CN112680460B - 雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用，ZmTGA9有3个旁系同源基因，具有SEQIDNO.1，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，编码的蛋白质具有SEQIDNO.4，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的氨基酸序列。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中同时定点突变ZmTGA9的3个旁系同源基因，创制了tga9‑1/2/3三突变体，突变体可以导致完全的雄性不育，发现了ZmTGA9基因对玉米雄性生殖发育的调控功能。本发明还针对获得的tga9‑1/2/3雄性不育突变体设计了功能分子标记。

Description

雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用

技术领域

本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用。

背景技术

玉米是我国第一大粮食作物，常年播种面积在5.5亿亩以上，玉米种业健康发展对保障国家粮食安全有着重大的战略意义。同时，玉米种业也是全球市值最大、商业化程度最高、科技含量最高的种业领域，是全球种业竞争的战略要地。我国玉米种业与国际领先水平相比，在科技创新和产业模式等方面，仍然存在巨大差距。一是受限于玉米雄性不育基础研究尚未取得根本性突破等因素，导致玉米自交系知识产权保护困难，造成近年来我国玉米种业长期存在跟随性、模仿性育种现象，重大新品种选育效率缓慢。二是玉米制种产业仍然处于依靠人工去雄为主的劳动密集型阶段，成本高，资源消耗巨大，种子质量难以保障。

玉米是杂种优势利用最成功的作物之一，雄性不育系是作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料，主要包括细胞质雄性不育（CMS）和细胞核雄性不育（GMS）。CMS 是由线粒体基因和核基因共同控制的，虽然已应用于玉米育种和杂交种生产中，但存在资源利用率低、不育系胞质单一、易感病等问题。 GMS 由核基因单独控制，可以克服 CMS缺陷，但很难通过常规育种方法大量繁殖纯合不育系。近年来，随着生物技术的进步，通过基因工程和分子设计育种相结合创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，可以有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题。实现上述技术应用的重要前提是获得大量功能明确的控制玉米雄性发育的GMS基因和对应的雄性不育材料。

与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，玉米中已克隆和鉴定的GMS基因和创制的雄性不育材料均相对较少。CRISPR/Cas9（Clustered, Regularly Interspaced, ShortPalindromicRepeats-associated Endonuclease 9）基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定玉米雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富玉米GMS基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用，最终可以有效解决我国玉米种业行业长期面临缺乏稳定的玉米不育系和突破性大品种的瓶颈问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用，可以用来创制玉米雄性不育系，从而应用于玉米杂交育种和制种。

为实现上述目的，本发明提供了ZmTGA9基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述基因包括三个旁系同源基因：ZmTGA9-1，ZmTGA9-2和ZmTGA9-3，所述基因的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示。一般可以预见这些来自不同植物或不同玉米材料中的同源基因具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些基因的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具有控制植物雄性育性的功能。

在另一方面，本发明还提供了根据ZmTGA9基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3所示。

在另一方面，本发明还提供了一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制玉米中ZmTGA9基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株。

在一些实施方案中，上述抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9方法包括：在所述ZmTGA9-2和ZmTGA9-3的第10和第9外显子处，在所述ZmTGA9-1的第二外显子处，在所述ZmTGA9-2和ZmTGA9-3的第10和第9外显子处，在所述ZmTGA9-1的第9外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。

在另一方面，本发明还提供一种获得tga9-1/2/3雄性不育系的方法，将通过上述方法获得的tga9-1/2/3雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得tga9-1/2/3雄性不育的性状和基因突变。

本发明还包括通过上述任一方法获得的tga9-1/2/3雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。所述在杂交育种和制种中的应用是指将tga9-1/2/3雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交，或是将获得的tga9-1/2/3雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得tga9-1/2/3雄性不育的性状和基因突变。

更进一步地，本发明还提供了三种玉米雄性不育系tga9-1/2/3的分子标记引物，引物ZmTGA9-1-F和ZmTGA9-1-R序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO12所示；引物ZmTGA9-2-F和ZmTGA9-2-R序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO14所示；引物ZmTGA9-3-F和ZmTGA9-4-R序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO16所示。

本发明的优点及有益效果如下：ZmTGA9（ZmTGA9-1：Zm00001d052543；ZmTGA9-2：Zm00001d042777；ZmTGA9-3：Zm00001d012294）基因及其编码的蛋白调控玉米雄性生殖发育是之前没有报道过的。本发明通过利用CRISPR/Cas9方法同时突变玉米ZmTGA9-1（Zm00001d052543）、ZmTGA9-2（Zm00001d042777）和ZmTGA9-3（Zm00001d012294）基因，发现了只有ZmTGA9三个旁系同源基因同时突变才能造成玉米雄性不育，而单突和双突则对玉米花药和花粉发育无影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后获得的tga9-1/2/3雄性不育突变体，可以创制玉米雄性不育系，从而可以应用于玉米杂交育种和制种。针对三突雄性不育系tga9-1/2/3开发共分离分子标记，可用于植株的育性基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。

附图说明

图1为ZmTGA9-1、ZmTGA9-2、ZmTGA9-3基因在玉米不同发育时期花药中的表达模式分析

S5，造孢细胞时期；S6, 小孢子母细胞时期；S7，减数分裂开始时期；S8a，减数分裂Ⅰ，二分体时期；S8b，减数分裂Ⅱ，四分体时期；S8b-9，四分体-单核小孢子时期；S9，单核小孢子时期；S9-10，单核小孢子-小孢子空泡化时期；S10，小孢子空泡化时期；S11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；S12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期。

图2为pCas9-ZmTGA9定点突变表达载体的物理图谱

pCas9-ZmTGA9-A：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmTGA9-1基因的靶标（MT2）的表达盒；ZmTGA9-2和ZmTGA9-3基因的靶标（MT1）的表达盒。pCas9-ZmTGA9-B：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmTGA9-1基因的靶标（MT4）的表达盒；ZmTGA9-2和ZmTGA9-3基因的靶标（MT3）的表达盒。

图3为野生型ZmTGA9与其突变体的基因结构和DNA序列分析

野生型ZmTGA9-1（WT- ZmTGA9-1）：基因全长7226 bp，包括12个外显子和11个内含子；ZmTGA9-2（WT- ZmTGA9-2）：基因全长8721 bp，包括13个外显子和12个内含子；ZmTGA9-3（WT- ZmTGA9-3）：基因全长8229 bp，包括12个外显子和11个内含子。tga9三突变体ZmTGA9- 1/2/3-Cas9-1：在ZmTGA9-1基因的第9个外显子3421 bp-3422 bp之间缺失2个碱基（TG）和3635 bp处插入1个碱基（C）；在ZmTGA9-2基因的第10个外显子5587 bp处插入74个碱基和5589 bp处有一个碱基的转换（T到G）；在ZmTGA9-3基因的第9个外显子4354 bp处插入1个碱基（G）。tga9三突变体ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2：在ZmTGA9-1基因的第9个外显子3420 bp处缺失1个碱基（T）和 3636 bp处插入1个碱基（G）；在ZmTGA9-2基因的第10个外显子5372 bp处缺失一个碱基（G）和5586 bp处插入1个碱基（C）；在ZmTGA9-3基因的第9个外显子4354 bp处插入1个碱基（G）。tga9三突变体ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3：在ZmTGA9-1基因的第9个外显子3422 bp-3636 bp之间缺失215个碱基；在ZmTGA9-2基因的第10个外显子的5580 bp-5597bp之间缺失18个碱基；在ZmTGA9-3基因的第9个外显子的4357 bp-4359 bp之间缺失3个碱基（TGC）。

图4为野生型与tga9-1/2/3纯合突变体的雄穗、花药和花粉粒表型分析

上排为玉米野生型（WT）与ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2、ZmTGA9- 1/2/3-Cas9-3三突变体雄穗的表型比较；第二排为WT及与ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、ZmTGA9- 1/2/3-Cas9-2、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3三突变体花药的表型比较；下排为WT与ZmTGA9-1/2/ 3-Cas9-1、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3三突变体花粉粒的I₂-KI染色比较。

图5为野生型与tga9单、双突变体的雄穗、花药和花粉粒表型分析

上排为玉米野生型（WT）与ZmTGA9-1-Cas9-1、ZmTGA9-2-Cas9-1、ZmTGA9-3-Cas9-1单突变体，以及ZmTGA9-1/2-Cas9-1、ZmTGA9-1/3-Cas9-1、ZmTGA9-2/3-Cas9-1双突变体雄穗的表型比较；第二排为玉米野生型（WT）与ZmTGA9-1-Cas9-1、ZmTGA9-2-Cas9-1、ZmTGA9- 3-Cas9-1单突变体，以及ZmTGA9-1/2-Cas9-1、ZmTGA9-1/3-Cas9-1、ZmTGA9-2/3-Cas9-1双突变体花药的表型比较；下排为玉米野生型（WT）与ZmTGA9-1-Cas9-1、ZmTGA9-2-Cas9-1、ZmTGA9-3-Cas9-1单突变体，以及ZmTGA9-1/2-Cas9-1、ZmTGA9-1/3-Cas9-1、ZmTGA9-2/3- Cas9-1双突变体花粉粒的I₂-KI染色比较。

图6为野生型与tga9-1/2/3纯合突变体的花药扫描电镜（SEM）分析

从左至右依次为：野生型（WT）花药整体；三突变体tga9-1/2/3花药整体；剥开后的WT（上）和tga9-1/2/3（下）花药；WT的成熟花粉粒（上）和tga9-1/2/3无法扫描到的花粉粒（下）；WT（上）和tga9-1/2/3（下）花药的外表皮角质层；WT（上）和tga9-1/2/3（下）花药的内表皮乌氏体。

图7为利用共分离标记对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系中的F₂代植株进行ZmTGA9- 1的基因分型

共分离标记ZmTGA9-1-F/R对6株ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系F₂代植株中ZmTGA9- 1基因的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型TGA9-1/ TGA9-1（AA）植株中扩增出80bp条带；在TGA9-1/tga9-1杂合型（Aa）植株中扩增出80 bp和78 bp两条带；在tga9-1/tga9-1纯合突变型（aa）植株中扩增出78 bp条带。

图8为利用共分离标记对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系中的F₂代植株进行ZmTGA9- 2的基因分型

共分离标记ZmTGA9-2-F/R对6株ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系F₂代植株中ZmTGA9- 2基因的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型TGA9-2/ TGA9-2（BB）植株中扩增出409 bp条带；在TGA9-2/tga9-2杂合型（Bb）植株中扩增出409 bp和335 bp两条带；在tga9- 2/tga9-2纯合突变型（bb）植株中扩增出335 bp条带。

图9为利用共分离标记对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系中的F₂代植株进行ZmTGA9- 3的基因分型

共分离标记ZmTGA9-3-F/R对7株ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系F₂代植株中ZmTGA9- 3基因的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型TGA9-3/ TGA9-3（CC）植株中扩增出64 bp条带；在TGA9-3/tga9-3杂合型（Cc）植株中扩增出64 bp和65 bp两条带；在tga9-3/tga9-3纯合突变型（cc）植株中扩增出65 bp条带。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一玉米TGA9（Zm00001d052543，Zm00001d042777和Zm00001d012294）基因序列和表达模式分析

在maizeGDB 库（https://www.maizegdb.org/）中，查询到玉米TGA9共有3个旁系同源基因，分别为ZmTGA9-1（Zm00001d052543，GRMZM2G030877）、ZmTGA9-2（Zm00001d042777，GRMZM2G060216）、ZmTGA9-3（Zm00001d012294，GRMZM2G168087），在B73中的核酸序列分别见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。ZmTGA9-1（Zm00001d052543）基因功能注释为bZIP79转录因子（bZIP-transcription factor 79，bZIP79)，其编码蛋白包含486个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示。ZmTGA9-2（Zm00001d042777）基因功能注释为bZIP11转录因子（bZIP-transcription factor 11，bZIP11)，其编码蛋白包含650个氨基酸，序列如SEQ ID NO.5所示。ZmTGA9-3（Zm00001d012294）基因功能注释为bZIP90转录因子（bZIP-transcription factor 90，bZIP90)，其编码蛋白包含534个氨基酸，序列如SEQ ID NO.6所示。

bZIP类转录因子参与植物中众多生理过程的调节，由于ZmTGA9基因在玉米中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系，本发明首先利用qRT-PCR分析了该基因在玉米花药发育不同阶段的表达模式。具体步骤如下：

1、玉米花药的取样与发育时期鉴定

从玉米自交系B73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。

利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。

2、qRT-PCR分析

用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix（ABM，加拿大）合成cDNA；采用TBGreen™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5QuantStudio 5 Real-Time PCRSystem （ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，扩增引物为：qTGA9-1-F（5’-CTGCTTCCTCTGGATGGGTG-3’）和qTGA9-1-R（5’-TTCCTCTGCCTGCTGTGATG-3’）；qTGA9-2-F（5’-GGAAGAGCAGGCTGAGGAAG-3’）和qTGA9-2-R（5’-CTCATGCTCGACCTGCTGAA-3’）；qTGA9-3-F（5’-CAGGGGAATTCGCAGTCAGT-3’）和qTGA9-3-R（5’-CCATCAGCGGTCACCATCAT-3’）；ZmActin1为参照基因，其扩增引物为：Actin1-F（5’- AAATGACGCAGATTATGTTTGA-3’）和Actin1-R（5’-GCTCGTAGTGAGGGAGTACC-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2^-ΔΔCt方法进行分析，并以均值±标准差（Means±SD）的形式给出定量结果。

ZmTGA9基因呈现花药发育时期特异表达的模式：ZmTGA9-1、ZmTGA9-2和ZmTGA9-3在玉米花药发育的早期比如S5时期都有较高表达，随后开始减弱，并一直维持较低的表达水平。

实施例二玉米TGA9基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法创制玉米雄性不育系

为了明确ZmTGA9-1（Zm00001d052543）基因、ZmTGA9-2（Zm00001d042777）基因和ZmTGA9-3（Zm00001d012294）基因在玉米中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法同时突变Zm00001d052543、Zm00001d042777和Zm00001d012294基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米杂交种HiII 作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因保守区的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域。

1、ZmTGA9的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为pBUE411-MT1T2-Cas9，该载体的基础载体为pBUE411- Cas9，中间载体为pCBCmT1T2，提供gRNA。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过酶切连接到基础载体中，具体的构建流程如下：

（1）靶标gRNA的设计。将ZmTGA9（Zm00001d052543，Zm00001d042777，Zm00001d012294）的基因序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR进行靶标设计。本发明选择的四个靶标区域DNA序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。本发明的sgRNA骨架序列从中间载体pCBCmT1T2直接扩增获得。

（2）通过在引物上设计靶点然后PCR扩增获得MT-sgRNA。引物ZmTGA9-MT1-F和引物ZmTGA9-MT2-R扩增中间载体pCBCmT1T2，用于获得包含第一个和第二个靶标的sgRNA的片段，同样的步骤使用引物ZmTGA9-MT3-F和引物ZmTGA9-MT4-R用于扩增获得包含第三个和第四个靶标的sgRNA的片段，产物长度均为891bp。PCR 体系和条件如下：模板DNA （中间载体pCBCmT1T2≥30ng/μL）1.2μL；Primer F/R：各1.2μL；灭菌ddH₂O：11.4μL；2X MCLAB 酶（产品编号：I5HM-200）：15μL。PCR的温度程序如下：①98℃ 2分钟；②98℃ 10秒；③58℃ 30秒；④72℃ 30秒；⑤从②－④循环34次；⑥72℃ 5分钟；⑦25℃ 10分钟。最后回收PCR产物。载体构建所需的引物序列如下：

ZmTGA9-MT1-F:5’-ATATATGGTCTCTGGCGATACTCCATGTCGAACATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’

ZmTGA9-MT2-R:5’-ATTATTGGTCTCTAAACTGAATGGCTAGAACTACTATGCTTCTTGGTGCCGC-3’

ZmTGA9-MT3-F:5’-ATATATGGTCTCTGGCGAATCCAGAAGAAGCAGCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’

ZmTGA9-MT4-R:5’-ATTATTGGTCTCTAAACCCATGTTTGACGTGGAGTATGCTTCTTGGTGCCGC-3’

（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将pBUE411-Cas9载体和回收的带有靶标的sgRNA片段用BsaI消化，同时加入T4连接酶将载体和sgRNA片段连接。15μL的酶切连接体系如下，sgRNA片段：2μL，pBUE411-Cas9载体（≥60ng/μL) ：2μL，10x NEB Buffer：1.5μL，BsaI内切酶（产品编号：#R3733S ）：1μL，T4 连接酶（产品编号：#M0202M ）：1μL，灭菌ddH₂O：6μL。

图2所示为目的基因ZmTGA9-2（Zm00001d042777）和ZmTGA9-3（Zm00001d012294）的靶标（MT1），ZmTGA9-1（Zm00001d052543）的靶标（MT2）,标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411-Cas9构建的表达载体pCas9-ZmTGA9-A；以及目的基因ZmTGA9-2（Zm00001d042777）和ZmTGA9-3（Zm00001d012294）的靶标（MT3），ZmTGA9-1（Zm00001d052543）的靶标（MT4）,标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411-Cas9构建的表达载体pCas9-ZmTGA9-B。

2、农杆菌介导的玉米遗传转化

将上述构建的pCas9-ZmTGA9-A和pCas9-ZmTGA9-B载体分别通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定；然后以1:1的浓度混合分别含有两种敲除载体的农杆菌，混合后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的玉米杂交种HiII的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

3、T₀代植株CRISPR/Cas9突变结果检测

为确定T₀代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：

本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2mL离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入700μL CTAB提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1-2次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4℃条件下，以12000rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5mL离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10min左右；随后将盛有样品的离心管放入4℃离心机中，以12000rpm速度离心10min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800μL 75 %乙醇，洗涤沉淀两次，以10000rpm速度离心5min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到DNA沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解DNA。DNA样品存于-20℃保存。用Nanodrop检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。

然后根据ZmTGA9-1（Zm00001d052543）基因序列设计PCR引物。

（1）检测靶标：MT2；产物大小：318bp；引物序列如下：

ZmTGA9-1-T-F1:5’-ACCAGCAGATTTCAATGACGTT-3’；

ZmTGA9-1-T-R1:5’-AAAGAGATGGCAAACAGAATACCGAGA-3’。

（2）检测靶标：MT4；产物大小：363bp；引物序列如下：

ZmTGA9-1-T-F2:5’-CTTCAGCTGTGTACATACCAACTGCC-3’；

ZmTGA9-1-T-R2:5’-ACGAATCCATACCTTGAGCAGATCGGAG-3’。

根据ZmTGA9-2（Zm00001d042777）基因序列分别设计PCR引物。

（3）检测靶标：MT1和MT3；产物大小：518 bp；引物序列如下：

ZmTGA9-2-T-F1:5’-AAAACGTGTGCTGCCAACTGACT-3’；

ZmTGA9-2-T-R1:5’-TCCGCTTGCTCCGACGACT-3’。

根据ZmTGA9-3（Zm00001d012294）基因序列分别设计PCR引物。

（4）检测靶标：MT1和MT3；产物大小：650 bp；引物序列如下：

ZmTGA9-3-T-F1:5’-ACCGTCCGTACATCCGCTTCCT-3’；

ZmTGA9-3-T-R1:5’-CGCCTGCTCCGACGACTGCT-3’。

提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：

反应体系：15μL MIX常规PCR体系，0.5μL forward primer，0.5μL reverseprimer，1μL DNA，5.5μL 灭菌ddH₂O，7.5μL 2x taq mix（产品编号：10103ES ）。

反应程序：常规PCR：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。

接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T₀代独立阳性转化事件靶标区域的DNA序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现3个T₀转化事件的三个基因的靶标区域序列都发生了变化，且均为同源突变，编辑前后的序列如图3所示，对应3个tga9纯合三突变体：ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3。与野生型序列比对显示ZmTGA9-1-Cas9-1/2/3在靶标4处发生了插入和缺失突变，ZmTGA9-2-Cas9- 1/2/3在靶标1处发生了插入和缺失突变，而ZmTGA9-3-Cas9-1/2/3在靶标3处也发生了缺失和插入突变。

对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1突变体氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变体中的ZmTGA9-1基因在靶标4处的发生插入和缺失突变，使其氨基酸发生了移码突变，且随后的氨基酸发生提前终止；ZmTGA9-2基因在靶标1处的发生插入突变，使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止；ZmTGA9-3基因在靶标3处的发生插入突变，也使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止，因此该突变体中三个TGA9基因的蛋白的功能均表现缺失。对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2突变体氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变体中的ZmTGA9-1基因在靶标4处的发生插入和缺失突变，使其氨基酸发生了移码突变，且随后的氨基酸发生提前终止；ZmTGA9-2基因在靶标1和3处发生插入和缺失突变，使得翻译出的第406至490位共计73个氨基酸全部发生改变；ZmTGA9-3基因在靶标3处发生插入突变，使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止，因此该突变体中三个TGA9基因的蛋白的功能均表现缺失。对ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3突变体氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变体中的ZmTGA9-1基因在靶标4处的发生大片段的缺失，使其氨基酸发生了移码突变，且随后的氨基酸发生提前终止；ZmTGA9-2基因在靶标3处发生缺失突变，使得发生了6个氨基酸的丢失；ZmTGA9-3基因在靶标3处发生缺失突变，使得发生了1个氨基酸的丢失，因此该突变体中三个TGA9基因的蛋白的功能均表现缺失。

4、F₁代植株的基因分型

由于在温室生长的玉米T₀代植株，经常雌穗和雄穗发育不协调，同时当编辑的基因与雄性发育相关时也会影响育性，因此为了繁殖T₀代植株，并使获得的基因编辑类型遗传下去，本发明使用玉米自交系郑58的野生型花粉为上述获得的ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、 ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2和ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3的T₀代植株授粉，进而获得F₁代种子，生长的植株为F₁代植株。

F₁代植株包括2种分离类型，一种为Cas9-阳性植株（转基因植株），另一种为Cas9-阴性植株（非转基因植株），为了避免sgRNA和Cas9对杂交授粉引入的郑58野生型等位基因进行持续编辑，从而造成突变类型的复杂性，我们需要通过基因分型从F₁代植株中挑选出不含有Cas9基因，但含有T₀代突变类型的植株，这类植株自交后可以得到非转基因的F₂代。F₁代植株的基因分型步骤如下：

按照上述的CTAB法提取叶片DNA后，首先利用Cas9基因的特异引物Cas9-F（5’-CCCGGACAATAGCGATGT-3’）和Cas9-R（5’- GAGTGGGCCGACGTAGTA-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系同上；反应程序：常规PCR：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据结果区分出Cas9-阳性植株和Cas9-阴性植株。

进一步针对Cas9阴性植株，采用上述的检测MT1靶标的引物对ZmTGA9-2-T-F1/R1和ZmTGA9-3-T-F1/R1，检测MT2靶标的引物对ZmTGA9-1-T-F1/R1，检测MT3靶标的引物对ZmTGA9-2-T-F2/R2和ZmTGA9-3-T-F2/R2，以及检测MT4靶标的引物ZmTGA9-1-T-F2/R2进行PCR扩增； PCR产物纯化后，连接T载体，进行测序；根据测序结果分析确定T₀代突变类型的遗传情况。

实施例三tga9-1/2/3三突不育系的表型分析

上述实施例二鉴定的不含有Cas9基因的F₁代植株自交后获得F₂代种子，三种tga9三突类型（ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2和ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3）各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。三种F₂株系中，tga9单突和双突变体均表现可育（图5），只有tga9三突变体表现不育（图4），可育株与不育株的比例，均符合63:1分离，进一步表明tga9-1/2/3三突不育系的不育性状由3个隐性基因共同控制，然后针对F₂代获得的稳定非转基因tga9-1/2/3三突不育系与野生型进行详细的表型比较。

1、雄穗、花药和花粉活力的观察

在营养生长和雌穗的发育方面，tga9-1/2/3三突不育系（ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1、ZmTGA9-1/2/3-Cas9-2和ZmTGA9-1/2/3-Cas9-3）的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而tga9-1/ 2/3三突不育系虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药明显较小，并且干瘪不外露（图4）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I₂-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图4）这表明ZmTGA9基因（ZmTGA9-1、ZmTGA9-2和ZmTGA9-3）控制玉米的雄性发育，通过基因编辑方法创制的tga9-1/2/3三突不育系为无花粉型不育系，呈现完全败育的特点。

2、花药的扫描电镜（SEM）观察

为了深入解析tga9-1/2/3的细胞学特征，对野生型和突变体花药内外壁进行扫描电镜（SEM）分析。剥取处于成熟期（S13）的野生型和突变体花药，然后立即固定在FAA（Coolaber，中国）溶液中，固定液的体积不少于所取研究材料体积的20倍；对于突变体花药，可用解剖针在花药壁穿孔以提高固定液的渗透效果，或者反复抽真空至花药沉入固定液底部；室温固定2小时后，将材料置于4℃保存，或依次置于50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中进行脱水，每个梯度保持15分钟；材料可置于70%的乙醇中过夜或保存。脱水后的样品进行二氧化碳临界点干燥，然后镀金即可进行观察。发现tga9-1/2/3的花药外表的网状角质层结构相比于野生型更加稀疏；并且tga9-1/2/3的花药内表皮也没有致密的颗粒状的乌氏小体形成（图6）。花药角质层是覆盖在花药表面的细胞外脂质层，保护花药免受外部非生物胁迫、内部组织失水和病原体的侵袭，位于花药内壁的乌氏体，被认为是孢粉素前体从绒毡层细胞到小孢子的转运载体。上述结果表明ZmTGA9-1（Zm00001d052543）基因、ZmTGA9- 2（Zm00001d042777）基因和ZmTGA9-3（Zm00001d012294）基因同时突变后，可以影响花药角质层的形成和阻断绒毡层内孢子花粉素前体物质的合成。

实施例四ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系鉴定的共分离分子标记开发和应用

1、共分离分子标记的开发

在本发明中，针对获得的ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1不育系的三个基因的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出三对共分离分子标记：ZmTGA9-1-F/R、ZmTGA9-2-F/R、ZmTGA9-3-F/R，结合PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。

共分离分子标记ZmTGA9-1-F/R包括第一引物ZmTGA9-1-F和第二引物ZmTGA9-1-R；该标记能够特异性检测玉米ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因tga9-1，并能同时区分野生型TGA9-1基因和突变型tga9-1基因；针对突变基因tga9-1中扩增出78bp的条带，而对野生型TGA9-1基因扩增出80 bp的条带。引物序列如下：

ZmTGA9-1-F：5’-CGAGTGACGAGTGGTGTACG-3’

ZmTGA9-1-R：5’-CCGGCTGTGGTTGTCCAG-3’

共分离分子标记ZmTGA9-2-F/R包括第一引物ZmTGA9-2-F和第二引物ZmTGA9-2-R，该标记能够特异性检测玉米ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因tga9-2，并能同时区分野生型TGA9-2基因和突变型tga9-2基因；针对突变基因tga9-2扩增出409 bp的条带，而对野生型TGA9-2基因扩增出335 bp的条带。引物序列如下：

ZmTGA9-2-F：5’-TGGGACTCATCGTGGAGGAGTGC-3’

ZmTGA9-2-R：5’-TCCGCTTGCTCCGACGACT-3’

共分离分子标记ZmTGA9-3-F/R包括第一引物ZmTGA9-3-F和第二引物ZmTGA9-3-R，该标记能够特异性检测玉米ZmTGA9-1/2/3-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因tga9-3，并能同时区分野生型TGA9-3基因和突变型tga9-3基因；针对突变基因tga9-3中扩增出65 bp的条带，而对野生型TGA9-3基因扩增出64 bp的条带。引物序列如下：

ZmTGA9-3-F：5’-CTCACCGGCTCCTGGACC-3’

ZmTGA9-3-R：5’-ACGGGCGGAAGCCTCC-3’

2、共分离分子标记的应用

为了验证上述标记的有效性，以实施例三中获得的F₂株系(ZmTGA9-1/2/3-Cas9- 1)为材料，进行TGA9-1、TGA9-2和TGA9-3基因的检测。DNA提取方法、PCR扩增体系和条件同实施例二，PCR产物进行PAGE或琼脂糖凝胶电泳分离。

理论上，ZmTGA9-1-F/R、ZmTGA9-2-F/R和ZmTGA9-3-F/R在TGA9-1/2/3/TGA9-1/2/3纯合野生型（AABBCC）DNA中分别扩增出80 bp、335bp和64bp的条带；在tga9-1/2/3/tga9-1/ 2/3纯合突变型材料（aabbcc）DNA中分别扩增出78 bp、409 bp和65 bp的条带；而在TGA9-1/ 2/3/tga9-1/2/3杂合型（AaBbCc）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ZmTGA9-1-F/R、ZmTGA9-2-F/R和ZmTGA9-3-F/R分子标记的验证结果如图7、图8和图9所示，结果显示设计的3个功能性分子标记对F₂植株的检测结果完全符合预期，在TGA9-1/TGA9-1、TGA9-2/ TGA9-2、TGA9-3/TGA9-3纯合野生型和TGA9-1/tga9-1、TGA9-2/tga9-2、TGA9-3/tga9-3杂合型和tga9-1/tga9-1、tga9-2/tga9-2、tga9-3/tga9-3纯合突变型材料中分别扩增出对应大小的条带，可以作为TGA9-1，TGA9-2和TGA9-3基因检测的理想标记。

这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

序列表

<110> 北京科技大学

北京中智生物农业国际研究院

北京首佳利华科技有限公司

<120> 雄性不育基因ZmTGA9及其在创制玉米雄性不育系中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6332

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

atgggggata ctagtagttc tagccattca aggcaggatc cttctcttct tggctatggc 60

ttccatggcg ccatcgccaa ctccactcct cctgcaaact tcttgtaaga acacatacca 120

gatatgattt gtgcatctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctcg 180

gtattctgtt tgccatctct tttttgtctt ttggcgacca agattttatt taatacaaaa 240

ttaaagttga atgagttgca ccttgcacgc acttcatgtt caagttcata catatttgag 300

catgctgtaa aacggtttaa aattccccaa gtaatcgatc tctagtgttt ttttctctct 360

ctctctctct ttacaaagat ggttactata cttgccgtct tacatgcatg gaacagtgac 420

caaggaggag gaggcaccta tttcggagag ctggaagaag cgttcatgca tcaggtcgcc 480

tcgctcagaa gaactcaaca ggctgcaacc gtctctgcac ctcatcatgg agacaccaag 540

cgtacgccaa ccctacccca cccttctttc tcagcctctc tctgaccaag gccaagagag 600

cacacaaccg tttctctctc tctcctctgg ctggccaagg ccaagaatac acaacgatgt 660

gaggcgcttt tacagtaggt tagggcatcc tagtcaaaag taaccatgca agagcagcag 720

gagtggcagt tgtgctgcag gcgctgcagc tgtacagctt gtgtgtgtgg tgttgtgact 780

gccttctcct tgtgattcct ctctctctct ctctagagtg caacaagtat ccatggcagt 840

acagcagtac cacactacca actctgcagg cacaagctca aagggaataa agctcagctc 900

actttcactg ccacagtggc cccctacttc ccttgtgatc ccaatgcatc ctttcagttt 960

cacctctgga acacggatac atgtgttgat ctcctctctc ctcccctatg atatctcctt 1020

gcagcctttc ccactgctgc tggtgctaca gctgcaacgg ctacggctac ggctaggcca 1080

cctcctacac tggacatctt cccagcttgg cctatgaggt ctcgtcttca cacgcccaag 1140

gtatggagtg gagactggcc gctagctaca acttgtatat agagtttatt ttatctcttc 1200

tgttcacatc atatatatac agacgacagt accagcaagc aagaacaaaa gtttgcaact 1260

gctctccctt tttttttctc tcaccctttt gcacgtcagg agtgctcgaa tgtgacagca 1320

gacagcacag acgactcgga gagcagcagc aagaaccaca gcaaccactc ctcagaccag 1380

ctcggagcag cagcagcagc aaacatggcg agccagttcg agcaagcttc acagcagcag 1440

cttcagcaca aagtatgtat catcccacat gatgtccttt ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1500

gcatttcttc ttctttggtc ttttttattt gccttctcca attcatcgat ccgtttctct 1560

tgtgccttag ctcatggact cgtgttccct atcatggctt catgtcgctg cctagcccac 1620

aaaaggccac aactaccgag atgctcgtat atatatatgc agctactaat aaagctatta 1680

gctacatact acgctcgcct attggtagaa taacgcatta ttcaagggca tttatgatct 1740

tgctcctccc aagatcgcca atcccaacac gttaggtgtg aatcttttgg cccctatata 1800

gaaataatag aacattttct agctacttgc ttcttccatt atgcttctta caaaaacaat 1860

atcatccgga aagaattgtg gataagtagt ctagaaggct atgtatgtag gggatatgtt 1920

agatcaacga tggacaaaaa aaagttgttc atctaaaaca agaaccagtc aatccagatc 1980

agctgtattt cgctataggc tgctgctatg gataagtagt ctagaaggct atgtatgtag 2040

gggatatgtt aggtcgttag tgcaggatag atcatgtagt actgccatta attagtgccg 2100

caacacaaga caattttagc gttcttacaa tattgtttcc tcactagctt acgaaattgt 2160

gccctaatag aaaaagcgcc gacgtatact aataattaat aaaccatctt acttgcatag 2220

tggcagcttt tggggtcagt ggtgctggtt taggtatata ctttctggcc gattcatcaa 2280

ctgccaatga tatatatatt aattatatga accgaatgat tcacgcttga accgaaataa 2340

gcgttgcagc agcaggttag tagggcgtgt gacagcggca taaacaaaaa ggcaaaacta 2400

cgtttttgtc tgttgtgtta attaatagtg gtgggtggat tccaccaaat gcacaccact 2460

gtgttttttt taaaataaaa aaaataatcg tgttcaggtt tgctaacctg catgtccatg 2520

cctactttgc tgtgcagaat atggctacaa gttccactcc aagaactggc aaggctcttg 2580

atccaaaggt ctttctctac tggttattct gctacttacc tttttttaca gcagtgcatg 2640

ttcgtctcat ggtgctgcat tcagtttaca atgtgtctga aggatttgaa gaccccaccc 2700

ccagatagtg gatgggcttt tttttacata ttgtatgtgt caacaggtaa tcagaaggct 2760

ggctcagaat cgtgaggctg cacgcaaaag ccggctgcgg aagaaggtga tgtctgggca 2820

tcagctagat tatgcagact caagttcttg tcagcggtga cttcaaataa aacaagttac 2880

tgacagttaa attttttcga tgtgccatag gcgtacattc agcagctcga gagctgtaag 2940

ctgaagcttt ctcagatgga acaggacatg cagcgagccc gtacccaggt tcacttccta 3000

gttcctaccc cttcagcttt gtttgggtac tctagtattg acctcaatcc acatgtattg 3060

agctaaattg agatttcact taaattaatt tacatcctaa tctacctcaa cacacatatg 3120

gattgaggat ttgaggtcaa tattagagta accaaacaaa accttctgtt tccctgttag 3180

cttctgactg aacatctcaa attctgcacc gatggaaata tgaagttctg tgtgtcctgt 3240

cctaaacctt tcagggcctc tttcttggag gagatccggg tgcaagcacc agttcaggtg 3300

cctcatctga tgatacattt ctcggcgttc tcttcagctg tgtacatacc aactgccacg 3360

gtatgccatt tctctctgac tgacgagtga cgagtggtgt acgtgtccag gtgccgccat 3420

gtttgacgtg gagtacgccc ggtggctgga caaccacagc cggcgcctgg ccgagctgaa 3480

cggagcccta cacgcgcacc tggcagacgg tgacctcaga gccatcgtcg acgacgccct 3540

cacccaccac gacgagctgt tccagctcaa ggccatggcg gccaaatccg acgtgttcca 3600

cctcatcact ggggtgtgga cgacccccgc cgagcgctgc ttcctctgga tgggtggatt 3660

caggccctcc gatctgctca aggtatggat tcgtttcagt actctgagat agaacatcag 3720

atatcaaaaa aaatgtgtgc atgcacaagg taggctgaca ctgactggag cagggaactc 3780

aggcggtgtt actttttcat tactaagatc acaagaactg ttccaatgta aatcagattt 3840

ccccttagta caagaagaat ttgcagttcc aataaagtat acgaaattcc attctgttgc 3900

agacactgct gccccagcta gatccactga cagagcagca agtggtcggc atatgcagcc 3960

ttcagcagtc atcacagcag gcagaggaag ctctctcgca gggcttggag cagctgcatc 4020

agtcgcttgc tgacaccatg gccggtgggt ctctgactga cgacgccaac atgagcttca 4080

tgagccaaat ggctcttgcc ctcggcaaac tggccaacct tgaaggcttt gtgatacagg 4140

ttatgggttc tcaccaaatc tagaatctca aatcaatatg ttactatgac agtgtcatag 4200

gtactccgta gatagatcct acacacgatc tgggctccct atgatattcc tcattccact 4260

caactataca gatgagctat ggaatattgg attgaaataa attggtgcag caataacacc 4320

atattcaggg caaccccatg catctggtca aacctgcatc gtagactcgt agtaaatcgt 4380

gttagttaca actagtgccc ctaaataagc aactgtttca aaattttaaa tctacagaat 4440

ttgcagcaca tcatctaacg ccatgccatc aatattgatg tttgatgtat atacaaacaa 4500

atggctcgtc aactaaccat gtaacgataa tggagttttg gaatgcatct ttatataagt 4560

ataatcaaaa cacagggtag ccaaaggcct attgatcagt agtgattact taactaggac 4620

tatttaaatt agtagagacg ccaataataa tgttcttgga gcatgtgcta aaagctacat 4680

gtttaatttt caggccgata acttgaggca acagactctt catcagatgc accggattct 4740

gacagttcgg caggcagctc gatgtctctt ggcaattggc gagtaccaca accgccttcg 4800

tgccttaagt tccctctggg cttctagacc tcgagagtaa gcaccgtgca gttcctatgt 4860

catcccctat ctttagtcga tttatttaat aaagaagtgt ccaatctcta gttgttgaag 4920

gtagtattca ctaatgaata atgattggac aaaatcaagt gcatattaaa tattaataca 4980

agagtgaccc agggttccat gctaaactaa taccaagatg tgccctacta aatcagcagg 5040

gaatggacaa ccttccgatc agcaatcaaa actcaaaagt cagcaaccaa ccatgacaaa 5100

aaataaagtc catattccct taaaaagggg gggacatgcc atgacataag aaacaaggaa 5160

taaagattga tttctgatac tttctctaga tgcctgtcca accaactgaa ttctacaaaa 5220

ctcaaattag atgaatggct atagcagata cttccaatat gcttctctca acaacaacaa 5280

caacaataaa gcattttagt ccaaacaagt taggatagac taaagttaaa aacccagtaa 5340

gtcaaggttc gggcatatat ggatagctgt ttttcatgca ctcatattta aggctaaatc 5400

tctggatata tttcatcctt ccaagtcttt ttttactgac tcttcctatg ccaacttcga 5460

tcttcctctc cggtcttcca ctcttctcat tgctatctcg ccttaggatc ctactatgca 5520

ccggcgtctc tggaagtcta cgttggatat gtccaaacca tctcaactga tgttgaacaa 5580

acctatcacg tatatcatca ttccggactc gatcctttct tgtatagcca taaatccaac 5640

gcaacatacg tatttttgca acacttatct actgaacatg tcgtattttg tgggccaaca 5700

ttctgcatca tacaacatag caggtctaat cgttgtccta taaaactgtc ttttagcttt 5760

tgtggtaccc tcttgtcata tagaacgcta gatgcttgac gtcacttcat ccattttgct 5820

ttgagtatat ggctaacatc ttcattaata tccccgtctc tctgtatcat tgaccctaaa 5880

tacctaaaga tgtcattcct aggcactact taaccttcca aactaatatc tgcttcctca 5940

tgtggtgtcg aaatcaatct gactagagtg ttggtcacta ctgcagatca cgcgtaagac 6000

taaatcaacc atgacaagct tgacataatc ttgtctcctt gcctcctcac atccaccaca 6060

ccgttcttga gattcttctc aatcaaaact tgtactccat ttctgtttgt agctttccct 6120

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tctctgggcc ggccatctct tttatattcc ttttttttaa aaaaaactta tttttattct 5400

ctcccttttg tttgctggtg cctcactgcc tctgcagaac atagcgccca caaccaacat 5460

actgctccct ctgtcttata aataatgagt atctttttaa agttttgggt acaggatcaa 5520

aaaaaattaa aaatatataa tgcatataaa gatatgaaga aatgtagaga tgtattaata 5580

aaaaaataag tatgtattca aaagtgagaa tgacacttgt tcttaagaca aacacatgaa 5640

gctagaatga tgtttttatt ttaaaactaa agaagtagaa tactagaggc cttactcatg 5700

gtgttccatg tcttgcaaaa gttaaggttc aatccatgca tagtggtcag gaaaaggaca 5760

cacccaccta aaattcagtc ccatggacaa caagtagcct aaaaataaag attgggcttg 5820

ctgttccacc agaagttctt aaagaaatga gcatggcttt ctatggatta tcttctctct 5880

catgggggta aaagctgatt gcgacctcca ttttgttagt ttgatttcaa ctttcctgag 5940

ctttgattcc ttctgtggac agaaattggc tagaaggcag attacaaata agtacacttt 6000

taacatttaa aatttattct agaataagta tttcagatca tggaccgcct tgttttggta 6060

ggttttacta ctctccattt tctaaagtgc aattaataga gcatcttttg tccactctca 6120

ttcattatcc ccataaacct gtcatattag gggagatgga ctctgtttct tgctctcact 6180

ttttgttttg gtgataaaaa actcttcggc tctctttaaa taaacgagaa attacatctc 6240

ccccactagc atggaaccca cccaatactc tctgctaact acccacaacg gaggccaaag 6300

gccatggcta caacttggca tgcaccctaa cccttgtccc cgctcaacaa ggactggcgc 6360

gcgtcgcaac tcgcaagagt actttctagc gttgcgttag agagagaaag gaaaataaat 6420

aaataaatta tgatctgata ggtaggttcc acatattttg aaggagattg ttggctatct 6480

gctgcagcat ctctcctaat tcatgattag ggagctgctg gagatactct aagcaacttt 6540

tgataaaggt atatatatgt aattttataa ggatggggaa gtatgcttcc taattcatga 6600

ttggagcaat catttcacac aaagcattgc aataaaggtg catatgaaaa agacttgcaa 6660

taaacacgat cacagacgat ataccacagc ctcgcttttt tctctctctc tctcttttca 6720

ggatagaggc tgtgtatagc taatacttaa tttagattcc ttttcatgct ctagaagtat 6780

ataacactac aaggaaatga caaggacaat acaccatcag taggaaaaag aattgctaca 6840

ctatctaaag tccaaacttt gctgaaaaca acatttcatt agattaagct taagcagcag 6900

ctgggaactt tcagcgattg tccaggatag aatatatctg ggacaagaca gaaagacagc 6960

actagaatag gatccgagag tgccctgtca ttcaagatgt tggaaacgcc aatgcgcagt 7020

atagccaaga caagaaacaa cgctaatgtg acatctcacc tttctttttc atgtgtgttg 7080

ctacaaccgc aggccgacaa tctaaggcag cagacgttgc atcagatgcg ccgcatcctg 7140

accactcggc aggctgcgcg gtgcttcctc tctattgggg agtactacag ccgccttaga 7200

gctctcagca acctctgggc ttcccgtccc ggcgagtatg tttcacaagc ttgatcacct 7260

gcaaaaactt gactctccat tagtgtcatg ttgatcaact gcactgtggc tgttcccaac 7320

catgtctgaa tcacatgtat tccttcattt ttttttaaag atagggtcac ctgttttcgg 7380

aattcattat atgaaaaaag tcagaaatgg acgtggctga caatgacatg tatttctcgt 7440

gtaacagcac cttcatcagg tcagagagcc tcagccccac agcaacggaa ctgcaagccc 7500

tgcaccacca gcggcagaat cagttcagcg gattttga 7538

<210> 4

<211> 486

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

Met Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ser His Ser Arg Gln Asp Pro Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gly Tyr Gly Phe His Gly Ala Ile Ala Asn Ser Thr Pro Pro Ala

20 25 30

Asn Phe Phe Asp Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Gly Glu Leu Glu

35 40 45

Glu Ala Phe Met His Gln Val Ala Ser Leu Arg Arg Thr Gln Gln Ala

50 55 60

Ala Thr Val Ser Ala Pro His His Gly Asp Thr Lys Pro Phe Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Pro Pro

85 90 95

Pro Thr Leu Asp Ile Phe Pro Ala Trp Pro Met Arg Ser Arg Leu His

100 105 110

Thr Pro Lys Glu Cys Ser Asn Val Thr Ala Asp Ser Thr Asp Asp Ser

115 120 125

Glu Ser Ser Ser Lys Asn His Ser Asn His Ser Ser Asp Gln Leu Gly

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Ala Asn Met Ala Ser Gln Phe Glu Gln Ala Ser Gln

145 150 155 160

Gln Gln Leu Gln His Lys Asn Met Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Thr

165 170 175

Gly Lys Ala Leu Asp Pro Lys Val Ile Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg

180 185 190

Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Ile Gln Gln

195 200 205

Leu Glu Ser Cys Lys Leu Lys Leu Ser Gln Met Glu Gln Asp Met Gln

210 215 220

Arg Ala Arg Thr Gln Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asp Pro Gly Ala Ser

225 230 235 240

Thr Ser Ser Gly Ala Ala Met Phe Asp Val Glu Tyr Ala Arg Trp Leu

245 250 255

Asp Asn His Ser Arg Arg Leu Ala Glu Leu Asn Gly Ala Leu His Ala

260 265 270

His Leu Ala Asp Gly Asp Leu Arg Ala Ile Val Asp Asp Ala Leu Thr

275 280 285

His His Asp Glu Leu Phe Gln Leu Lys Ala Met Ala Ala Lys Ser Asp

290 295 300

Val Phe His Leu Ile Thr Gly Val Trp Thr Thr Pro Ala Glu Arg Cys

305 310 315 320

Phe Leu Trp Met Gly Gly Phe Arg Pro Ser Asp Leu Leu Lys Thr Leu

325 330 335

Leu Pro Gln Leu Asp Pro Leu Thr Glu Gln Gln Val Val Gly Ile Cys

340 345 350

Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Ser Gln Gly

355 360 365

Leu Glu Gln Leu His Gln Ser Leu Ala Asp Thr Met Ala Gly Gly Ser

370 375 380

Leu Thr Asp Asp Ala Asn Met Ser Phe Met Ser Gln Met Ala Leu Ala

385 390 395 400

Leu Gly Lys Leu Ala Asn Leu Glu Gly Phe Val Ile Gln Ala Asp Asn

405 410 415

Leu Arg Gln Gln Thr Leu His Gln Met His Arg Ile Leu Thr Val Arg

420 425 430

Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Ala Ile Gly Glu Tyr His Asn Arg Leu

435 440 445

Arg Ala Leu Ser Ser Leu Trp Ala Ser Arg Pro Arg Glu Ile Leu Val

450 455 460

Thr Asp Glu Gly Asn Cys Glu Ile Ser Ile Ala Ala Gln Pro Ser Gln

465 470 475 480

Asn Gln Phe Ser Thr Phe

485

<210> 5

<211> 650

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

Met Val Gln Gly Glu Glu Ser Ser Trp Arg Met Glu Arg Ala Ala Leu

1 5 10 15

Pro Leu Asn Gln Ala Leu Ala Tyr Gly Val Gln Ala His Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Pro Pro Thr Cys Phe Leu Tyr Asn Phe Ala Leu Leu Tyr

35 40 45

Ser Pro Ser Pro Pro Pro Thr Ala Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Val

50 55 60

Val Glu Leu Ala Val Ala Met Val Gln Gly Glu Glu Ser Ser Trp Arg

65 70 75 80

Met Glu Arg Ala Ala Leu Pro Leu Asn Gln Leu Ala Leu Ala Tyr Gly

85 90 95

Val Gln Ala His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Thr

100 105 110

Cys Phe Leu Asp Phe Gln Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Tyr Phe Gly

115 120 125

Phe Gly Glu Leu Glu Glu Ala Leu Ile His Gly Gly Gly Ala Ala Ser

130 135 140

Ala Gly Gly Gly Val Asp Pro Gly Val Ile Ile Lys Asn Asp Val Ala

145 150 155 160

Gln Ala Lys Ser Ala Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Ala Gly Thr Gly Arg

165 170 175

Pro Pro Thr Leu Glu Ile Phe Pro Ser Trp Pro Met Arg His Gln Gln

180 185 190

Gln Leu His Ser Gly Asn Ser Gln Ser Val Gly Ser Thr Gly Thr Asp

195 200 205

Ser Ser Ser Ala Gln Asn Thr Met Ser Gln Met Glu Leu Val Ser Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Ala Pro Arg Gln Glu Val Met Met Val Thr Thr Asp Asp

225 230 235 240

Tyr Ser Tyr Lys Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro

245 250 255

Pro Ser Phe Gln Gln His His Pro Leu Pro Leu Gln Leu His Gly Gly

260 265 270

Glu Gly Gly Gly Asp His Asp Lys Arg Lys His Gly Ser Thr Arg Lys

275 280 285

Asp Gly Lys Leu Val Asp Ala Lys Thr Glu Arg Arg Leu Ala Gln Asn

290 295 300

Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln

305 310 315 320

Gln Leu Glu Thr Ser Arg Ile Arg Leu Gln Gln Val Glu His Glu Leu

325 330 335

Gln Arg Ala Arg Ser Gln Gly Leu Phe Val Gly Gly Cys Ser Ala Ala

340 345 350

Gly Asp Met Ser Ser Gly Asn Ala Gln His Arg Pro Ser Ala Ser Ser

355 360 365

Ile His Ser Gln Tyr His Cys Ser Lys Ala Ser Ser Phe Leu Pro Cys

370 375 380

Ser Cys Gly Leu Gln Leu Gln Leu Ser Cys Arg Ser Arg Ser Arg Pro

385 390 395 400

Gln Arg Gly Ala Ala Met Phe Asp Met Glu Tyr Ala Arg Trp Leu Asp

405 410 415

Asp Asp Thr Lys Arg Leu Ala Glu Leu Arg Gly Gly Leu Gln Ala His

420 425 430

Leu Leu Asp Gly Asn Leu Gly Leu Ile Val Glu Glu Cys Met Gln His

435 440 445

Tyr Asp Glu Leu Phe Gln Leu Lys Ala Ala Leu Ala Arg Ser Asp Val

450 455 460

Phe His Leu Leu Thr Gly Ser Trp Ala Thr Pro Ala Glu Arg Cys Phe

465 470 475 480

Phe Trp Met Gly Gly Phe Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Ile Leu Ile

485 490 495

Pro Gln Leu Asp Pro Leu Thr Glu Gln Gln Leu Leu Gly Ile Cys Asn

500 505 510

Leu Gln Gln Ser Ser Glu Gln Ala Glu Glu Ala Leu Ala Gln Gly Leu

515 520 525

His Gln Leu His Gln Ser Leu Ala Asp Thr Val Ala Ala Gly Thr Leu

530 535 540

Asn Asp Gly Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Met Asn Ile Met Ala Val Ala

545 550 555 560

Leu Glu Lys Leu Ala Ser Leu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Ala Asp Asn

565 570 575

Leu Arg His Gln Thr Leu His Gln Met Arg Arg Ile Leu Thr Thr Arg

580 585 590

Gln Ala Ala Arg Cys Phe Leu Ser Ile Gly Glu Tyr Tyr Ser Arg Leu

595 600 605

Arg Ala Leu Ser Asn Leu Trp Ala Ser Arg Pro Arg Asp Asn Phe Ile

610 615 620

Gly Thr Glu Ser Leu Ser Pro Thr Ala Thr Glu Leu Gln Ala Leu His

625 630 635 640

His Gln Gln Gln Asn Gln Phe Ala Gly Phe

645 650

<210> 6

<211> 534

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

Met Val Gln Gly Glu Glu Ser Ser Trp Arg Met Glu Arg Ala Ala Leu

1 5 10 15

Pro Leu Asn Gln Ala Leu Ala Tyr Gly Val Gln Ala His Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Ala Ala Ala Pro Pro Thr Cys Phe Leu Asp Phe His Gln Pro

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Gly Phe Gly Glu Leu Glu Glu Ala

50 55 60

Leu Ile His Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Pro Gly Val Ile Thr Lys

65 70 75 80

Asn Asp Val Ala Gln Ala Lys Ser Ala Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Pro Thr Leu Glu Ile Phe Pro Ser Leu Pro Met Arg

100 105 110

His Gln Gln Gln Leu His Ser Gly Asn Ser Gln Ser Val Gly Ser Thr

115 120 125

Thr Asp Ser Ser Ser Ala Gln Asn Ala Met Ser Gln Met Glu Leu Ala

130 135 140

Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Pro Arg Gln Glu Ala Met Met Val Thr

145 150 155 160

Ala Asp Gly Tyr Ser Tyr Lys Pro Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Ala Ala Pro Pro Ser Phe Gln Phe Gln Gln Gln His Gln His His His

180 185 190

Pro Leu Pro Leu His Gly Asp Gly Gly Gly Asp His Asp Lys Arg Lys

195 200 205

His Gly Ser Thr Gly Lys Asp Gly Lys Leu Val Asp Ala Lys Thr Glu

210 215 220

Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg

225 230 235 240

Lys Lys Ala Tyr Val Gln Gln Leu Glu Thr Thr Arg Ile Arg Leu Gln

245 250 255

His Val Glu His Glu Phe Gln Arg Ala Arg Ser His Ser Gln Gly Val

260 265 270

Gly Val Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Asp Met Ser Cys Gly Ala Ala

275 280 285

Met Phe Asp Met Glu Tyr Ala Arg Trp Leu Asp Asp Asp Ser Lys Arg

290 295 300

Leu Ala Glu Leu Arg Gly Gly Leu Gln Ala His Leu Leu Leu Asp Ala

305 310 315 320

Asn Leu Gly Leu Ile Val Glu Glu Cys Met Gln His His Asp Glu Leu

325 330 335

Phe Gln Leu Lys Ala Ala Leu Ala Arg Ser Asp Val Phe His Leu Leu

340 345 350

Thr Gly Ser Trp Thr Thr Pro Ala Glu Arg Cys Phe Phe Trp Met Gly

355 360 365

Gly Phe Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Val Leu Ile Pro Gln Leu Asp

370 375 380

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385 390 395 400

Ser Glu Gln Ala Glu Glu Ala Leu Ala Gln Gly Leu His Gln Leu His

405 410 415

Gln Ala Leu Ala Asp Thr Val Ala Ala Gly Thr Leu Asn Glu Gly Ser

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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530

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tactccatgt cgaacatgg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaatggcta gaactacta 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atccagaaga agcagcgct 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccatgtttga cgtggagta 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagtgacga gtggtgtacg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggctgtgg ttgtccag 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgggactcat cgtggaggag tgc 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccgcttgct ccgacgact 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcaccggct cctggacc 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgggcggaa gcctcc 16

Claims (10)

1.ZmTGA9基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述基因包括三个旁系同源基因：ZmTGA9-1，ZmTGA9-2和ZmTGA9-3，所述基因编码的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示，抑制所述基因在玉米中的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3所示。

3.一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1或2中所述基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株。

4.根据权利要求3所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。

5.根据权利要求4所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

6.根据权利要求5所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9方法包括：选取基因保守区的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域。

7.一种获得tga9-1/2/3雄性不育系的方法，其特征在于，tga9-1/2/3雄性不育系通过以下方法获得：将权利要求3-6之任一所述方法获得的玉米雄性不育系与目标材料进行杂交，获得F1代后，与目标材料进行回交，从而使目标材料获得与权利要求3-6获得的玉米雄性不育系相同的性状和基因突变。

8.通过权利要求7所述的方法获得的tga9-1/2/3雄性不育系在玉米杂交育种和制种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的玉米杂交育种和制种是指将tga9-1/2/3雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交。

10.根据权利要求8所述的应用，包括将获得的tga9-1/2/3雄性不育系与其他目标材料进行杂交，获得F1代后，与目标材料进行回交，从而使目标材料获得tga9-1/2/3雄性不育的性状和基因突变。

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