CN116004712A - Rh2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用。本发明以棉花ZM24为受体，通过转基因技术和组织培养技术构建转基因材料，在材料中发现叶片皱缩的突变体，将其命名为ls。本发明通过对ls突变体进行T‑DNA插入侧翼序列分析以及对后代群体的连锁分析，确认该突变体的表型是由于外源T‑DNA片段整合到基因组中导致的，且精确地找到T‑DNA插入位置，经过表达量分析发现插入位点上游100kb的RH2基因在正常叶与皱缩叶之间差异表达。本发明对RH2基因进行功能验证，发现该基因在细胞核内表达，控制叶片皱缩表型。本发明利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)确认RH2基因控制叶片皱缩表型。

Description

RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用

技术领域

本发明涉及RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用，属于棉花基因工程领域。

背景技术

棉花作为全世界重要的经济作物，为人类的纺织事业发展提供了丰富的原材料。突变体是一种重要的遗传材料，其产生机制主要是某一个性状或基因发生可遗传的变异或突变。而棉花突变体作为一种重要的种质资源，在作物遗传机制研究、新种质创新等领域发挥着重要作用，在经典遗传学和反向遗传学研究中具有重要意义。

棉花叶形突变是一种常见的突变现象，对棉花叶片发育系统和遗传形态系统的研究具有重要意义，可以作为一种性状标记而广泛应用。叶片是植物进行光合作用的主要器官，其生长发育直接关系到整个植株的生长发育。而叶片形态又是植株形态建成中的重要成员之一，对于许多栽培作物而言，叶片的形态和叶片的空间分布可以影响植物光合作用，进而影响作物的质量及产量。

叶皱缩是指叶片形状保持不变，叶片变小且纵向、横向均发生卷曲，以往报道的叶皱缩突变体的突变性状出现较晚，或在第4-5片真叶期，或在第8片果枝叶时期，或在开花前。与现有报道的叶皱缩突变体不同，本发明发现一种新的突变体，其叶皱缩表型出现在子叶期，且整个生育期均能观察到明显的突变表型。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用。

进一步，上述应用是农杆菌介导RH2基因转化棉花。

具体方法为：将RH2基因和植物表达载体连接，构建重组载体，将重组载体导入农杆菌中，转化棉花。

本发明的技术方案之一是：一种RH2基因棉花突变体，是将含有RH2基因的重组载体通过农杆菌介导和遗传转化技术导入受体细胞，从而构建RH2基因棉花突变体。

本发明的技术方案之一是：一种RH2基因在筛选和培育棉花品种中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明以棉花ZM24为受体，通过转基因技术和组织培养技术构建转基因材料，在材料中发现叶片皱缩的突变体，将其命名为ls。

2、本发明通过对ls突变体进行T-DNA插入侧翼序列分析以及对后代群体的连锁分析，确认该突变体的表型是由于外源T-DNA片段整合到基因组中导致的，且精确地找到T-DNA插入位置，经过表达量分析发现插入位点上游100kb的RH2基因在正常叶与皱缩叶之间差异表达。

3、本发明构建的F2群体中，后代出现两种表型且性状分离比接近3：1，符合孟德尔遗传定律，表明T-DNA的插入影响了突变体的表型。

4、本发明对RH2基因进行功能验证，发现该基因在细胞核内表达，控制叶片皱缩表型。本发明利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)确认RH2基因控制叶片皱缩表型。

附图说明

图1为实施例1中野生型植株与ls突变体的表型图。

图2为实施例1中野生型植株与ls突变体的叶细胞显微观察图。

图3为实施例2中第三轮TAIL-PCR扩增产物电泳胶图。

图4为实施例2中插入位点序列图。

图5为实施例2中验证引物设计示意图。

图6为实施例2中侧翼序列扩增胶图。其中，ZC代表ZM24的正常叶，ZS代表ls突变体的皱缩叶。

图7为实施例2中野生型(WT)与突变体(mutant)插入位点附近基因定量图。其中，横坐标是基因号。

图8为实施例3中T-DNA与叶片皱缩表型共分离分析。

图9为实施例3中叶片皱缩表型与RH2基因表达量共分离分析。其中，ZC代表ZM24的正常叶，ZS代表ls突变体的皱缩叶，各7个重复。

图10为实施例4中亚细胞定位结果图。

图11为实施例4中VIGS结果图。

图12为实施例4中沉默效率统计结果柱形图。其中，空载pTRV2植株和pTRV2-RH2植株各3个重复。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。

实施例1：突变体的获得及表型分析

本发明所用的棉花T-DNA插入突变体库由中国农业科学院棉花研究所转基因实验室利用载体pBI121转化棉花ZM24构建而成。从转化群体中分离得到一个叶片皱缩的突变体，将其命名为ls。与野生型植株相比，ls突变体出现叶片皱缩的表型，且该突变体在田间及室内均表达稳定，整个生育期均能观察到明显的皱缩表型(图1)。对突变体的叶细胞进行显微观察发现，突变体的叶表皮细胞数目多于野生型，细胞呈不规则状(图2)。

实施例2：突变体侧翼序列的分离与分析

采用CTAB法提取ls突变体基因组DNA，随后根据棉花基因组的密码子偏好性，选择使用频率较高的密码子，在5’端加上接头形成随机融合引物。用DNAMAN软件设计数条嵌套的特异性引物，长度均在20-25bp之间。本研究所涉及的引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列如下：

注：W代表A/T，N代表A/C/G/T，S代表G/C。

(1)以ls突变体基因组DNA为模板，利用上述引物进行TAIL-PCR扩增。TAIL-PCR反应体系为：第1轮PCR反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL(100ng/μL)；2×MasterPCRMix 10μL；引物FP+ZL/ZR各1μL(10μM)；ddH₂O 7μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃15s，60℃30s，72℃1min(1min/1000bp)，35个循环；72℃10min，10℃，保存。反应完成后将产物稀释50倍，取2μL作第2轮反应的模板。第2轮反应完成后产物稀释30倍，取2μL作第3轮反应的模板。第2轮、第3轮反应的体系除模板及特异引物外(引物使用FSP1/FSP2)，其余成分与第1轮反应相同。三轮TAIL-PCR反应后，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图3)。根据凝胶上的带型，将条带单一明亮的PCR产物用切胶刀小心切下，使用全式金生物技术有限公司的胶回收试剂盒进行胶回收操作。

(2)将胶回收得到的目标基因片段重组到T载体中，反应体系为10μL，具体包含：目标基因片段0.5-8μL(用量根据基因片段大小选择：100-1000bp，10-40ng；1000-2000bp，40-80ng；2000-5000bp，80-150ng)；pTOPO-T Vector(30ng/μL)1μL；10×PCR Enhancer 1μL；加ddH₂O补足至10μL。室温下静置连接5min左右。

(3)使用热激法将步骤(2)连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂板后37℃过夜培养，挑选20个单克隆送至尚亚生物技术有限公司测序。

(4)由于利用PCR引物测出的前数十个碱基比较杂乱，首先去除序列中前30bp碱基对，随后将序列在Cottongen数据库中Blast分析(https://www.cottongen.org/tools/blast)，获得定位结果。测序结果经比对和生物信息学分析后得出T-DNA在ls突变体的插入情况：ls突变体在D13上有一个插入位点(图4)。得到T-DNA插入的具体位置后，根据左右侧翼序列以及T-DNA的边缘序列设计引物(图5)，通过设计的引物对P2与P3-1，P1与P3-2扩增片段并将产物送测序，验证T-DNA侧翼序列。引物序列如下：

P1：5’-CGCCGTATCAATCCCACTA-3’(SEQ ID NO.28)

P2：5’-GCTGATAGTGACCTTAGGCG-3’(SEQ ID NO.29)

P3-1：5’-GTTATCAGGGCTCCACTT-3’(SEQ ID NO.30)

P3-2：5’-CCCTATGGTATGTTGGGAA-3’(SEQ ID NO.31)

PCR反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL(100ng/μL)；2×Master PCR Mix 10μL；引物各1μL(10μM)；ddH₂O 7μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃15s，54℃30s，72℃1min(1min/1000bp)，35个循环；72℃10min，10℃，保存。结果表明ls突变体在D13的位置能扩增出条带(图6)，这个结果说明TAIL-PCR检测的T-DNA插入位点是正确的。

(5)对插入位点附近的基因进行注释及表达量分析，结果发现和野生型相比，ls突变体插入位点的上游基因RH2的表达量发生了显著性变化(图7)。

实施例3：遗传分析

3.1群体表型分析

ls突变体与棉花ZM24杂交得到F1代，F1代表现为叶片皱缩，据此判断该突变体为显性突变体。之后F1代自交得到F2代，经观察，F2代群体中的叶片出现两种表型：一种与野生型表型一致，叶片舒展，发育正常；另一种表现为叶片皱缩。通过卡方检测分析发现，F2群体出现叶皱缩植株与正常植株的分离比符合孟德尔遗传定律。

3.2连锁分析

为了证实ls突变体的突变表型是由于T-DNA插入引起的，本发明对部分F2代转基因植株进行了T-DNA插入位点侧翼序列与突变表型的共分离检测。共分离检测的具体步骤为：

应用CTAB法从120株F2代单株中分别抽提叶片DNA，并检测DNA样品的纯度和浓度，保证其浓度控制在DNA模板范围内。用上述引物组合P1+P3-2和P2+P3-1进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL；2×Master PCR Mix 10μL；引物各1μL(10μM)；ddH₂O7μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃15s，54℃30s，72℃1min(1min/1000bp)，35个循环；72℃10min，10℃，保存。

将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示。在F2代植株中，ls纯合T-DNA插入植株只有当P2和P3-1配对时才可以扩增出目标产物；而由于T-DNA插入，P1与P3-2配对扩增的产物>10kb，在设定的PCR反应程序内无法得到相应PCR产物。野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P2和P3-1配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P3-2配对扩增得到目标产物。而ls杂合T-DNA插入转基因植株在P1和P3-2配对以及P2和P3-1配对时都可以扩增得到产物。

统计结果显示120株F2代单株中，88株为突变体植株，32株为野生型植株，比例接近3:1。这表明控制叶片皱缩的基因与T-DNA连锁。

3.3表达连锁分析

为了进一步确认RH2与表型的连锁关系，本实验使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取ZM24正常叶和ls突变体皱缩叶的叶片总RNA。RNA提取方法按照试剂盒说明书进行。使用NanoDrop 2000仪器检测RNA样品的浓度，分子凝胶电泳检测RNA样品的纯度和完整性，以保障合格的样品进行后续实验。反转录过程使用TaKaRa公司的PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，方法按照试剂盒提供的方法进行。qRT-PCR过程使用TaKaRa公司的

PremixExTaq^TM试剂盒并按其提供的方法进行。定量引物通过在线网站qPrimerDB-qPCRPrimerDatabase(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)获得。qRT-PCR实验结果显示ls突变体中RH2表达量显著高于野生型(图9)，据此猜测RH2控制叶片皱缩。

实施例4：RH2功能验证

4.1亚细胞定位

(1)根据CottonFGD(https://cottonfgd.org/)陆地棉参考基因组中的RH2基因序列设计特异扩增引物35S-RH2-GFP-F/R。引物序列如下：

35S-RH2-GFP-F：

5’-AGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGAGTGGAAGGAAG-3’(SEQ ID NO.32)

35S-RH2-GFP-R：

5’-TCTCCTTTACCCATGTTAATTAACAAAGATAAAGAAAGCTTAAGGTC-3’(SEQ IDNO.33)

使用Takara公司TKS Gflex DNA Polymerase，以ZM24的cDNA为模板，扩增得到末端含有pCambia2300-GFP(35S:GFP)载体同源序列的RH2基因片段。PCR反应体系为50μL，具体包含：2×Gflx Buffer 25μL；TKS Gflx DNA Polymerase 1μL(1.25U/μL)；35S-RH2-GFP-F1μL(10μM)；35S-RH2-GFP-R 1μL(10μM)；cDNA 2μL(100ng/μL)；ddH₂O 20μL。PCR反应程序如下：94℃4min；98℃20s，52℃25s，68℃30s(1min/1000bp)，35个循环；68℃10min，4℃保存。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(125v，20min)，RH2基因为774bp。目的基因片段产物利用胶回收试剂盒回收后-20℃保存。

(2)选用PacI、XbaI对pCAMIBIA2300-GFP载体进行双酶切，酶切体系为50μL，具体包含：质粒载体3000ng；PacI 3μL(5U/μL)；XbaI 3μL(5U/μL)；CutSmart Butter 5μL；加ddH₂O补足至50μL。37℃恒温培养箱酶切3h，以空载体质粒为对照，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(125v，20min)，确认条带后，对成功切开的载体进行切胶回收。

按照ClonExpress II one Step Cloning Kit说明书将上述得到的目的基因片段和成功切开的载体重组连接，反应体系为10μL，具体包含：5×CEII Buffer 2μL；Exnase II1μL；酶切后的载体50ng；基因片段35ng；加ddH₂O补足至10μL。体系配制完成后，37℃水浴30min后置于冰上5min。制备得到载体pCaMV35S-RH2-GFP。

将重组好的载体pCaMV35S-RH2-GFP转化到大肠杆菌感受态DH5α中，挑取阳性克隆加入含有相应抗生素的3mL LB液体培养基中，置于37℃摇床培养后提取质粒，并将其转化到GV3101农杆菌感受态中。阳性农杆菌菌株在-80℃冰箱中保存备用。

(3)取500μL保存的农杆菌菌液在无菌工作台中加入2mL含有相应抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm活化培养；吸取300μL已活化好的菌液于10mL含有相应抗性的LB液体培养基扩繁；检测OD₆₀₀值达到1.2-1.5时，转移菌液至50mL灭菌离心管，设置4000rpm，10min离心收集菌体；用重悬液MMA(成分：1mmol/LMgCl₂、1mmoI/L吗啉乙磺酸、10μmoI/L乙酰丁香酮)将菌体重悬，并调节OD₆₀₀值为1.2，黑暗环境静置3h；选取长势良好并且一致的烟草，将叶片背面注射菌液，并做好标记；黑暗生长24h后，再转入光照培养室培养24h。

携带红色荧光蛋白的核定位maker用于核定位标记，并以35S:GFP空载体做空白对照，结果如图10所示。在激光共聚焦显微镜下，35S:GFP空载体在细胞质膜和细胞核上都能捕获到GFP信号，荧光强度相同，且核定位信号与核定位maker基因的红色荧光发生重叠。pCaMV35S-RH2-GFP在细胞核上能捕获到GFP信号，同样核定位信号与核定位maker基因的红色荧光发生重叠。这一结果表明RH2定位于细胞核。

4.2VIGS

(1)将步骤4.1(1)中纯化得到的RH2基因片段与pTRV2载体连接，构建重组载体pTRV2-RH2，导入农杆菌，并最终保存重组质粒pTRV2-RH2的阳性农杆菌，方法同步骤4.1

(2)。分别取500μL pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS(PDS为白化基因)、pTRV2-RH2的农杆菌冻存液在无菌工作台中加入2mL含有相应抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm活化培养；吸取300μL已活化好的菌液于10mL抗性LB液体培养基扩繁；检测OD₆₀₀值达到1.2-1.5时，转移菌液至50mL灭菌离心管，设置4000rpm，10min离心收集菌体；使用MAA缓冲液(成分：MgCL₂1mol/L，2mL/200mL；吗啉乙磺酸，0.5mol/L，4mL/200mL；乙酰丁香酮，200mM，200μL/200mL)调整OD₆₀₀＝1.5-1.6，将pTRV2、pTRV2-PDS、pTRV2-RH2这3种菌液分别与pTRV1菌液等体积混合，两种混合菌液的OD₆₀₀值越接近越好。在棉花生长至子叶完全展开且真叶还未露出时，使用1mL无针头注射器吸取上述混合菌液，注射到ls突变体子叶的下表面，记录注射时间，待注射pTRV2-PDS+pTRV1混合菌液的ls突变体出现白化表型时，观察沉默基因植物的表型变化。

结果如图11所示，阳性对照pTRV2-PDS组出现叶片皱缩和白化表型，空载体pTRV2组出现明显叶片皱缩表型，实验pTRV2-RH2组出现叶片伸展，说明目的基因被成功干涉。

(2)分别提取不同沉默基因的棉花叶片的总RNA，反转录获得cDNA并稀释浓度到100ng/μL。以GhHistone为内参基因进行qRT-PCR。方法同实施例3中3.3。通过比较pTRV2-RH2植株和空载pTRV2植株的相对表达量来检测基因沉默效率。

结果如图12所示，相较于空载pTRV2植株，pTRV2-RH2植株中RH2基因的表达量显著降低。

综上所述，RH2是调控叶片发育途径中的一个重要基因，为完善叶片发育分子机制提供了方向。

Claims (5)

1.RH2基因在调控棉花叶舒展/皱缩性状中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，农杆菌介导RH2基因转化棉花。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将RH2基因和植物表达载体连接，构建重组载体，将重组载体导入农杆菌中，转化棉花。

4.一种RH2基因棉花突变体，其特征在于，将含有RH2基因的重组载体通过农杆菌介导和遗传转化技术导入受体细胞，从而构建RH2基因棉花突变体。

5.一种RH2基因在筛选和培育棉花品种中的应用。

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