CN112342218B

CN112342218B - Boc1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用

Info

Publication number: CN112342218B
Application number: CN201910720257.7A
Authority: CN
Inventors: 付永彩; 张坤; 苏晶晶; 谭禄宾; 朱作峰; 刘凤霞; 才宏伟; 孙红荧; 顾凭; 孙传清
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2039-08-06
Also published as: CN112342218A

Abstract

本发明公开了一种BOC1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用。BOC1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，提高籼稻中BOC1蛋白表达量，愈伤组织褐化降低，抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织遗传转化效率提高。本发明具有重要的应用价值。

Description

BOC1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及BOC1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用。

背景技术

水稻愈伤组织在组织培养过程中，受各种因素的影响产生褐色物质，导致分化能力下降、生长迟缓甚至死亡。籼稻品种多数具有不良的组织培养特性，主要表现在愈伤组织在继代过程中容易褐化。籼稻愈伤组织易褐化，也导致籼稻遗传转化效率降低，即使采取一些提高籼稻组织培养效率的措施(如添加抗氧化剂、吸附剂、低盐、生长调节因子)，在一定程度上降低了愈伤组织的褐化率，也很难使籼稻的组织培养能力达到粳稻的水平，严重影响了籼稻基因工程的开展。栽培稻中80％为籼稻。因此，降低籼稻愈伤组织褐化率、提高籼稻遗传转化效率是目前水稻基因组研究和遗传改良面临的重要课题。

目前，关于水稻组织培养力性状QTL分析已有一些报道，例如通过成熟胚培养体系在第1染色体短臂上定位到一个控制水稻再生能力的主效QTL，采用图位克隆策略成功克隆到了编码亚硝酸还原酶的基因，并且通过农杆菌介导法将该基因导入水稻品种Koshihikari(水稻品种Koshihikari的愈伤组织诱导率和再生率均较低)中，得到转基因水稻；与水稻品种Koshihikari相比，转基因水稻的愈伤组织诱导率和再生率均显著提高。愈伤组织褐化性状观察过程比较困难，因此关于水稻愈伤组织褐化相关性状报导较少。截止目前，在任何植物中，采用图位克隆方法克隆愈伤组织褐化性状相关基因均未见报导。此外，对水稻组织培养力的遗传分析都局限于栽培稻，还没有研究者利用野生稻材料对组织培养力性状遗传进行遗传分析。

发明内容

本发明的目的为降低籼稻愈伤组织褐化。

本发明首先保护BOC1蛋白的应用，可为S1)-S4)中的至少一种：

S1)调控植物愈伤组织褐化；

S2)调控植物抗性愈伤组织筛选频率；

S3)调控植物抗性愈伤组织转化效率；

S4)培育愈伤组织褐化改变的转基因植物。

本发明还保护编码BOC1蛋白的核酸分子的应用，可为S1)-S4)中的至少一种：

S1)调控植物愈伤组织褐化；

S2)调控植物抗性愈伤组织筛选频率；

S3)调控植物抗性愈伤组织转化效率；

S4)培育愈伤组织褐化改变的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)籼稻；c6)水稻品种特青；c7)渗入系YIL25。

本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物甲中BOC1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物甲相比，转基因植物甲的愈伤组织褐化降低和/或抗性愈伤组织筛选频率提高和/或抗性愈伤组织转化效率提高。

上述方法中，所述“提高出发植物甲中BOC1蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高出发植物甲中BOC1蛋白的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物甲中BOC1蛋白的表达量和/或活性”可通过向出发植物甲中导入编码BOC1蛋白的核酸分子和/或向出发植物甲中编码BOC1蛋白的基因的启动子区域导入特异DNA分子实现；所述特异DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

上述方法中，所述“向出发植物甲中导入编码BOC1蛋白的核酸分子”可通过向出发植物甲中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码BOC1蛋白的核酸分子，得到的重组质粒。

所述重组质粒具体可为BOC1互补载体。所述BOC1互补载体可为将pCAMBIA1300载体中限制性内切酶SacI和KpnI之间的DNA小片段替换为序列表中序列5所示的DNA片段，其它序列均保持不变，得到的重组质粒。

上述方法中，所述“向出发植物甲中编码BOC1蛋白的基因的启动子区域导入所述特异DNA分子”可通过向DNA片段甲和DNA片段乙之间插入特异DNA分子实现；所述DNA片段甲的核苷酸序列为5’-attttcgttttctttttttctccctttctttttttcgcattaacggacgtttcgtactaag-3’；所述DNA片段乙的核苷酸序列为5’-ctggtatacaacaaggagaccggctgggcgcctgggcctgtccaggtgaagtaaagggcaaagtcggtact-3’。

上述方法中，所述“向出发植物甲中编码BOC1蛋白的基因的启动子区域导入所述特异DNA分子”可为将启动子甲替换为启动子乙。所述启动子甲的核苷酸序列如序列表中序列3所示。所述启动子乙的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

上述方法中，所述出发植物甲可为如下c1)至c6)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)籼稻；c6)水稻品种特青。

本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，包括如下步骤：降低出发植物乙中BOC1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物乙相比，转基因植物乙的愈伤组织褐化提高和/或抗性愈伤组织筛选频率降低和/或抗性愈伤组织转化效率降低。

上述方法中，所述“降低出发植物乙中BOC1蛋白的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物乙中BOC1蛋白的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“降低出发植物乙中BOC1蛋白的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物乙中导入抑制编码BOC1蛋白的核酸分子的表达的物质实现。

所述“抑制编码BOC1蛋白的核酸分子的表达的物质”具体可为BOC1干扰载体。所述BOC1干扰载体为将pTCK303载体中限制性内切酶SpeI和SacI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第588至904位所示的DNA片段，限制性内切酶BamHI和KpnI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第575至904位的反向互补序列所示的DNA片段，其它序列均保持不变，得到的重组质粒。

上述方法中，所述出发植物乙可为如下c1)、c2)、c3)、c4)、c5)和c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)籼稻；c7)渗入系YIL25。

本发明还保护特异DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。

本发明还保护所述特异DNA分子作为调控因子的应用，可为T1)-T5)中的至少一种：

T1)提高蛋白表达量和/或活性；

T2)降低植物愈伤组织褐化；

T3)提高植物抗性愈伤组织筛选频率；

T4)提高植物抗性愈伤组织转化效率；

T5)培育愈伤组织褐化降低的转基因植物。

上述应用中，所述蛋白可为BOC1蛋白。

上述任一所述愈伤组织褐化可体现为愈伤组织褐化指数和/或愈伤组织总褐化率。

上述任一所述愈伤组织褐化降低可表现为愈伤组织褐化指数降低和/或愈伤组织总褐化率降低。

上述任一所述愈伤组织褐化提高表现为愈伤组织褐化指数提高和/或愈伤组织总褐化率提高。

上述任一所述渗入系YIL25的制备方法可为：将云南元江普通野生稻作为父本，特青作为母本，进行杂交，得到杂交一代；将杂交一代和特青进行回交，得到渗入系YIL25。

上述任一所述BOC1蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物愈伤组织褐化和/或植物抗性愈伤组织筛选频率和/或植物抗性愈伤组织转化效率相关的蛋白质。

上述任一所述编码BOC1蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码BOC1蛋白的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码BOC1蛋白的DNA分子。

本发明的发明人从元江野生稻与特青构建的渗入系中筛选到一个愈伤组织褐化降低的渗入系YIL25；采用图位克隆策略从渗入系YIL25中分离并鉴定出一个降低愈伤组织褐化的BOC1基因，BOC1基因编码BOC1蛋白。经分析，渗入系YIL25的基因组中，BOC1基因的启动子区含有序列表中序列6所示的特异DNA分子，该特异DNA分子可以提高BOC1蛋白在愈伤组织中的表达。实验证明，提高籼稻中BOC1蛋白表达量，愈伤组织褐化降低，抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织遗传转化效率提高。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为渗入系YIL25的获得和渗入片段分析。

图2为愈伤组织褐化相关基因的图位克隆。

图3为BOC1干扰载体的部分结构示意图。

图4为BOC1互补载体的部分结构示意图。

图5为BOC1基因的功能分析。

图6为BOC1表达特性分析。

图7为BOC1基因对抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织转化效率的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，采用QTXb20(Manly，K.F.，Cudmore，R.J.&Meer，J.M.Map ManagerQTX，cross-platform software for genetic mapping.Mamm.Genome12，930-932(2001).)分析可能存在的p-value值小于0.001的QTL，用单位点回归分析法结合区间定位法进行QTL初步定位。

NB未改良培养基：取适量水，加入4.1g NB粉末、30g蔗糖、2mg 2，4-D和3g植物凝胶，然后用水定容至1L，121℃灭菌15min。

NB平板：将约55℃的20mLNB未改良培养基倒入培养皿(直径为9cm)中，自然冷却后，得到的平板即为NB平板。

下述实施例中，农杆菌介导的水稻遗传转化方法的步骤如下：将去壳后的水稻种子接种到NB未改良培养基上，培养7天，诱导其长出愈伤组织；重组农杆菌侵染愈伤组织，28℃共培养3天；洗菌后将愈伤组织接种至含潮霉素、200mg/L头孢和200mg/L特美汀的NB未改良培养基上，筛选三轮，每轮15d，第一、二轮筛选压力为潮霉素30mg/L，第三轮筛选压力为潮霉素50mg/L；挑选淡黄色、松散、坚硬的颗粒状抗性愈伤组织，接种至预分化培养基，暗培养7-15d；将愈伤组织转移至分化培养基，28℃培养(光照16h/黑暗8h)15-30d，得到水稻幼芽；将水稻幼芽转移至生根培养基，28℃培养(光照16h/黑暗8h)15-30d，得到再生苗。移栽土壤前炼苗7d。遗传转化实验分别于不同时间相同条件下重复三次。

预分化培养基：取适量水，加入4.1g NB粉末(Duchefa Biochemie公司的产品)、30g蔗糖、0.3g水解酪蛋白、2.878g脯氨酸、2mg NAA、1mg 6-BA和4g植物凝胶，然后用水定容至1L，121℃灭菌15min；自然冷却后，加入ABA，使ABA在体系中的浓度为5mg/L。

分化培养基：取适量水，加入4.43g MS粉末(Duchefa Biochemie公司的产品)、30g蔗糖、2g水解酪蛋白、30g山梨醇、1.1g MES、2mg NAA、1mg KT和4g植物凝胶，然后用水定容至1L，121℃灭菌15min。

生根培养基：取适量水，加入2.215gMS粉末、15g蔗糖、0.5mg NAA和3g植物凝胶，然后用水定容至1L，121℃灭菌15min。

下述实施例中涉及引物的核苷酸序列见表1。

表1

引物对名称	上游引物(5'-3')	下游引物(5'-3')
			RM545	CAATGGCAGAGACCCAAAAG	CTGGCATGTAACGACAGTGG
RM3131	CTCTGCACCCTGTTCACATG	CCCAATGGAATATCAGGTGG
			P50	TTGACCTTTTCCTTTCGTTA	GATGTCACACCCTTCAATTC
SN11	CACAAAACGTGGTTGGTACA	TGTACTGGTTGGCATTTGTG
			SN13	GCAGAGGACGTACAACTGCT	GAATTCGCTTTGCACAGAAT
SN24	GCACATCACATGGATTACGA	TAACATCAAATGGGCCTTGT
			P51	ACCACACTAACCCGACAAGT	GAAGGGCACACAAGAAAAA
RM3766	TTATAGAGCCAACACAACGG	ATCGATCTCTCTCCTGGAAA
			RM232	CCGGTATCCTTCGATATTGC	CCGACTTTTCCTCCTGACG
RM6676	GTTCACGGTCCAATAAGAAT	CTTTCAAGCTTACGAAAACA

下述实施例中RT-qPCR检测BOC1基因的相对表达量的方法如下：取RNA，采用GoScriptTM逆转录系统(Promega，Madison，WI，USA)进行第一链cDNA合成，然后在CFX96Real Time System(Bio-Rad，USA)上分析BOC1基因的表达水平。以水稻看家基因Actin(LOC_Os03g50885)为内参，利用2-△△Ct法计算相对表达量，每个样品三个重复。检测BOC1基因的引物为5’-TCCCTATGCTTCTGACGGAGAT-3’和5’-CAGTTGTACGTCCTCTGCAAAGTC-3’。检测Actin的引物为5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和5’-TGCACAATGGATGGGCCAGA-3’。

下述实施例中表型鉴定的方法如下：

1、取90粒成熟无虫眼无裂口的水稻种子，消毒，然后置于NB平板(每个NB平板上放置30粒)，28℃暗培养7天，得到小块愈伤组织。

2、将步骤1得到的小块愈伤组织转移至NB平板，暗培养21天，得到愈伤组织。

3、统计不同褐化的愈伤组织的块数。

根据愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例，将愈伤组织褐化分为5级，具体如下：愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例小于1/10，认为愈伤组织不褐化，为0级；愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例为1/10以上且小于1/3，认为愈伤组织轻度褐化，为1级；愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例为1/3以上且小于2/3，认为愈伤组织中度褐化，为2级；愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例为2/3以上且小于1，认为愈伤组织褐化严重，为3级；愈伤组织褐化面积占愈伤组织表面积的比例为1，认为愈伤组织全部褐化，为4级。

4、计算愈伤组织褐化率、愈伤组织总褐化率、愈伤组织褐化指数、抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织转化效率。

愈伤组织褐化率＝(各级褐化的愈伤组织块数/愈伤组织总数)×100％

愈伤组织总褐化率＝100％-褐化为0级的愈伤组织的褐化率

愈伤组织褐化指数＝(Σ每个褐化的愈伤组织数×对应的褐化级数)/(愈伤组织总数×最高级褐化)×100％

抗性愈伤组织筛选频率＝(抗性愈伤组织总数/转化的愈伤组织总数)×100％

抗性愈伤组织转化效率＝(阳性植株数/转化的愈伤组织总数)×100％

实施例1、渗入系YIL25的获得和渗入片段分析

本实施例中，标准误基于3次重复，**表示在0.01水平(双侧)差异显著性。

1、将云南元江普通野生稻(简称元江野生稻或YJCWR)作为父本或者供体亲本，特青(即Teqing)作为母本或者受体亲本，进行杂交，得到杂交一代。将杂交一代(作为父本)和特青进行回交，得到127个渗入系。127个渗入系依次命名为渗入系YIL1-渗入系YIL127。

2、分别统计127个渗入系、元江野生稻和特青的愈伤组织总褐化率和愈伤组织褐化指数。

特青、元江野生稻和渗入系YIL125(以下简称YIL125)的愈伤组织表型依次见图1中a、b和c。愈伤组织总褐化率的统计结果见图1中e(CBR表示愈伤组织总褐化率)。愈伤组织褐化指数的统计结果见图1中f(CBI表示愈伤组织褐化指数)。结果表明，与特青相比，YIL125的愈伤组织总褐化率和愈伤组织褐化指数均显著降低。

3、将YIL125(作为父本)和特青(作为母本)进行杂交，得到F1。

4、统计F1的愈伤组织总褐化率和愈伤组织褐化指数。

F1的愈伤组织表型见图1中d。F1的愈伤组织总褐化率的统计结果见图1中e。F1的愈伤组织褐化指数的统计结果见图1中f。

结果表明，F1和YIL125的愈伤组织表型基本相似；与特青相比，F1的愈伤组织总褐化率和愈伤组织褐化指数均显著降低。由此可见，愈伤组织褐化降低(愈伤组织褐化降低表现为愈伤组织总褐化率和愈伤组织褐化指数降低)是由显性基因控制的。

实施例2、愈伤组织褐化相关基因的图位克隆

一、qCBT3初步定位

1、将YIL25和特青进行杂交，获得F1种子；种植F1种子，构建获得F2群体。F2群体共计198个单株。

2、完成步骤1后，对198个单株进行SSR标记鉴定，其中SSR标记包括表1中的RM545、RM3131、RM3766、RM232和RM6676。

3、完成步骤2后，分别观察198个单株愈伤组织的表型。

结果见图2中a(n表示定位群体单株数，bar＝500kb)。结果表明，在第3染色体RM3131和RM3766之间有一个控制愈伤组织褐化性状的主效QTL qCBT3，可以解释14％的表型变异，来自元江野生稻的等位基因能降低愈伤组织褐化。

二、qCBT3精细定位

1、从F2群体中选择仅在第3染色体qCBT3位点(RM3131-RM3766)杂合，其余染色体均为特青背景的单株，构建新的分离群体共6377个单株，以排除第2和第5染色体渗入片段的干扰。

2、完成步骤1后，对6377个单株进行基因型鉴定，挑选qCBT3位点处的重组单株进行表型鉴定。同时加密分子标记，采用SSR标记(表1中P50和P51)以及SNP标记(表1中SN11、SN13和SN24)鉴定，最终将qCBT3定位于SNP标记SN11和SN13之间18.6kb的区间，在该区间只有一个基因，即LOC_Os03g12820(见图2中b和c；b中，R1-R7表示重组单株，黑色框代表YIL25纯合基因型，白色框代表特青纯合基因型，灰色框代表发生交换的区域，LOC_Os03g12820是BOC1的候选基因，标准误基于3次重复，bar＝10kb；c为LOC_Os03g12820的结构，白色框代表5′-UTR，带有箭头的白色框为3′-UTR，黑色框代表外显子，在黑色框与黑色框之间的线段代表内含子，bar＝200bp)。

3、序列分析

分析特青和YIL125的LOC_Os03g12820。

结果见图2中d(LOC_Os03g12820启动子区的突变位点，“----”代表碱基缺失，bar＝50bp)。结果表明，特青和YIL125的LOC_Os03g12820编码区无差异，而在转录起始位点上游，特青有1个337bp缺失、1个1bp缺失和3个SNPs。因此，将LOC_Os03g12820作为候选基因，命名为BOC1基因。

337bp缺失的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

BOC1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

BOC1基因编码BOC1蛋白。BOC1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

特青中BOC1基因的启动子的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

YIL125中BOC1基因的启动子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

实施例3、BOC1基因的功能分析

一、重组质粒的构建

1、BOC1-RNAi植物干扰载体(简称BOC1干扰载体)的构建

BOC1干扰载体的部分结构示意图见图3。具体构建过程如下：

(1)以YIL125的cDNA为模板，采用引物对Ubi:BOC1-RNAi-1(由5’-AAAACTAGTCTACAAGGTGGTGGAGAAGC-3’和5’-AAAGAGCTCCACTAGCGTGAGGGTACTGC-3’组成)进行PCR扩增，得到约335bp的正向DNA片段。

(2)取正向DNA片段，用限制性内切酶SpeI和SacI酶切，回收酶切片段1。

(3)取pTCK303载体，用限制性内切酶SpeI和SacI酶切，回收载体骨架1。

(4)将酶切片段1和载体骨架1进行连接，得到中间载体。

(5)以YIL125的cDNA为模板，采用引物对Ubi:BOC1-RNAi-2(由5’-CGCGGATCCCACTAGCGTGAGGGTACTGC-3’和5’-CGGGGTACCAGGCGGACAAGTTCTACAAG-3’组成)进行PCR扩增，得到约346bp的反向DNA片段。

(6)取反向DNA片段，用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切，回收酶切片段2。

(7)取中间载体，用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切，回收载体骨架2。

(8)将酶切片段2和载体骨架2进行连接，得到BOC1干扰载体。

将BOC1干扰载体进行测序。根据测序结果，对BOC1干扰载体的结构描述如下：将pTCK303载体中限制性内切酶SpeI和SacI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第588至904位所示的DNA片段，限制性内切酶BamHI和KpnI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第575至904位的反向互补序列所示的DNA片段，其它序列均保持不变，得到的重组质粒。

2、BOC1互补载体的构建

BOC1互补载体的部分结构示意图见图4。具体构建过程如下：

(1)以YIL125的基因组DNA为模板，采用引物对BOC1-CPL(由5’-AAAGAGCTCAAAACTCCCGTAACCGTAGG-3’和5’-GGGGTACCAAAAACGGGGAAAAGACAAC-3’组成)进行PCR扩增，得到约4572bp的DNA片段。

(2)取DNA片段，用限制性内切酶SacI和KpnI酶切，回收酶切片段。

(3)取pCAMBIA1300载体，用限制性内切酶SacI和KpnI酶切，回收载体骨架。

(4)将酶切片段和载体骨架进行连接，得到BOC1互补载体。

将BOC1互补载体进行测序。根据测序结果，对BOC1互补载体的结构描述如下：将pCAMBIA1300载体中限制性内切酶SacI和KpnI之间的DNA小片段替换为序列表中序列5所示的DNA片段，其它序列均保持不变，得到的重组质粒。

二、重组农杆菌的获得

1、将BOC1干扰载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/BOC1-RNAi。

2、将BOC1互补载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/BOC1-pCPL。

三、转基因水稻的获得和鉴定

1、转基因干扰株系的获得和鉴定

(1)采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/BOC1-RNAi转化YIL25，得到若干拟转基因干扰株系。

(2)分别以拟转基因干扰株系的基因组DNA为模板，采用引物对HPT(由5’-TACTTCTACACAGCCATC-3’和5’-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有944bp的DNA片段，则相应的拟转基因干扰株系为阳性植株；如果PCR扩增产物中不含有944bp的DNA片段，则相应的拟转基因干扰株系为阴性转基因植株。

反应程序为：95℃变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

检测结果表明，共获得18株阳性植株(即18个转基因干扰株系)和80株阴性转基因植株。将其中2个转基因干扰株系命名为pRi-1和pRi-2。

待pRi-1和pRi-2成熟后，分别收获pRi-1种子和pRi-2种子。

待阴性转基因植株成熟后，收获阴性种子。

(3)完成步骤(2)后，取90粒待测种子(阴性种子、特青种子、YIL25种子、pRi-1种子或pRi-2种子)，消毒，然后置于NB平板(每个NB平板上放置30粒)，28℃暗培养7天，得到小块愈伤组织。

(4)将步骤(3)得到的小块愈伤组织转移至NB平板，暗培养21天，得到愈伤组织。

(5)观察步骤(4)中愈伤组织的表型并统计愈伤组织褐化指数。

部分愈伤组织的表型见图5中a-d(Negative为阴性种子，bars＝1cm)。部分愈伤组织褐化指数的统计结果见图5中e(Negative为阴性种子)。结果表明，与阴性种子或YIL25种子相比，pRi-1种子和pRi-2种子的愈伤组织褐化严重，愈伤组织褐化指数显著提高。

(6)用TRIZOL法提取步骤(4)得到的愈伤组织的RNA，用

试剂盒(Qiagen,Hilden，Germany)进行纯化，然后RT-qPCR检测BOC1基因的相对表达量。

部分检测结果见图5中f(Negative为阴性种子)。结果表明，与阴性种子或YIL25种子相比，pRi-1种子和pRi-2种子的愈伤组织中BOC1基因的相对表达量显著下降。

2、转基因互补株系的获得和鉴定

(1)采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/BOC1-pCPL转化特青，得到若干拟转基因互补株系。

(2)分别以拟转基因互补株系的基因组DNA为模板，采用引物对CPL(由5’-TAAGCGCCAAGAAAAATACG-3’和5’-CAGAGTTGTCGCATGTGAAG-3’组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有600bp的DNA片段，则相应的拟转基因互补株系为阳性植株；如果PCR扩增产物中不含有600bp的DNA片段，则相应的拟转基因互补株系为阴性转基因植株。

反应程序为：95℃变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

检测结果表明，共获得15株阳性植株(即15个转基因互补株系)和72株阴性转基因植株。将其中2个转基因互补株系命名为pCPL-1和pCPL-2。

待pCPL-1和pCPL-2成熟后，分别收获pCPL-1种子和pCPL-2种子。

待阴性转基因植株成熟后，收获阴性种子。

(3)完成步骤(2)后，取90粒待测种子(阴性种子、特青种子、YIL25种子、pCPL-1种子或pCPL-2种子)，消毒，然后置于NB平板(每个NB平板上放置30粒)，28℃暗培养7天，得到小块愈伤组织。

(5)观察步骤(4)中愈伤组织的表型并统计愈伤组织褐化指数。

部分愈伤组织的表型见图5中g-j(Negative为阴性种子，bars＝1cm)。部分愈伤组织褐化指数的统计结果见图5中k(Negative为阴性种子)。结果表明，与阴性种子或特青种子相比，pCPL-1种子和pCPL-2种子的愈伤组织褐化减轻，愈伤组织褐化指数显著降低。

(6)用TRIZOL法提取步骤(4)得到的愈伤组织的RNA，用

部分检测结果见图5中l(Negative为阴性种子)。结果表明，与阴性种子或特青种子相比，pCPL-1种子和pCPL-2种子的愈伤组织中BOC1基因的相对表达量显著提高。

实施例4、BOC1表达特性分析

一、检测BOC1基因的表达模式

1、取90粒待测种子(特青种子或YIL25种子)，消毒，然后置于NB平板(每个NB平板上放置30粒)，28℃暗培养7天，得到小块愈伤组织。

2、将步骤1得到的小块愈伤组织转移至NB平板，暗培养(继代培养)7天、14天、21天或30天，得到愈伤组织。

3、用TRIZOL法提取步骤2得到的愈伤组织的RNA，用

检测结果见图6中a(标准误基于3次重复，**表示在0.01水平(双侧)差异显著性)。结果表明，继代培养前期BOC1基因在特青和YIL25中的表达量均较低，两者差异不显著；继代培养后期BOC1基因在特青和YIL25中的表达量均较高，两者显著差异。

4、取步骤2中继代培养21天得到的愈伤组织，进行mRNA组织原位杂交分析。具体步骤如下：

(1)取步骤2中继代培养21天得到的愈伤组织，放入预冷的3.7％(v/v)FAA固定液，然后一起置于冰上，4℃振荡过夜，之后脱水、透明及包埋，切成长为10μm的小段，小心平放在载玻片上，在载玻片上滴加1mLDEPC-H2O，使蜡片漂浮于水面上，将载玻片置于42℃烘片机上展片5-10min，并用吸水纸吸干；置于42℃烘箱烘片2-3d；

(2)取步骤(1)得到的切片，分别采用BOC1正义探针引物对(由5’-TAATACGACTCACTATAGGGTCCCTATGCTTCTGACGGAGAT-3’和5’-ACCCCCTCTATGTTCATGAC-3’组成)和BOC1反义探针引物对(由5’-TCCCTATGCTTCTGACGGAGAT-3’和5’-TAATACGACTCACTATAGGGACCCCCTCTATGTTCATGAC-3’组成)进行PCR扩增，然后使用DIG RNA labeling Kit(Roche)进行体外转录，经杂交、显色，晾干后于显微镜下(Leica DMR)观察。

检测结果见图6中b(bars＝100μm)。结果表明，与特青相比，YIL25的原位杂交信号增强。由此可见，BOC1基因在YIL25中的表达量高于特青。

5、用TRIZOL法提取YIL25组织(步骤2中YIL25继代培养21天得到的愈伤组织、YIL25的分蘖基部、YIL25的根、YIL25的茎、YIL25的叶或YIL25的幼穗)的RNA，用

检测结果见图6中d(标准误基于3次重复)。结果表明，BOC1基因在YIL25继代培养21天得到的愈伤组织中的表达量最高，在幼穗中的表达量最低。

二、BOC1基因启动子区的核苷酸序列影响BOC1基因的表达

pGreenII 0800-LUC载体记载与如下文献中：Hellens，R.P.et al.Transientexpression vectors for functional genomics，quantifcation of promoter activityand RNA silencing in plants.Plant Methods 1，13(2005)。

1、重组质粒的构建

(1)重组质粒YIL25的构建

①以YIL125的基因组DNA为模板，采用引物对LUC(由5’-ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCAAAACTCCCGTAACCGTAGG-3’和5’-GAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGCACCCCTCCCGACCCGGATC-3’组成)进行PCR扩增，得到1452bp的DNA片段1。

②将DNA片段1和pGreenII 0800-LUC载体进行同源重组，得到重组质粒YIL25。

(2)重组质粒Teqing的构建

①以Teqing的基因组DNA为模板，采用引物对LUC进行PCR扩增，得到1114bp的DNA片段2。

②将DNA片段2和pGreenII 0800-LUC载体进行同源重组，得到重组质粒Teqing。

(3)重组质粒M1—重组质粒M5的构建

将重组质粒YIL25含有的序列4所示的DNA分子中第342至678位缺失，得到重组质粒M1。

将重组质粒YIL25含有的序列4所示的DNA分子中第254位的A替换为C，得到重组质粒M2。

将重组质粒YIL25含有的序列4所示的DNA分子中第849位的C替换为T，得到重组质粒M3。

将重组质粒YIL25含有的序列4所示的DNA分子中第1351位的C替换为T，得到重组质粒M4。

将重组质粒YIL25含有的序列4所示的DNA分子中第27位的C缺失，得到重组质粒M5。

重组质粒M1、重组质粒M2、重组质粒M3、重组质粒M4和重组质粒M5均由华大基因公司构建而成。

2、将步骤1构建的7个重组质粒分别转化特青原生质体(从步骤2中特青继代培养21天得到的愈伤组织中提取获得)，暗培养14-20h，然后使用Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒(Promega)和Glomax 20/20 Luminometer检测仪(Promega)检测荧光信号，进而检测LUC报告基因的瞬时表达。

检测结果见图6中c(顶端代表pGreenII 0800-LUC载体结构，左边表示BOC1启动子定点突变载体，右边表示Luc/Ren的表达量，标准误基于10次重复，**表示在0.01水平(双侧)差异显著性，YIL25为重组质粒YIL25，Teqing为重组质粒Teqing，M1为重组质粒M1，M2为重组质粒M2，M3为重组质粒M3，M4为重组质粒M4，M5为重组质粒M5，Luc表示萤火虫荧光素酶报告基因，Ren为内参基因)。结果表明，与YIL25启动子片段的活性相比，突变后的3个SNPs以及1bp缺失的表达活性均没有显著差异，而337bp缺失明显降低了BOC1基因的表达，达到与特青相似的表达水平。由此可见，337bp缺失降低了BOC1基因在特青中的表达。

337bp缺失的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

实施例5、BOC1基因对抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织转化效率的影响

本实施例中，标准误基于3次重复，*表示在0.05水平(双侧)差异显著性，**表示在0.01水平(双侧)差异显著性。

1、Teqing pCPL的获得

采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/BOC1-pCPL转化特青，得到若干拟转基因株系；然后按照实施例3三2中(2)的方法检测阳性植株。

2、Teqing 1300的获得

(1)将pCAMBIA1300载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300。

(2)采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/pCAMBIA1300转化特青，得到若干拟转基因株系；

(3)分别以拟转基因株系的基因组DNA为模板，采用引物对HPT进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如果PCR扩增产物中含有944bp的DNA片段，则相应的拟转基因株系为阳性植株。

3、YIL25 1300的获得

采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/pCAMBIA1300转化YIL25，得到若干拟转基因株系；然后按照步骤2的方法检测阳性植株。

4、观察愈伤组织状态并统计步骤1至3中抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织转化效率。

结果如下：筛选三轮后愈伤组织状态见图7中a-c(bars＝1cm)；与Teqing 1300相比，YIL25 1300的抗性愈伤组织筛选频率提高3.7倍(图7中d)，抗性愈伤组织转化效率提高3.5倍(图7中e)，说明YIL25是良好的转化受体；与Teqing 1300相比，Teqing pCPL的抗性愈伤组织筛选频率提高2.6倍(图7中d)，抗性愈伤组织转化效率提高2.4倍(图7中e)。

上述结果表明，提高BOC1基因的表达量可以降低特青愈伤组织褐化，进而提高抗性愈伤组织筛选频率和抗性愈伤组织转化效率。

<110> 中国农业大学

<120> BOC1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1392

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 1

atggacttct ccggcgacgt caagccggcg atccaccggc cctctgtcgc ggcggcacgc 60

gggggaggga acggtggggc gatcccgctc ctgcgtgggt ggcaggcgtt ccggaggagc 120

ggcgcgccgg cgaggctcct ctgcttcgag ggcggcgcgt gggcggacgt cgcgggcgag 180

gtggtggggc tgctgcggcg ggcgttcatg gaggggaagg ccgtttgcga ggccgcctgc 240

ggtgggaggg tgttcctgtt cgacttcatg cggatggttc ggatcgatga ggccaccgcc 300

gaggaggccg cgctggggtg gatcgacgac cgcggcgcgt gcttcttccc ggctcccgag 360

ggcgggagga agaggaagag ggagagggac gaggcggggt cggaggtgaa gggggaggat 420

cggcggcggc ggcagccggc ggcggaggag gaggacgggg acgaggcgtc gtccggcgtg 480

gaggagcggt ccggggagag ccgccccgag gcggatgagc ccgacaggaa gaaggcgcgc 540

gggacgttgt gggggaaggc ggtgaggctg gacgaggcgg acaagttcta caaggtggtg 600

gagaagctct tcgtcagccg gatggctccc gtggcggcgg cccgcggcgt ggcgatcacg 660

gcggtgcaca aggtcgcgca ggggccccgg gcaagagcct tccatctgca gggacagctc 720

cttgccgctg ctcgcggcgt cggcgatggc agcaacgcca agttcgcgtg gtacggcgcg 780

ccggcggcgg atgtggccgc ggcggtggag cacggcttcg ggaggacgaa cgggcagttt 840

ctcggcgggc gcgcacacgg cgacggcgtt cacctttcgc cgccgcagta ccctcacgct 900

agtgcgatgc tgaccaagcc agacgagaat ggcgaggcac acatcgtgct gtgccgcgtc 960

ctgatgggcc gtccagaggc cgtccctgcc agctcacccc aattccaccc cagcagcgac 1020

gaatacgaca gcgccgtcga caaccttgag aatccgcggt ggtacgttgt atggagcaca 1080

gacatgaaca ccaggatcct cccagagtac gtggtcagct tcaggtggcc caacctgccg 1140

cagatggaag gatcatcggg gttgggatcg aagctgaaga agccatcacc agcagctact 1200

cgcgacatgt tccctatgct tctgacggag atccagcggt tcgttccatc cccgaagctg 1260

cagactttgc agaggacgta caactgcttc aagagaggac agatgaagaa ggaccagttc 1320

atccggttct tgcgctccca catcggcgac aatgtgttga ccaccgtggc caagaaactc 1380

cgagggtact ag 1392

<210> 2

<211> 463

<212> PRT

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 2

Met Asp Phe Ser Gly Asp Val Lys Pro Ala Ile His Arg Pro Ser Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Gly Asn Gly Gly Ala Ile Pro Leu Leu Arg

20 25 30

Gly Trp Gln Ala Phe Arg Arg Ser Gly Ala Pro Ala Arg Leu Leu Cys

35 40 45

Phe Glu Gly Gly Ala Trp Ala Asp Val Ala Gly Glu Val Val Gly Leu

50 55 60

Leu Arg Arg Ala Phe Met Glu Gly Lys Ala Val Cys Glu Ala Ala Cys

65 70 75 80

Gly Gly Arg Val Phe Leu Phe Asp Phe Met Arg Met Val Arg Ile Asp

85 90 95

Glu Ala Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Trp Ile Asp Asp Arg Gly

100 105 110

Ala Cys Phe Phe Pro Ala Pro Glu Gly Gly Arg Lys Arg Lys Arg Glu

115 120 125

Arg Asp Glu Ala Gly Ser Glu Val Lys Gly Glu Asp Arg Arg Arg Arg

130 135 140

Gln Pro Ala Ala Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Ala Ser Ser Gly Val

145 150 155 160

Glu Glu Arg Ser Gly Glu Ser Arg Pro Glu Ala Asp Glu Pro Asp Arg

165 170 175

Lys Lys Ala Arg Gly Thr Leu Trp Gly Lys Ala Val Arg Leu Asp Glu

180 185 190

Ala Asp Lys Phe Tyr Lys Val Val Glu Lys Leu Phe Val Ser Arg Met

195 200 205

Ala Pro Val Ala Ala Ala Arg Gly Val Ala Ile Thr Ala Val His Lys

210 215 220

Val Ala Gln Gly Pro Arg Ala Arg Ala Phe His Leu Gln Gly Gln Leu

225 230 235 240

Leu Ala Ala Ala Arg Gly Val Gly Asp Gly Ser Asn Ala Lys Phe Ala

245 250 255

Trp Tyr Gly Ala Pro Ala Ala Asp Val Ala Ala Ala Val Glu His Gly

260 265 270

Phe Gly Arg Thr Asn Gly Gln Phe Leu Gly Gly Arg Ala His Gly Asp

275 280 285

Gly Val His Leu Ser Pro Pro Gln Tyr Pro His Ala Ser Ala Met Leu

290 295 300

Thr Lys Pro Asp Glu Asn Gly Glu Ala His Ile Val Leu Cys Arg Val

305 310 315 320

Leu Met Gly Arg Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Ser Pro Gln Phe His

325 330 335

Pro Ser Ser Asp Glu Tyr Asp Ser Ala Val Asp Asn Leu Glu Asn Pro

340 345 350

Arg Trp Tyr Val Val Trp Ser Thr Asp Met Asn Thr Arg Ile Leu Pro

355 360 365

Glu Tyr Val Val Ser Phe Arg Trp Pro Asn Leu Pro Gln Met Glu Gly

370 375 380

Ser Ser Gly Leu Gly Ser Lys Leu Lys Lys Pro Ser Pro Ala Ala Thr

385 390 395 400

Arg Asp Met Phe Pro Met Leu Leu Thr Glu Ile Gln Arg Phe Val Pro

405 410 415

Ser Pro Lys Leu Gln Thr Leu Gln Arg Thr Tyr Asn Cys Phe Lys Arg

420 425 430

Gly Gln Met Lys Lys Asp Gln Phe Ile Arg Phe Leu Arg Ser His Ile

435 440 445

Gly Asp Asn Val Leu Thr Thr Val Ala Lys Lys Leu Arg Gly Tyr

450 455 460

<210> 3

<211> 1114

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 3

aaaactcccg taaccgtagg atgatcagat ggtcaacggc gatggcaaag gtcagcgttt 60

ggtttaccac gccttcgtcc ggcggtgggc cggtggggcc cacctggaag tctaattatt 120

actagaccga gaaataaaca acttgcttca caagaacatc gtgggtggga acgagcgaaa 180

gcaatcttaa gcgccaagaa aaatacgcac aagagagaag agtaggcgcg gttttgtggc 240

cggagagaaa gccacgcgcc ggtttcgtgc cggagtatca ttttcgtttt ctttttttct 300

ccctttcttt ttttcgcatt aacggacgtt tcgtactaag ctggtataca acaaggagac 360

cggctgggcg cctgggcctg tccaggtgaa gtaaagggca aagtcggtac taatcggtat 420

agtcagcgtg cttcacatgc gacaactctg acccaaggtg aagtaaagag ccaagtcttt 480

atgtacgaca gtacgagcaa ggactagtac tagtagaagt gctatgctga attttgctat 540

tgttaggaaa caattttttg gtttatataa ttaaccaaac tcatacaatc aaatgtgtat 600

gcatgaaatt gaaatgtaac cgttttttag accaattttc ttatattaat taatttatta 660

tagaggagaa atattttttt ctttttttaa gggaaggagc actattcttt ccgttcaagt 720

aagtagtagt ccagaccaaa aaagaaataa aaaaacaact ggcgcaagta aaacaggttc 780

gggggcaaac tagacatttc tagacttctc taccaaggca tctccttctg tccttcatca 840

ggggcaaaac cgccattacc attaccaaca aacgcaaaga agactcgggc gggcgccgcc 900

ccagaacaca agtgagaaaa aaaaaaaacc gacctcctcg ccgacgtgct cttcaagaga 960

ccgacccccc gccgcggcct caacctatat attcatcccc acctcctccg tcttccgctc 1020

ccacttgatc ccgatcgcca tttctccacc tgcacatctg cgcgcgcgcg cgggagagca 1080

gaggcggcga gagagatccg ggtcgggagg ggtg 1114

<210> 4

<211> 1452

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 4

aaaactcccg taaccgtagg atgatccaga tggtcaacgg cgatggcaaa ggtcagcgtt 60

tggtttacca cgccttcgtc cggcggtggg ccggtggggc ccacctggaa gtctaattat 120

tactagaccg agaaataaac aacttgcttc acaagaacat cgtgggtggg aacgagcgaa 180

agcaatctta agcgccaaga aaaatacgca caagagagaa gagtaggcgc ggttttgtgg 240

ccggagagaa agcaacgcgc cggtttcgtg ccggagtatc attttcgttt tctttttttc 300

tccctttctt tttttcgcat taacggacgt ttcgtactaa ggccctgttt agatgggact 360

aaaactttta agtccctatc atatcagatg tttgaaaatt aattataaat attaaacgta 420

gactattaat aaaacccatc cataatcttg gactaatttg cgagacgaat ctaatgagcc 480

taattaatcc atgattagcc tatgtgatgc tacagtaaac attctctaat tatagattaa 540

ttaggcttaa aaaatttgtc tcgtgaatta gcttttattt atgtaattag ttttgtaagt 600

agtctatatt taatactcta aattagtgtc taaagacaga gactaaagtt aagtccctgg 660

atctaataac cacctaagct ggtatacaac aaggagaccg gctgggcgcc tgggcctgtc 720

caggtgaagt aaagggcaaa gtcggtacta atcggtatag tcagcgtgct tcacatgcga 780

caactctgac ccaaggtgaa gtaaagagcc aagtctttat gtacgacagt acgagcaagg 840

actagtacca gtagaagtgc tatgctgaat tttgctattg ttaggaaaca attttttggt 900

ttatataatt aaccaaactc atacaatcaa atgtgtatgc atgaaattga aatgtaaccg 960

ttttttagac caattttctt atattaatta atttattata gaggagaaat atttttttct 1020

ttttttaagg gaaggagcac tattctttcc gttcaagtaa gtagtagtcc agaccaaaaa 1080

agaaataaaa aaacaactgg cgcaagtaaa acaggttcgg gggcaaacta gacatttcta 1140

gacttctcta ccaaggcatc tccttctgtc cttcatcagg ggcaaaaccg ccattaccat 1200

taccaacaaa cgcaaagaag actcgggcgg gcgccgcccc agaacacaag tgagaaaaaa 1260

aaaaaaccga cctcctcgcc gacgtgctct tcaagagacc gaccccccgc cgcggcctca 1320

acctatatat tcatccccac ctcctccgtc ctccgctccc acttgatccc gatcgccatt 1380

tctccacctg cacatctgcg cgcgcgcgcg ggagagcaga ggcggcgaga gagatccggg 1440

tcgggagggg tg 1452

<210> 5

<211> 4573

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 5

aaaactcccg taaccgtagg atgatccaga tggtcaacgg cgatggcaaa ggtcagcgtt 60

tggtttacca cgccttcgtc cggcggtggg ccggtggggc ccacctggaa gtctaattat 120

tactagaccg agaaataaac aacttgcttc acaagaacat cgtgggtggg aacgagcgaa 180

agcaatctta agcgccaaga aaaatacgca caagagagaa gagtaggcgc ggttttgtgg 240

ccggagagaa agcaacgcgc cggtttcgtg ccggagtatc attttcgttt tctttttttc 300

tccctttctt tttttcgcat taacggacgt ttcgtactaa ggccctgttt agatgggact 360

aaaactttta agtccctatc atatcagatg tttgaaaatt aattataaat attaaacgta 420

gactattaat aaaacccatc cataatcttg gactaatttg cgagacgaat ctaatgagcc 480

taattaatcc atgattagcc tatgtgatgc tacagtaaac attctctaat tatagattaa 540

ttaggcttaa aaaatttgtc tcgtgaatta gcttttattt atgtaattag ttttgtaagt 600

agtctatatt taatactcta aattagtgtc taaagacaga gactaaagtt aagtccctgg 660

atctaataac cacctaagct ggtatacaac aaggagaccg gctgggcgcc tgggcctgtc 720

caggtgaagt aaagggcaaa gtcggtacta atcggtatag tcagcgtgct tcacatgcga 780

caactctgac ccaaggtgaa gtaaagagcc aagtctttat gtacgacagt acgagcaagg 840

actagtacca gtagaagtgc tatgctgaat tttgctattg ttaggaaaca attttttggt 900

ttatataatt aaccaaactc atacaatcaa atgtgtatgc atgaaattga aatgtaaccg 960

ttttttagac caattttctt atattaatta atttattata gaggagaaat atttttttct 1020

ttttttaagg gaaggagcac tattctttcc gttcaagtaa gtagtagtcc agaccaaaaa 1080

agaaataaaa aaacaactgg cgcaagtaaa acaggttcgg gggcaaacta gacatttcta 1140

gacttctcta ccaaggcatc tccttctgtc cttcatcagg ggcaaaaccg ccattaccat 1200

taccaacaaa cgcaaagaag actcgggcgg gcgccgcccc agaacacaag tgagaaaaaa 1260

aaaaaaccga cctcctcgcc gacgtgctct tcaagagacc gaccccccgc cgcggcctca 1320

acctatatat tcatccccac ctcctccgtc ctccgctccc acttgatccc gatcgccatt 1380

tctccacctg cacatctgcg cgcgcgcgcg ggagagcaga ggcggcgaga gagatccggg 1440

tcgggagggg tgatggactt ctccggcgac gtcaagccgg cgatccaccg gccctctgtc 1500

gcggcggcac gcgggggagg gaacggtggg gcgatcccgc tcctgcgtgg gtggcaggcg 1560

ttccggagga gcggcgcgcc ggcgaggctc ctctgcttcg agggcggcgc gtgggcggac 1620

gtcgcgggcg aggtggtggg gctgctgcgg cgggcgttca tggaggggaa ggccgtttgc 1680

gaggccgcct gcggtgggag ggtgttcctg ttcgacttca tgcggatggt tcggatcgat 1740

gaggccaccg ccgaggaggc cgcgctgggg tggatcgacg accgcggcgc gtgcttcttc 1800

ccggctcccg agggcgggag gaagaggaag agggagaggg acgaggcggg gtcggaggtg 1860

aagggggagg atcggcggcg gcggcagccg gcggcggagg aggaggacgg ggacgaggcg 1920

tcgtccggcg tggaggagcg gtccggggag agccgccccg aggcggatga gcccgacagg 1980

aagaaggcgc gcgggacgtt gtgggggaag gcggtgaggc tggacgaggc ggacaagttc 2040

tacaaggtgg tggagaagct cttcgtcagc cggatggctc ccgtggcggc ggcccgcggc 2100

gtggcgatca cggcggtgca caaggtcgcg caggggcccc gggcaagagc cttccatctg 2160

cagggacagc tccttgccgc tgctcgcggc gtcggcgatg gcagcaacgc caagttcgcg 2220

tggtacggcg cgccggcggc ggatgtggcc gcggcggtgg agcacggctt cgggaggacg 2280

aacgggcagt ttctcggcgg gcgcgcacac ggcgacggcg ttcacctttc gccgccgcag 2340

taccctcacg ctaggtgagt ttcccaaatg ctttcaactc tttccatctg caaatgcttt 2400

gaactattgg ggagaacatt tttagtaatt tctgaaaatt caccaagtgc ctcatatatt 2460

tcatctttcg atattaccat acgaatcttg agtaaaatta ttttctgcct gccatcttgg 2520

tgctaaacaa tgaaactacc aatcgttgtt ttgcatctaa gtttgaattt agagcaaatt 2580

agacagtatg gtacagtagc tacctaaatt gttataaatt gggatgaaat ttgtgagtca 2640

atgttcaact aagttaacga gttaattaac ttgtcttcga gcagtgcgat gctgaccaag 2700

ccagacgaga atggcgaggc acacatcgtg ctgtgccgcg tcctgatggg ccgtccagag 2760

gccgtccctg ccagctcacc ccaattccac cccagcagcg acgaatacga cagcgccgtc 2820

gacaaccttg agaatccgcg gtggtacgtt gtatggagca cagacatgaa caccaggatc 2880

ctcccagagt acgtggtcag cttcaggtgg cccaacctgc cgcagatgga aggttggtct 2940

ctcgtgtctg aaatttgctg gatggaactg ttcccatttg gcactgccat aacagtgaaa 3000

ctgtggtttt caggatcatc ggggttggga tcgaagctga agaagccatc accagcagct 3060

actcgcgaca tgttccctat gcttctgacg gagatccagc ggttcgttcc atccccgaag 3120

ctgcagactt tgcagaggac gtacaactgc ttcaaggtaa actggtactt cttgctgagc 3180

atttcatttc tagatagatg attgattaga atcttgcgct agcttacaca aaacaacccc 3240

ttcgcgctta tgatcatgcc tgtaagtcaa aatttaatat aagagttgat tttgtggttt 3300

ttttagttgt ttattttacc gcatgaacac gtataaaaaa ggttttacta tacctttttt 3360

tggttaataa attgtttgga taagtaaaag cgaaacaatg ggctgaaaca caactgctga 3420

tctgctaggt gaatttaggc cctgtttaat tcagcttagg attattataa tctggattat 3480

taggattaag ctgaaacaaa taagtagatt attatgttag attattataa tttataagcc 3540

agattactat aatataataa tctcctctag aggagcttag attactataa tctaataatc 3600

tcctctagag aagctttttc tagattattg agtagctaaa gacccactac ccttagatgc 3660

ctctaataat ccagagaaac aaacaactcg tagcttattt tatgttagct tattataatt 3720

cagcttagag taatctgatt taataattta gattacaata atcttaagct gaaacaaacg 3780

gggcattagt cttacatata gttgaacaat tttgctctgc ctggtttgtg ttgtattcag 3840

gtctaactct tcactatacg caataattag cacgtaaaaa tgttgatttg taccgcactg 3900

ctatggtttt aatatgatca tgccgacttt attctgtagt aatatgctgc cgactttatt 3960

ctgtagtaga acagaatcat ctacctgtca atattctgtg caaagcgaat tcagctcagc 4020

ataacggcgt tataacttta agcgaagctg aagtcctgaa aatccaatga cataaatttt 4080

ctttttgttt cagagaggac agatgaagaa ggaccagttc atccggttct tgcgctccca 4140

catcggcgac aatgtgttga ccaccgtggc caagaaactc cgagggtact agtgcaaggt 4200

gcaaatttgt ctccactccg tggctgaatt cgactaactc cgtagaatcg aacagtgcgt 4260

gtcgtgtacc aatcctgaca gggtttattc tcttctgatg ctgctttagt ttttccggtg 4320

ctcaaatgtt tattgtcatg aacatagagg gggtttactg tgatcttcca attaaccaac 4380

acaaaagggt atatgtgata tgatgcaaat tatgcaattc ttgagttcgg tcatagtttt 4440

acttattttc agcaacttgt aatttgtaca gactcgattc tgttgagctt ttgattcagg 4500

aaacaatcaa ttcagtttcg ggagtttacg gagctttgat gtaaaattgt attgttgtct 4560

tttccccgtt ttt 4573

<210> 6

<211> 337

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa L.

<400> 6

gccctgttta gatgggacta aaacttttaa gtccctatca tatcagatgt ttgaaaatta 60

attataaata ttaaacgtag actattaata aaacccatcc ataatcttgg actaatttgc 120

gagacgaatc taatgagcct aattaatcca tgattagcct atgtgatgct acagtaaaca 180

ttctctaatt atagattaat taggcttaaa aaatttgtct cgtgaattag cttttattta 240

tgtaattagt tttgtaagta gtctatattt aatactctaa attagtgtct aaagacagag 300

actaaagtta agtccctgga tctaataacc acctaag 337

Claims

1.BOC1蛋白的应用，为S1)-S4)中的至少一种：

S1)降低水稻愈伤组织褐化；

S2)提高水稻抗性愈伤组织筛选频率；

S3)提高水稻抗性愈伤组织转化效率；

S4)培育愈伤组织褐化降低的转基因水稻；

所述BOC1蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述S1)、所述S2)、所述S3)或所述S4)中，通过向水稻中导入含有序列表中序列5所示的DNA片段实现。

2.编码权利要求1中所述BOC1蛋白的核酸分子的应用，为S1)-S4)中的至少一种：

S1)降低水稻愈伤组织褐化；

S2)提高水稻抗性愈伤组织筛选频率；

S3)提高水稻抗性愈伤组织转化效率；

S4)培育愈伤组织褐化降低的转基因水稻；

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：愈伤组织褐化体现为愈伤组织褐化指数和/或愈伤组织总褐化率。

4.一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中权利要求1中所述BOC1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的愈伤组织褐化降低和/或抗性愈伤组织筛选频率提高和/或抗性愈伤组织转化效率提高；

所述提高出发水稻中权利要求1中所述BOC1蛋白的表达量和/或活性通过向水稻中导入含有序列表中序列5所示的DNA片段实现。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：愈伤组织褐化体现为愈伤组织褐化指数和/或愈伤组织总褐化率。