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2021-08-17

Abstract

本发明公开了一种大豆FDL12基因编辑位点及其应用。大豆FDL12基因编辑位点，其序列为：5’‑ATTGTTGACACAAATCCCCCTGG‑3’，位于12号染色体FDL12编码区1号外显子上27‑49处。该编辑位点能被sgRNA介导的Cas9核酸内切酶靶向识别并实现基因组DNA的双链断裂，诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的插入，造成目标靶点的突变。本发明为构建FDL12基因内源性敲除的转基因大豆提供新途径，也为培育出成花转变较晚的大豆品种提供了策略与材料。

Description

大豆FDL12基因编辑位点及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆FDL12基因编辑位点及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术是近几年开发的一种准确、快速、高效率的基因组编辑技术。在该系统中，人工设计的靶点序列在细胞中转录为具有向导性的gRNA，在gRNA的向导下，核酸内切酶Cas9识别靶基因并进行切割，导致双链DNA断裂，从而使细胞启动自我修复机制，修复时可能会引起碱基插入、缺失突变或替换突变，因而破坏靶基因的功能。2017年，Cai等用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体，对调控大豆开花的关键基因GmFT2a进行编辑，成功创制靶基因功能完全丧失的突变体，表明CRISPR/Cas9系统适用于编辑大豆基因。

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是我国重要的经济作物，对保障国民生计具有重要的意义。营养生长向生殖生长的转变是植物生殖成功的重要环节，也是大豆产量形成的关键因素。大豆关键的成花素蛋白(FT2a、FT5a)属于PEBP家族，他们均与bZIP家族转录因子FDL12相互作用促进成花转变(Takeshima et al.,2019)。FDL12基因编码区均含有9个内含子和10个外显子，FDL12基因的多态会影响大豆成花转变的时间。随着CRISPR/Cas9技术的不断改进，使得对大豆FDL12基因进行编辑变得更为简单快捷，该技术的应用范围为对大豆FDL12基因进行完全性基因敲除，可培育出成花转变较晚的大豆品种，从而提高大豆产量。目前，还没有高效的FDL12基因编辑位点见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大豆FDL12基因编辑位点。

本发明的另一目的在于提供上述大豆FDL12基因编辑位点的应用。

本发明的再一目的在于提供一种培育FDL12突变体成花转变改良大豆品种的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆FDL12基因编辑位点，为一段23bp的DNA序列，序列为：5’-ATTGTTGACACAAATCCCCCTGG-3’(SEQ ID NO.1)；该位点在大豆基因组的准确定位是12号染色体FDL12编码区1号外显子上的27-49处(图1)。

所述大豆FDL12基因编辑位点3’端含有TGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或插入，造成目标靶点附近的突变。

含有上述大豆FDL12基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9。

所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。

所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆FDL12基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，得到的sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到。

所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。

上述大豆FDL12基因编辑位点在改变大豆的成花转变时间中的应用。

一种培育FDL12突变体成花转变改良大豆品种的方法，具体包括以下步骤：

(1)按照如SEQ ID NO.1所示大豆FDL12基因编辑位点的序列合成sgRNA；

(2)在sgRNA的5’端添加碱基gtca，获得如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基aaac，获得如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；将SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3退火，形成双链DNA；

(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA与sgRNA载体连接；

(4)将表达载体与步骤(3)中所述sgRNA表达盒连接，得到Cas9 sgRNA重组表达载体(图2)；

(5)将步骤(4)中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；

(6)除草剂筛选，得到转基因植株。

步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。

步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9。

步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切。

步骤(5)所述发根农杆菌优选为K599。

步骤(6)所述筛选为采用除草剂Basta筛选转基因系。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的FDL12基因的编辑位点位于大豆FDL12基因的1号外显子区，可以在核酸内切酶Cas9的介导下以较高效率地进行双链断裂，从而定点敲除大豆基因，从而获得FDL12不同的等位基因突变体。本发明为构建FDL12基因敲除的大豆株系提供了新策略，对促进内源基因敲除技术在转基因大豆研究和生产中的应用具有十分重要的作用。

附图说明

图1为编辑位点在大豆基因组上的位置示意图。

图2为插入有编辑位点T1的Cas9 sgRNA表达载体示意图，其中，Cas9sgRNA表达载体以pYLCRISPR/Cas9载体为骨架，带有除草剂基因(Bar)、Cas9基因、AtU3d启动子、靶点T1和sgRNA的一个表达载体。

图3为敲除载体构建过程中的电泳图；其中，A为sgRNA表达盒扩增的第一轮PCR产物的电泳图，B为sgRNA表达盒扩增的第二轮PCR产物的电泳图，C为大肠杆菌DH5α的菌落PCR产物电泳图；M为2kb DNA ladder。

图4为转基因毛状根检测靶点的编辑效果图；其中，A为农杆菌K599菌落PCR产物的电泳图，B为靶点检测引物扩增转基因毛状根的产物电泳图，C为靶点的编辑测序结果，D为靶点的编辑效率统计；M为2kb ladder DNA marker。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

除非特别指出或是单独定义，本申请中所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。

实施例1、插入有FDL12基因编辑靶位点T1的Cas9 sgRNA表达载体pYLCRISPR/Cas9-FDL12-T1的构建

(1)主要试剂和来源

大肠杆菌E.coli DH5α购自全式金公司；sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d、pYLCRISPR/Cas9载体均由本实验室保存(sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d和表达载体pYLCRISPR/Cas9已在文献“A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency MultiplexGenome Editing in Monocot and Dicot Plants”中公开)；无内毒素质粒提取试剂盒购于康为世纪公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于全式金公司；KOD Plus Neo酶、Master Taqmix、限制性内切酶Bsa I、T4 DNA连接酶、CutSmart Buffer、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Kan，50μg/mL)、DNA marker均购于TaKaRa公司；测序和引物合成委托广州天一辉远基因科技有限公司完成。引物以干粉形式分装、运输、保存。引物用灭菌后的ddH₂O稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

靶点引物：

F:5’-GTCAATTGTTGACACAAATCCCCC-3’(SEQ ID NO.2)；

R:5’-AAACGGGGGATTTGTGTCAACAAT-3’(SEQ ID NO.3)。

接头引物：

U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO.4)；

gRNA-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.5)。

B1’:5’-TTCAGAGGTCTCTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.6)；

BL:5’-AGCGTGGGTCTCGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)。

测序引物：

SP1:5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACC-3’(SEQ ID NO.8)；

SP3:5’-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3’(SEQ ID NO.9)。

(2)操作步骤

1、双链DNA与sgRNA表达盒的连接与扩增

第一步，双链DNA的扩增。将靶点正向引物和靶点反向引物加入0.5×TE中混合成100μmol/L，分别取正、反向引物1μL加入PCR管中，补加98μL ddH₂O至100μL，PCR程序设置为90℃30s，室温冷却退火，得到双链DNA。

第二步，将双链DNA与sgRNA表达盒酶切连接。10μL酶切连接反应体系：2μL 10ng/μL的sgRNA载体，0.5μL 100μmol/L双链DNA，0.5μL BsaⅠ(10U/μL)，0.2μL T4 DNA ligase，1μL 10×NEB T4 DNA ligase buffer，1μL 10×NEB Cut Smart Buffer，4.8μL ddH₂O。PCR程序设置为：5个循环：37℃5min，20℃5min。

第三步，2轮PCR。

第一轮PCR，扩增sgRNA表达盒。15μL PCR反应体系：2μL第二步的PCR产物，0.3μL高保真酶KOD Plus Neo，1.5μL KOD Plus Neo Buffer，0.6μL MgSO₄，1.5μL dNTPs，10μmol/L U-F 0.2μL，10μmol/L gRNA-R 0.2μL，ddH₂O补足到15μL。PCR程序设置为：95℃2min；10个循环：95℃15s，55℃15s，68℃10s；20个循环：95℃15s，60℃15s，68℃10s，16℃保温。取4μL PCR产物加入到无菌离心管中，再补加3μL无菌水、3μL 1×loading buffer，配置1％琼脂糖凝胶进行电泳，查看凝胶电泳图像是否出现500bp左右的目的条带(图3A)。

第二轮PCR，将带有靶点的sgRNA(即第一轮PCR产物)与特异性接头进行连接，构建包含启动子、靶点和sgRNA的完整的表达盒。取第一轮PCR产物2μL加入到8μL的ddH₂O中混合稀释10倍，再取1μL作为第二轮PCR的模板。sgRNA表达盒选用20μL的反应体系：KOD PlusNeo Buffer 2μL，dNTPs Mix 2μL，KOD Plus Neo 0.4μL，B1’引物0.15μL，BL引物0.15μL，第一轮PCR产物稀释液1μL，无菌水补足到20μL。PCR反应程序设置为：95℃2min，28个循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s，16℃保温。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪查看是否有500bp的条带(图3B)。按照凝胶回收试剂盒上的步骤进行胶回收，并用DNA浓度检测仪检测回收DNA片段的浓度。

2、sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体连接，得到pYLCRISPR/Cas9-FDL12-T1。

边切边连法15μL反应体系：Cut Smart Buffer 1.5μL，pYLCRISPR/Cas9质粒0.5μL，BsaI 1μL，加入上一步纯化产物(保证其浓度为60～70ng/μL)，加ddH₂O补足到15μL。37℃反应10min，然后加入1.5μL T4 DNA ligase buffer和0.1μL T4DNA ligase，PCR程序设置为：37℃5min，10℃5min，20℃5min，37℃5min，15cycles。

3、转化大肠杆菌感受态细胞

大肠杆菌感受态细胞DH5α放在冰上解冻后加入10μL上一步的连接反应液，轻轻弹动混合均匀。冰浴30min后，在放入42℃水浴锅中热激30s后立刻冰浴2min。在超净工作台中加500μL不含抗生素的LB培养液，37℃220rpm振荡培育1小时，6000rpm离心1min后，倒掉部分上清液，重悬菌液涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱培养12小时。

4、大肠杆菌阳性克隆的筛选

在超净工作台用无菌牙签挑取单克隆，用pYLCRISPR/Cas9载体检测引物SP1/SP3进行菌落PCR。用灭菌牙签挑取单克隆作为模板，加入到如下10μL反应体系中：5μL MasterTaq mix，引物SP1和SP3各0.2μL，4.6μL无菌水。设置PCR程序为：95℃2min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃90s；72℃2min。菌落PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，查看是否出现500bp左右的目的条带(图3C)。挑选若干个含有目的条带的阳性克隆送到天一辉远公司测序，检测靶点是否连接在载体上，最后将测序正确的阳性克隆进行质粒提取。

实施例2农杆菌介导大豆遗传转化

(1)主要试剂与材料来源

大豆品种为栽培大豆(Glycine max L.Merrill)Willams82。发根农杆菌K599(Agrobacteriumrhizogenes)感受态细胞购自全式金公司。质粒提取试剂盒购自全式金公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8；发根培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，2％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂Basta，pH＝5.8。卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Kan，50μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)、DNA maker均购于TaKaRa公司，酵母提取物、琼脂糖、MES、DMSO、氯化钠及其他常用试剂为国产分析纯。

(2)操作步骤

1、pYLCRISPR/Cas9-FDL12-T1载体转化农杆菌K599感受态细胞

取50μL农杆菌感受态细胞中加入0.1μg实施例1提取的阳性质粒，轻轻弹动混合均匀并放置在冰上30min，然后在液氮中冷冻1min，再用37℃水浴热激5min后，把它放在冰上冷却2min。在超净工作台中加入500μL LB培养基，28℃220rpm摇床培养2h。12000rpm离心1min后将农杆菌涂在含有卡那霉素、利福平、壮观霉素的LB固体培养基上，28℃培养两天。在超净工作台用无菌牙签挑取单克隆摇菌，进行菌落PCR检测，10μL反应体系：5μL MasterTaq mix，引物SP1和SP3各0.2μL，3.6μL无菌水，1μL菌液。PCR程序设置为：95℃2min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃90s；72℃2min；最后16℃保温。用1％琼脂糖凝胶电泳检查是否有500bp左右的目的条带(图4A)。

2、大豆的离体毛根转化

选取颗粒饱满均匀、无裂痕的大豆Willam82种子，用10％H₂O₂对种子表面进行消毒1min，用无菌去离子水冲洗干净。将消毒的种子播种在萌发培养基中，在大豆人工气候室中培养一周。将含有目的质粒的发根农杆菌K599 28℃培养至OD＝0.6左右，用解剖刀蘸取菌液在大豆子叶的正面划网格状，将子叶摆放到发根培养基上，大豆人工气候室中培养15天左右。

实施例3FDL12 T1靶点编辑效率检测

(1)主要试剂与材料来源

DNA 提取试剂盒购于康为世纪公司；测序委托广州天一辉远基因科技有限公司完成。引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用灭菌后的ddH₂O稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

靶点检测引物：

T1-F:5’-AAGCGCACACACAACACAATC-3’(SEQ ID NO.10)；

T1-R:5’-TTTCTCTCTTGATAGGACTGCC-3’(SEQ ID NO.11)。

(2)操作步骤

按照康为世纪公司植物DNA 提取试剂盒上的步骤，提取从大豆子叶愈伤组织上生长出来的毛状根DNA。以毛状根DNA为模板，扩增FDL12基因片段(图4B)。30μL反应液：15μLMaster Taq mix，2μL正向引物，2μL反向引物，10μL无菌水，1μL DNA模板。PCR程序为：95℃2min；35个PCR循环：95℃30s，59℃30s，72℃1min；最后72℃2min。将PCR产物送到广州天一辉远基因科技有限公司测序，用BioEdit软件查看测序结果(图4C)，根据测序结果计算靶点的编辑效率，结果显示，编辑效率为66.6％(图4D)。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州大学

<120> 大豆FDL12基因编辑位点及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编辑位点

<400> 1

attgttgaca caaatccccc tgg 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶点引物F

<400> 2

gtcaattgtt gacacaaatc cccc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶点引物R

<400> 3

aaacggggga tttgtgtcaa caat 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U-F

<400> 4

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> gRNA-R

<400> 5

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B1’

<400> 6

ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BL

<400> 7

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP1

<400> 8

gtcgtgctcc acatgttgac c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP3

<400> 9

tgcaataact tcgtataggc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T1-F

<400> 10

aagcgcacac acaacacaat c 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T1-R

<400> 11

tttctctctt gataggactg cc 22

Claims

1.大豆FDL12基因编辑位点，其特征在于，所述编辑位点为一段23bp的DNA序列，序列为：5’-ATTGTTGACACAAATCCCCCTGG-3’；该位点在大豆基因组的准确定位是12号染色体FDL12编码区1号外显子上的27-49处。

2.根据权利要求2所述大豆FDL12基因编辑位点，其特征在于，所述大豆FDL12基因编辑位点3’端含有TGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或插入，造成目标靶点附近的突变。

3.含有权利要求1所述大豆FDL12基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9；所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。

5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆FDL12基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，得到的sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到；

所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。

6.权利要求1所述大豆FDL12基因编辑位点在改变大豆的成花转变时间中的应用。

7.一种培育FDL12突变体成花转变改良大豆品种的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA与sgRNA载体连接；

(4)将表达载体与步骤(3)中所述sgRNA表达盒连接，得到Cas9 sgRNA重组表达载体；

(6)除草剂筛选，得到转基因植株。

8.根据权利要求7所述培育方法，其特征在于，

步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d；

步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9；

步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切；

步骤(5)中所述发根农杆菌为农杆菌K599；

步骤(6)中所述筛选为采用除草剂Basta筛选转基因系。