CN109207505B - 一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速创制番茄雄性不育系的方法及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对番茄Solyc03g053130基因进行编辑，进而通过自交获得纯合且不含CAS9转基因的雄性不育突变体。本发明还公开了一种辅助鉴定雄性不育株的方法，该方法是检测番茄基因组中Solyc03g053130基因中SNP1606的基因型，若待测番茄基因组SNP1606的基因型为T/T纯合，则待测番茄为或候选为雄性不育株。本发明创制番茄雄性不育系和检测雄性不育株的方法，可应用于其他番茄品系，具有极大的育种应用前景和经济价值。

Description

一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)，属茄科番茄属，是一种世界范围广泛种植的重要蔬菜作物，也是人们日常生活中喜爱的一种水果替代品，在我国设施蔬菜生产中占有重要地位。番茄作为一种严格的自花授粉作物，其杂种优势明显，杂种整齐度高、抗逆性强，因此在生产上主要以杂交种为主。目前番茄的杂交制种主要以人工去雄授粉的方式进行，这种方式劳动力成本较高，且易发生种子不纯等种子安全问题。在制种时引入雄性不育系可以优化制种程序，降低劳动力成本，提高杂种种子纯度以及避免亲本流失。因此番茄雄性不育系的选育意义重大。

雄性不育(Male sterility)指有性繁殖过程中，由于生理或遗传上的原因造成植物的雌性器官正常，雄性器官不正常，不能产生花粉或花粉败育而不能授粉的现象。雄性不育主要分为细胞质不育和和细胞核不育两种类型(王超等，2013；杨莉芳等，2013；马西青等，2013)。早在上世纪30年代开始，人们就开始了番茄雄性不育的相关研究。迄今为止，全世界范围内共报道了60余份番茄雄性不育材料，均属于细胞核基因控制的“核不育类型”(Susan et al.,1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。这其中包括至少3份功能不育类型(花药不开裂或柱头外露)，6份结构不育类型(雄蕊退化或无雄蕊)和40余份花粉败育类型(花粉发育缺陷)。人们在自然资源中没有发现细胞质不育类型的番茄雄性不育材料，但通过用远缘杂交或基因工程等手段获得了一些细胞质雄性不育类型。自然资源中现有的各类番茄雄性不育材料各有优缺点,限制了在杂交制种中的应用。(1)柱头外露类型虽自花传粉有困难,但在群体种植情况下,容易发生邻株、邻花之间的传粉，从不育系应用与制种生产的角度分析，这种不育类型不能避免自交的可能性，容易发生种子事故；并且此类型的不育性易受环境影响，导致不育性稳定性差。(2)花药不开裂类型基本上可避免自交的可能性，但因花柱短于雄蕊花药筒,不能够直接进行授粉，仍需要进行去雄，操作复杂，而且部分组合表现为配合力低、熟期较晚等缺点，此类不育系仅在保加利亚、捷克等东欧国家有应用。(3)无雄蕊或雄蕊退化类型也可完全避免自交，但这类材料的结实率较低，果实内种子含量少，农艺性状一般较差,很难应用(Susan et al.,1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。(4)人们在自然资源中发现的40余份花粉败育类型在番茄杂交制种中具有较大的应用潜力，这类材料一般受一对隐性核基因控制，需要紧密连锁的分子标记辅助不育性状的鉴定和转育。由于目前绝大多数不育基因尚未克隆，这类不育材料在杂交制种中的应用受到很大限制。

制约隐性核不育系在番茄杂交制种中广泛应用的另一因素是难以找到有效的保持系，不能大量产生不育系种子供制种用，只能以杂合体形式保存。以不育株为母本，杂合可育株为父本进行杂交，其子代将按1:1比例分离出纯合不育株和杂合可育株。采用这种作法可以较大量地繁殖不育株与可育株的混合群体，这种群体内既有不育株又有保持不育能力的杂合植株，因此称之为两用系。如何从两用系中快速、准确地选择出雄性不育株作为母本制种已成为一个亟待解决的技术问题。定位克隆雄性不育基因，通过分子标记可高效准确地进行不育株选择，但此方法增加了成本和技术难度，且目前适用此方法的也仅有ps-2，ms-10和ms-15三个雄不育突变体。此外，人们也尝试将一些与雄性不育紧密连锁的苗期标记性状引入不育系，利用苗期标记性状辅助不育株的选择。目前广泛应用的雄性不育突变体ms-10和绿茎aa紧密连锁，通过aa这一苗期标记性状来选择雄性不育突变体，选择效率可达到90％(Jeong et al.,2014；Zhang,L.et al.2016)。此方法的缺点在于不能保证100％的准确率，后期需要二次选择或利用隐性苗期标记性状在杂交种中甄别假杂种。

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被DNA修复系统修复过程中产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。规律成簇间隔短回文重复系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas,CRISPR/Cas)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。近年来，人们将Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造成为第三代基因编辑技术，即CRISPR/Cas9技术(Hsu et al.,2014；Lander,2016)。理论上来讲，CRISPR/Cas9技术可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标性状的快速、精准改良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，在作物遗传育种中显现出巨大的应用前景(Huang et al.,2016)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育番茄雄性不育系的方法。

本发明提供的培育番茄雄性不育系的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到番茄雄性不育系。

上述方法中，所述育性基因为编码Solyc03g053130蛋白的基因；

所述Solyc03g053130蛋白是下述1)或2)：

1)氨基酸序列是序列13所示的蛋白质；

2)将序列13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；

所述sgRNA的靶序列为序列2所示的DNA分子。

上述方法中，所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体。所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。在本发明的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为pKSE401-sgRNA，其为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的Bsa I的酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体。

本发明的培育番茄雄性不育系的方法还包括筛选Solyc03g053130纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的Solyc03g053130基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，Solyc03g053130纯合突变体是指两条同源染色体的Solyc03g053130基因发生了相同的突变且不携带外源DNA片段的植株。所述筛选的方法具体如下：采用序列7和序列8所示的引物对T0代再生番茄植株进行PCR扩增和测序。选择和野生型植株相比，靶序列出现核苷酸缺失或插入的T0代再生番茄植株，即为Solyc03g053130基因被编辑的植株。将Solyc03g053130基因被编辑的植株进行自交，并收获种子，再将所得种子进行播种；待长出真叶后，采用序列5和序列6所示的引物对其Cas9基因片段进行PCR克隆和电泳，选择不携带Cas9基因片段的T1代再生番茄植株，再采用序列7和序列8所示的引物对Solyc03g053130基因进行PCR扩增和电泳，选择靶序列出现纯合突变(两条同源染色体的Solyc03g053130基因发生了相同的突变)且不携带Cas9基因片段的植株，即为Solyc03g053130纯合突变体。

上述方法中，所述受体番茄为野生型番茄Moneymaker。本发明通过上述方法获得的番茄雄性不育系为Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)，其为将野生型番茄Moneymaker的两条同源染色体的Solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(T)，且保持野生型番茄Moneymaker的基因组其他序列不变后得到的植株。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的Solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，在第一外显子上发生移码突变，突变序列如序列表的序列9所示。

本发明的另一个目的是提供如下(1)-(4)中任一种生物材料：

(1)上述番茄基因组编辑的载体；

(2)含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；

(3)上述靶序列；

(4)序列9所示的Solyc03g053130基因的突变序列。

上述材料中，所述含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体为含有pKSE401-sgRNA的LBA4404。

上述材料中，所述Solyc03g053130基因的突变序列(序列9)为在野生型番茄Solyc03g053130基因(序列1)的第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，且保持其他序列不变后得到的序列。

本发明还有一个目的是提供上述材料或上述方法获得的番茄雄性不育系的新用途。

本发明提供了上述载体或微生物转化体或靶序列或突变序列在培育番茄雄性不育系中的应用。

本发明还提供了上述载体或微生物转化体或靶序列或突变序列或上述方法获得的番茄雄性不育系在番茄育种中的应用。

上述Solyc03g053130蛋白或其编码基因在培育番茄雄性不育系中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的方法包括如下步骤：检测待测番茄的基因型，根据基因型判断待测番茄是否为雄性不育株；

若待测番茄的基因型为T/T，则待测番茄为或候选为雄性不育株；

若待测番茄的基因型为G/G或T/G，则待测番茄为或候选为雄性可育株；

所述T/T基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位均为T的纯合体；

所述G/G基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位均为G的纯合体；

所述T/G基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位为T和G的杂合体。

上述方法中，所述检测待测番茄的基因型的方法为用成套引物对待测番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，检测所述扩增产物中SNP1606位点基因型；

所述成套引物由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列10所示的DNA分子；

所述引物2为序列11所示的DNA分子；

所述引物3为序列12所示的DNA分子。

上述方法中，采用ArrayTape平台检测所述扩增产物中SNP1606位点基因型；所述SNP1606位点为番茄Solyc03g053130基因的第1606位。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的产品为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)上述成套引物；

(2)含有(1)所述的成套引物的PCR试剂；

(3)含有(1)所述的成套引物或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。

上述鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的方法或上述产品在选育番茄雄性不育株中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的Solyc03g053130基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；所述番茄雄性不育系是指番茄植株中花粉皱缩、败育，自交不能正常收获种子，而用其它正常番茄植株的花粉为其授粉可以收获种子。

本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速创制一种番茄雄性不育系，并开发了可辅助鉴定待测番茄植株是否为雄性不育株的分子标记。本发明创制番茄雄性不育系的方法和检测雄性不育株的方法，可应用于其他番茄品系。与传统的回交转育相比，该方法可以极大地缩短雄性不育转育时间，1-2年内将骨干亲本由雄性可育系转育为雄性不育系，且无连锁累赘等不良效应，具有极大的育种应用前景和经济价值。

附图说明

图1为实施例1中的Solyc03g053130基因结构图。

图2为实施例2中T₀代番茄的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为实施例2中T₀代番茄的突变类型图。

图4为实施例2中T₁代番茄的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为实施例2中纯合突变体测序峰图。

图6为实施例3中花粉二乙酸荧光素染色图。

图7为实施例3中纯合突变体自交杂交坐果图。

图8为实施例4中KASP标记检测部分F2群体SNP1606的分型图。红色为T/T纯合,蓝色为G/G纯合,绿色为T/G杂合。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用的番茄品系为Moneymaker，公众可从北京市农林科学院或中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中pKSE401和pMD18-T载体均可从Addgene载体库(http://www.addgene.org/)购买；Premix Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1均为大连TaKaRa公司产品；限制性内切酶为NEB公司产品；PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品；快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为Thermo Fisher Scientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。

实施例1、构建含Solyc03g053130基因特异sgRNA靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体

1、序列1为Solyc03g053130基因的核苷酸序列，其结构如图1所示，1-1528bp为启动子序列，1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列。将序列1所示Solyc03g053130基因序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz 1706genome SL2.50，进行CRIPSR/Cas9靶点设计。最终选定序列1第1601-1619位(第一外显子)的反向互补序列作为对Solyc03g053130基因进行编辑的sgRNA靶点序列。

Solyc03g053130基因sgRNA靶点序列如下：5’-gggaaagaagaaacaagtg-3’(序列2)。

2、合成包含上述sgRNA靶点序列的引物对Oligo-01F和Oligo-R，引物序列如下：

Oligo-01F：5’-attggggaaagaagaaacaagtg-3’(序列3)；

Oligo-R：5’-aaaccacttgtttcttctttccc-3’(序列4)。

3、将上述引物对Oligo-01F和Oligo-R退火，并与经过Bsa I酶切的双元载体pKSE401连接，得到重组载体pKSE401-sgRNA。将重组载体pKSE401-sgRNA转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献“Xing,H.L.,Dong,L.,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC plant biology 14:327.”中的方法。

测序结果表明：重组载体pKSE401-sgRNA为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的Bsa I酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体。

4、挑选测序正确的克隆，提取质粒，并转化根癌农杆菌LBA4404(北京华越洋生物，NRR01270)，获得含有CRISPR/Cas9基因编辑载体pKSE401-sgRNA的根癌农杆菌菌液LBA4404-C1。

实施例2、针对Solyc03g053130进行编辑的CRISPR/Cas9转基因番茄的获得及鉴定

一、针对Solyc03g053130进行编辑的CRISPR/Cas9转基因番茄的获得

1、番茄转化相关培养基的配制

LB液体培养基是将胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)、氯化钠(NaCl)和水混匀得到的培养基，其中，胰蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为10g/L、酵母提取物在LB液体培养基中的浓度为5g/L，氯化钠在LB液体培养基中的浓度为10g/L。

MS液体培养基：将4.4g MS盐(购自北京华越洋生物，货号为M519)、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，高压灭菌。

种子生长培养基(1/2MS培养基)：将2.2g MS盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加入0.8％的琼脂，高压灭菌。

预(共)培养培养基(D1)：将4.4g MS、1.0mg玉米素(Zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

筛选分化培养基(2Z)：将4.4g MS盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、100mg肌醇、0.5mg叶酸和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

生根培养基：将4.4g MS盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

2、针对Solyc03g053130进行编辑的CRISPR/Cas9转基因番茄的制备

(1)转化外植体的准备

取野生型番茄Moneymaker，挑选饱满、粒大种子，用40％NaCl浸泡20min，用无菌水冲洗5遍，播种于种子生长培养基上，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下光照培养。萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀将子叶切成小方块(动作应快)，将子叶小方块接种于预培养培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，2d后，可用于番茄转化。

(2)侵染液的准备

将保存备用的LBA4404-C1接种于含卡那酶素与利福平抗生素的LB液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养。次日以1:100的比例转接至新的LB液体培养基中，28℃、200rpm培养至OD₆₀₀＝0.8。菌液以5000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。用MS液体培养基重新悬浮菌体，稀释至OD600＝0.4后加入50uL 0.074mol/L的乙酰丁香酮，备用。

(3)外植体的转化、筛选与生根

将步骤(1)得到的子叶块分别浸入(2)制备好的侵染液10min，然后接种于D1培养基上(培养基上放滤纸)共培养2天，转入到筛选分化培养基(2Z)中筛选培养，每2周继代一次，培养8周后产生抗性芽。当不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下，并转接至生根培养基上，进行生根培养，将生根的T₀代转基因植株移入土中常规管理并进行分子鉴定。T₀代转基因植株自交收获T₁代的转基因番茄种子。

上述共培养、筛选培养和生根培养的条件均为：温度为25℃、16h光照/8h黑暗。

二、T₀转基因植物的鉴定及T₁非转基因纯合突变植株的获得

1、提取野生型番茄Moneymaker和T₀代转基因植株叶片的基因组DNA。

2、以步骤1中的基因组DNA为模板，用CAS9-F和CAS9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，72℃延伸10min。

CAS9-F：5’-tcaactgagcaaagacacct-3’(序列5)；

CAS9-R：5’-ctcgtacagcagagagtgtt-3’(序列6)。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示。从图2中可以看出：以野生型番茄的基因组DNA为模板的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中无特异条带，而以T₀代转基因番茄(1，2，3，5，7)的基因组DNA为模板的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中显示一条大小为673bp的特异条带，说明T₀代转基因番茄含有CAS9转基因片段。

4、以步骤1中的基因组DNA为模板，用C1-F和C1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，72℃延伸10min。

C1-F：5’-tctccgaccagttacgtgtgac-3’(序列7)；

C1-R：5’-atgcctatcaacgatcctcacat-3’(序列8)。

5、将步骤4中的PCR扩增产物插入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，每份PCR扩增产物挑选20个阳性克隆测序。将T₀代转基因番茄测序结果与野生型测序结果比对显示，T₀代转基因番茄中的目标区段(target)发生多种突变类型，如图3所示。选择在目标区段插入1个碱基的3号转基因植物进行后续分析。

6、将3号转基因植物自交，收获T₁代转基因番茄种子。将T₁代转基因番茄播种于苗盘中，两叶一心期提取各单株基因组DNA。利用步骤2和步骤3中方法筛选出不含CAS9转基因片段的单株用于后续分析，如图4中的T₀-3-6、T₀-3-8、T₀-3-10和T₀-3-13号单株。

7、以不含CAS9转基因片段的单株的基因组DNA为模板，用C1-F和C1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR产物纯化并测序，鉴定出目标区段插入1个碱基的Solyc03g053130纯合突变植株(两条同源染色体的Solyc03g053130基因发生了相同的突变)，即图5中的T₀-3-6号单株，图中显示为靶点序列插入1个碱基(腺嘌呤A)。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的Solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，在第一外显子上发生移码突变，Solyc03g053130基因的突变序列如序列表的序列9所示。

Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)为将野生型番茄Moneymaker的两条同源染色体的Solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(T)，且保持野生型番茄Moneymaker的基因组其他序列不变后得到的植株。

实施例3、Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力和育性检测

一、Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力检测

1、试剂的配置

二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)母液：取10mg FDA溶于5mL丙酮中，分装至1.5mL离心管中，-20℃避光保存。

BK buffer S15MOPS(pH 7.5)缓冲液：取5mL MOPS(100mM，pH 7.5)，7.5g蔗糖，6.35μL Ca(NO₃)₂(1M)，4.05μL MgSO₄(1M)和5μL KNO₃(1M)溶于水中，用水定容至50mL。分装至1.5mL离心管中，-20℃避光保存。

2、花粉二乙酸荧光素染色及观察

(1)将1μL FDA母液加至1mL BK buffer S15MOPS缓冲液中，混匀，取1滴至洁净的载玻片上。

(2)用镊子分别从野生型番茄Moneymaker和Solyc03g053130纯合突变植株的花药中取少量花粉，置于混合液滴上，盖上盖玻片，利用荧光共聚焦显微镜在蓝光(波长495nm)下观察。

检测结果如图6所示。从图中可以看出：Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)花粉较野生型番茄植株Moneymaker花粉体积小且皱缩；蓝光下，野生型花粉呈绿色，而Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)花粉无染色信号，说明Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)花粉无活力。

二、Solyc03g053130纯合突变植株的育性检测

Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)无法自交结实。以野生型番茄Moneymaker为父本，Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)为母本进行杂交，可以获得有活力的F1种子。而以野生型番茄Moneymaker为母本，Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)为父本进行杂交，无法获得F1种子(图7)。说明纯合突变体雄性不育，雌性正常。

实施例4、应用特异分子标记辅助鉴定杂交后代中的雄性不育株

雄性不育纯合突变体(Solyc03g053130纯合突变植株)中Solyc03g053130基因序列的第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，根据该突变类型，开发基于DouglasScientific公司ArrayTape检测平台的Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)分子标记，用于辅助鉴定雄性不育株。

一、应用特异分子标记辅助鉴定杂交后代中的雄性不育株的方法

1、引物组合的设计

将序列1所示的Solyc03g053130基因的第1606位核苷酸命名为SNP1606。番茄Solyc03g053130基因的SNP1606位点的碱基均为T的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为T/T基因型；番茄Solyc03g053130基因的SNP1606位点的碱基均为G的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为G/G基因型；番茄Solyc03g053130基因的SNP1606位点的碱基为T和G的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为T/G基因型。

野生型番茄基因型为G/G，而雄性不育纯合突变体(Solyc03g053130纯合突变植株)基因型为T/T。根据突变位点SNP1606，设计特异引物组合FP1、FP2和RP，引物序列如下：

FP1:5’-gaaggtgaccaagttcatgctaaaggctagggaaagaagaaacaag-3’(序列10)；

FP2:5’-gaaggtcggagtcaacggattcaaaggctagggaaagaagaaacaaa-3’(序列11)；

RP:5’-gatccaattgataagaagccagcttgtt-3’(序列12)。

2、PCR扩增

以野生型番茄和雄性不育纯合突变体(Solyc03g053130纯合突变植株)的基因组DNA为模板，采用步骤1设计的引物进行PCR扩增。并对扩增产物进行测序。

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(正向引物FP1和FP2在体系中的终浓度为12pmol·L-1，反向引物RP在体系中的终浓度为24pmol·L-1)，LGC公司2×KASP Mix(StdRox)0.8μL。

PCR扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，设置40个循环。将上述PCR扩增体系采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，实验设计2次重复。

3、数据记录

仪器自带软件读取的数据能够划分不同的基因型数据，纯合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele2，其中Allele1和Allele2分别代表该变异位点上的两个等位碱基为T和G，因此，Allele1/Allele1代表的基因型为T/T，Allele2/Allele2代表的基因型为G/G，Allele1/Allele2代表的基因型为T/G。

经测序验证，该KASP标记的检测结果与测序结果一致，证明本检测方法可信。

因此可通过如下方法辅助鉴定杂交后代中的待测番茄是雄性不育株还是雄性可育株：检测杂交后代中的待测番茄的基因型，根据基因型判断待测番茄是雄性不育株还是雄性可育株，

若待测番茄的基因型为T/T，则待测番茄为雄性不育株或候选雄性不育株；

若待测番茄的基因型为G/G或T/G，则待测番茄为雄性可育株或候选雄性可育株。

二、应用特异分子标记辅助鉴定杂交后代中的雄性不育株的方法的验证

利用KASP标记辅助鉴定201个F2群体中的雄性不育株。具体步骤如下：

1、以野生型番茄Moneymaker为父本，以Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)为母本进行杂交，收获F1代种子。

2、将F1代种子培育为植株，即为F1代植株。

3、将F1代植株进行自交，收获F2代种子。

4、将F2代种子培育为植株，即为F2代植株。

5、按照步骤一中的方法利用KASP标记检测201株F2代植株的SNP1606位点基因型。并利用二乙酸荧光素染色法(具体步骤参照实施例3)结合田间观察201株F2代植株是否能自交结实，确定201株F2代植株的雄性育性。

KASP标记检测结果显示51株F2代植株的SNP1606位点基因型为T/T，且这些植株均为雄性不育株，说明利用该KASP标记可以在杂交群体中准确鉴定雄性不育株。

序列表

<110>北京市农林学科学院 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用

<160>13

<210>1

<211>4153bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gtagatgttc ttgtcatgat gacttccagg ttttgggaat aatagatgtt gaatattgat 60

agttattgaa ttggttttta ttaatgagtt taagtcttcc gcattacttt ttgttgttat 120

tacattgaaa tgttaaggtt tagattggtt ggttcgctca cataggaggg taagtgtggg 180

tgccagtcgc ggcccggatt tgggtcgtga cataaaggtt gggactggtt catgtaaatt 240

ctgttggttg tttgacgcta ctattttaag tatttctata cttagtcaat ttttgtgggt 300

gcaagtaggc tgagtgttac agacgtttgt aagactgcct agagtggtgt gcgataaaaa 360

taatcgaccc tctttcagat agcgttgcag tatgtgttgc ttcttttttt ttttgcaggg 420

acaatccgta gttgttgact ccgtcatttt ttaaactcgg tttagtagtg aaaactgaaa 480

actcagttta ggtaacatga gatcctttat ctaaaattcc cagtttctaa ctttgctttc 540

atcttcaaat gataaataga gtgttagatt catgaagtaa tcatggattc aagttagaat 600

cacttaactc aatcttgtgg gtgaaaatca agaacagaat gtcaaatgaa attactcaaa 660

tgaagggctg gtttgttcaa cttgaaccac gggtgaattg aaatagccat ctatcatttt 720

ctttcagtac tctcgttatg atttccagct acgtcccatg ctatgtatta aaatgattag 780

tagttctatg acttaggcct catttgttta cacttgatga agtttgaaac tcaatcattc 840

acacattggg ctattaagtg cattttaaaa aaaaatcaaa tctgaaagca tctctatgag 900

agagtcttat catgtttacc atggatgttt ctcttaattg gtagtggttc gagggatgcc 960

atgtcacaac gttaagtttc agatttgggt tgtggaatat gttgaaacca agttcctatt 1020

tcggccttgg tttgtttagt tggttcagcg caatctgttt agtttgatcc tacatgagta 1080

gacttggtcc aacagcccat atttatgtga attttcagat tccttttatt gtactgcatt 1140

tgtgtctaaa tataaatagt atatactata gtcaatttta cgagctgacg ttacctattc 1200

ctcttctctc atttaaaaca agtaatctta tttacttgat gagtgtcgta gtttgaatga 1260

tgatctaact catagaacaa atggttgctg ctcactatca tattggaatt gaccaaaaaa 1320

ataaatgaat gcaccttctg atttcattat tatcaataac aagtaggaat gcagaaaaca 1380

tgactaacaa atggacaact tacttctaac aacaagtgga tcacaaacat tgtgtgtctt 1440

ccttcatcct ataacattgt gaaatcttac atttccagtt taaacagctt aaatttcagc 1500

atccatattc cccaccttcc tgccaccgat gcctatcaac gatcctcaca tggagaagag 1560

gatccaattg ataagaagcc agcttgtttc acaacgtcct cacttgtttc ttctttccct 1620

agcctttgct ttccttgtgg cagatccatt tggtttaagt ccagtagggg acactgactt 1680

taatccagta aagaatgaca ttgcaccata caaacaagtc atggaaagtt ggcatggaga 1740

caagaataat cggttaggcc tcggcaatct ggagtttgtt aatgaaattt acggtcctga 1800

atcattagaa tttgatattt tgggtcatgg cccatatgcc ggactagctg atgggcgtat 1860

tgtacggtgg atgggggagg atgctggttg ggaaacattt gcagtcgtca cacgtaactg 1920

gtaagcatct gaattatata cctttatgga catattgaat atgttgtgaa gatggatata 1980

attgcaatgt atttttgttt aggaagtggg aggatagagt gtatatatat atactctata 2040

gtattattct tttaaatttc atttatctcc ctgtcgttgt cgtataaggt cggagaagct 2100

ttgtgctaaa ggaaaggatt caacaacacc taagcaatat agagttgagc cagaatgtgg 2160

caggcccctt gggctaaggt tcaataaaca gacaggggat ttgtacatag cagatgcata 2220

ctatggactc ctagttgtgg gtcctgaagg aggcgtggca acgtccttgg ctacacatgt 2280

tgaagggaaa cgaatactct tcgccaacga ccttgatatc catacaaatg gctccatctt 2340

cttcacagac actagcaaga aatacaacag agtgtaggtt aacaaatctt ttttttatca 2400

aatactacaa ttgtagtggt ttatattact cttctttcat tatataaatt tcttatgtag 2460

gaaccatttt ctcataatgt tagaaggaga agacagtggt agacttctta ggtatgatat 2520

tgctacgaaa tctactaatg ttgtcttgga tggattgacg ttccctaacg gagtacaatt 2580

atccaaggat caaacttttc ttctcttcac tgaaacaacc aattgcaggt atccatcatc 2640

cctctacaag tgtttgttta attcagacgt aaatcaccta aacgtgtaat tcaccgagac 2700

aacaaatatt ataaatacct tgctgttata tgttcaggct gatgaaatac tggatagaag 2760

gtccaaagag agggatagtt gagattgttg caaaccttcc aggatttcca gacaacgtaa 2820

gggtgaacga aaaaggtcaa ttctgggttg caatagattg ttgtcgaact cgtgcacaag 2880

aagtgctgat aaataatcca tggatgagaa gcatttactt tagattaccg attcagatgc 2940

gttacctggc tagattgatg gggatgaaaa tgtacactgt tatatcactc ttcaatgaaa 3000

atggagaaat tattgatgtt cttcaagata aaaaaggtgt agttatgaag ttggttagtg 3060

aagttagaga agtaaatggc aagctatgga ttgggactgt ggctcataac catattgcta 3120

cccttccata cccataaata aaactacgtt ttgccttccc ttttttttat aaattaattt 3180

tgcaatctta gtctggcttc cttcatttat gtgtaacaaa actaatgaat aataccccaa 3240

cacttgttta acccattctt cacatatttt tttatactag tcttagaaac gtgcgttgca 3300

agtttgatcc ctactattat ataaaactta tataagccta acttcataga tataaaaatg 3360

atcgcgttta ctaattaagc tgttaacatc ccaaaagatt gattgcagtc tccttgaaga 3420

taccaacatg ccttctctca ttgcaacctc cattagaagt agtaagaatt tgtacactat 3480

atattttgtt tctgtaagca acaaaagaat atatgagtaa taaagtgctt atttttataa 3540

gaaaaaagct aaacctaata atagtgaaag ataaaaccaa cagaaatata gtgacagtta 3600

gagatggaac tttttttgtt tcttccaagt gggaaaaagt ctcttcataa tgtatacaat 3660

gacaccattt ataggatatg attaagtaaa atcaaagagt gttttaaata tgacattaat 3720

ttcttgagaa tgtggaaaag tttatacaag tgtgaaagat taatgaggag atagtcaagg 3780

tgtatagtat taatacacat aacgaaaaaa aattgaccta gaaattattg agttgcattt 3840

ttaaacaata tatttacaat aacgttgtag tattttattt ttttatattt tgcatctgat 3900

ggagaaatga aaactttttt aagagccttt actaatatta taattaattg tttttacaat 3960

acttcatttt tgtattttat tatatcaaaa taagtgaatt ataaatatca gatttctgta 4020

aatgaagaaa gtgtaatggg atgataaagt gttaaagtat atatttagtg aaagctttat 4080

taagaagaca aacatgcaaa tattaatcta aaaattcaat tctatattga gttttgaaat 4140

gcatatcaat gac 4153

<210>2

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gggaaagaag aaacaagtg 19

<210>3

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

attggggaaa gaagaaacaa gtg 23

<210>4

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aaaccacttg tttcttcttt ccc 23

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tcaactgagc aaagacacct 20

<210>6

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ctcgtacagc agagagtgtt 20

<210>7

<211>22bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tctccgacca gttacgtgtg ac 22

<210>8

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atgcctatca acgatcctca cat 23

<210>9

<211>4154bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

gtagatgttc ttgtcatgat gacttccagg ttttgggaat aatagatgtt gaatattgat 60

agttattgaa ttggttttta ttaatgagtt taagtcttcc gcattacttt ttgttgttat 120

tacattgaaa tgttaaggtt tagattggtt ggttcgctca cataggaggg taagtgtggg 180

tgccagtcgc ggcccggatt tgggtcgtga cataaaggtt gggactggtt catgtaaatt 240

ctgttggttg tttgacgcta ctattttaag tatttctata cttagtcaat ttttgtgggt 300

gcaagtaggc tgagtgttac agacgtttgt aagactgcct agagtggtgt gcgataaaaa 360

taatcgaccc tctttcagat agcgttgcag tatgtgttgc ttcttttttt ttttgcaggg 420

acaatccgta gttgttgact ccgtcatttt ttaaactcgg tttagtagtg aaaactgaaa 480

actcagttta ggtaacatga gatcctttat ctaaaattcc cagtttctaa ctttgctttc 540

atcttcaaat gataaataga gtgttagatt catgaagtaa tcatggattc aagttagaat 600

cacttaactc aatcttgtgg gtgaaaatca agaacagaat gtcaaatgaa attactcaaa 660

tgaagggctg gtttgttcaa cttgaaccac gggtgaattg aaatagccat ctatcatttt 720

ctttcagtac tctcgttatg atttccagct acgtcccatg ctatgtatta aaatgattag 780

tagttctatg acttaggcct catttgttta cacttgatga agtttgaaac tcaatcattc 840

acacattggg ctattaagtg cattttaaaa aaaaatcaaa tctgaaagca tctctatgag 900

agagtcttat catgtttacc atggatgttt ctcttaattg gtagtggttc gagggatgcc 960

atgtcacaac gttaagtttc agatttgggt tgtggaatat gttgaaacca agttcctatt 1020

tcggccttgg tttgtttagt tggttcagcg caatctgttt agtttgatcc tacatgagta 1080

gacttggtcc aacagcccat atttatgtga attttcagat tccttttatt gtactgcatt 1140

tgtgtctaaa tataaatagt atatactata gtcaatttta cgagctgacg ttacctattc 1200

ctcttctctc atttaaaaca agtaatctta tttacttgat gagtgtcgta gtttgaatga 1260

tgatctaact catagaacaa atggttgctg ctcactatca tattggaatt gaccaaaaaa 1320

ataaatgaat gcaccttctg atttcattat tatcaataac aagtaggaat gcagaaaaca 1380

tgactaacaa atggacaact tacttctaac aacaagtgga tcacaaacat tgtgtgtctt 1440

ccttcatcct ataacattgt gaaatcttac atttccagtt taaacagctt aaatttcagc 1500

atccatattc cccaccttcc tgccaccgat gcctatcaac gatcctcaca tggagaagag 1560

gatccaattg ataagaagcc agcttgtttc acaacgtcct cactttgttt cttctttccc 1620

tagcctttgc tttccttgtg gcagatccat ttggtttaag tccagtaggg gacactgact 1680

ttaatccagt aaagaatgac attgcaccat acaaacaagt catggaaagt tggcatggag 1740

acaagaataa tcggttaggc ctcggcaatc tggagtttgt taatgaaatt tacggtcctg 1800

aatcattaga atttgatatt ttgggtcatg gcccatatgc cggactagct gatgggcgta 1860

ttgtacggtg gatgggggag gatgctggtt gggaaacatt tgcagtcgtc acacgtaact 1920

ggtaagcatc tgaattatat acctttatgg acatattgaa tatgttgtga agatggatat 1980

aattgcaatg tatttttgtt taggaagtgg gaggatagag tgtatatata tatactctat 2040

agtattattc ttttaaattt catttatctc cctgtcgttg tcgtataagg tcggagaagc 2100

tttgtgctaa aggaaaggat tcaacaacac ctaagcaata tagagttgag ccagaatgtg 2160

gcaggcccct tgggctaagg ttcaataaac agacagggga tttgtacata gcagatgcat 2220

actatggact cctagttgtg ggtcctgaag gaggcgtggc aacgtccttg gctacacatg 2280

ttgaagggaa acgaatactc ttcgccaacg accttgatat ccatacaaat ggctccatct 2340

tcttcacaga cactagcaag aaatacaaca gagtgtaggt taacaaatct tttttttatc 2400

aaatactaca attgtagtgg tttatattac tcttctttca ttatataaat ttcttatgta 2460

ggaaccattt tctcataatg ttagaaggag aagacagtgg tagacttctt aggtatgata 2520

ttgctacgaa atctactaat gttgtcttgg atggattgac gttccctaac ggagtacaat 2580

tatccaagga tcaaactttt cttctcttca ctgaaacaac caattgcagg tatccatcat 2640

ccctctacaa gtgtttgttt aattcagacg taaatcacct aaacgtgtaa ttcaccgaga 2700

caacaaatat tataaatacc ttgctgttat atgttcaggc tgatgaaata ctggatagaa 2760

ggtccaaaga gagggatagt tgagattgtt gcaaaccttc caggatttcc agacaacgta 2820

agggtgaacg aaaaaggtca attctgggtt gcaatagatt gttgtcgaac tcgtgcacaa 2880

gaagtgctga taaataatcc atggatgaga agcatttact ttagattacc gattcagatg 2940

cgttacctgg ctagattgat ggggatgaaa atgtacactg ttatatcact cttcaatgaa 3000

aatggagaaa ttattgatgt tcttcaagat aaaaaaggtg tagttatgaa gttggttagt 3060

gaagttagag aagtaaatgg caagctatgg attgggactg tggctcataa ccatattgct 3120

acccttccat acccataaat aaaactacgt tttgccttcc ctttttttta taaattaatt 3180

ttgcaatctt agtctggctt ccttcattta tgtgtaacaa aactaatgaa taatacccca 3240

acacttgttt aacccattct tcacatattt ttttatacta gtcttagaaa cgtgcgttgc 3300

aagtttgatc cctactatta tataaaactt atataagcct aacttcatag atataaaaat 3360

gatcgcgttt actaattaag ctgttaacat cccaaaagat tgattgcagt ctccttgaag 3420

ataccaacat gccttctctc attgcaacct ccattagaag tagtaagaat ttgtacacta 3480

tatattttgt ttctgtaagc aacaaaagaa tatatgagta ataaagtgct tatttttata 3540

agaaaaaagc taaacctaat aatagtgaaa gataaaacca acagaaatat agtgacagtt 3600

agagatggaa ctttttttgt ttcttccaag tgggaaaaag tctcttcata atgtatacaa 3660

tgacaccatt tataggatat gattaagtaa aatcaaagag tgttttaaat atgacattaa 3720

tttcttgaga atgtggaaaa gtttatacaa gtgtgaaaga ttaatgagga gatagtcaag 3780

gtgtatagta ttaatacaca taacgaaaaa aaattgacct agaaattatt gagttgcatt 3840

tttaaacaat atatttacaa taacgttgta gtattttatt tttttatatt ttgcatctga 3900

tggagaaatg aaaacttttt taagagcctt tactaatatt ataattaatt gtttttacaa 3960

tacttcattt ttgtatttta ttatatcaaa ataagtgaat tataaatatc agatttctgt 4020

aaatgaagaa agtgtaatgg gatgataaag tgttaaagta tatatttagt gaaagcttta 4080

ttaagaagac aaacatgcaa atattaatct aaaaattcaa ttctatattg agttttgaaa 4140

tgcatatcaa tgac 4154

<210>10

<211>46bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

gaaggtgacc aagttcatgc taaaggctag ggaaagaaga aacaag 46

<210>11

<211>47bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gaaggtcgga gtcaacggat tcaaaggcta gggaaagaag aaacaaa 47

<210>12

<211>28bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gatccaattg ataagaagcc agcttgtt 28

<210>13

<211>414

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

Met Pro Ile Asn Asp Pro His Met Glu Lys Arg Ile Gln Leu Ile Arg

1 5 10 15

Ser Gln Leu Val Ser Gln Arg Pro His Leu Phe Leu Leu Ser Leu Ala

20 25 30

Phe Ala Phe Leu Val Ala Asp Pro Phe Gly Leu Ser Pro Val Gly Asp

35 40 45

Thr Asp Phe Asn Pro Val Lys Asn Asp Ile Ala Pro Tyr Lys Gln Val

50 55 60

Met Glu Ser Trp His Gly Asp Lys Asn Asn Arg Leu Gly Leu Gly Asn

65 70 75 80

Leu Glu Phe Val Asn Glu Ile Tyr Gly Pro Glu Ser Leu Glu Phe Asp

85 90 95

Ile Leu Gly His Gly Pro Tyr Ala Gly Leu Ala Asp Gly Arg Ile Val

100 105 110

Arg Trp Met Gly Glu Asp Ala Gly Trp Glu Thr Phe Ala Val Val Thr

115 120 125

Arg Asn Trp Ser Glu Lys Leu Cys Ala Lys Gly Lys Asp Ser Thr Thr

130 135 140

Pro Lys Gln Tyr Arg Val Glu Pro Glu Cys Gly Arg Pro Leu Gly Leu

145 150 155 160

Arg Phe Asn Lys Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Ile Ala Asp Ala Tyr Tyr

165 170 175

Gly Leu Leu Val Val Gly Pro Glu Gly Gly Val Ala Thr Ser Leu Ala

180 185 190

Thr His Val Glu Gly Lys Arg Ile Leu Phe Ala Asn Asp Leu Asp Ile

195 200 205

His Thr Asn Gly Ser Ile Phe Phe Thr Asp Thr Ser Lys Lys Tyr Asn

210 215 220

Arg Val Asn His Phe Leu Ile Met Leu Glu Gly Glu Asp Ser Gly Arg

225 230 235 240

Leu Leu Arg Tyr Asp Ile Ala Thr Lys Ser Thr Asn Val Val Leu Asp

245 250 255

Gly Leu Thr Phe Pro Asn Gly Val Gln Leu Ser Lys Asp Gln Thr Phe

260 265 270

Leu Leu Phe Thr Glu Thr Thr Asn Cys Arg Leu Met Lys Tyr Trp Ile

275 280 285

Glu Gly Pro Lys Arg Gly Ile Val Glu Ile Val Ala Asn Leu Pro Gly

290 295 300

Phe Pro Asp Asn Val Arg Val Asn Glu Lys Gly Gln Phe Trp Val Ala

305 310 315 320

Ile Asp Cys Cys Arg Thr Arg Ala Gln Glu Val Leu Ile Asn Asn Pro

325 330 335

Trp Met Arg Ser Ile Tyr Phe Arg Leu Pro Ile Gln Met Arg Tyr Leu

340 345 350

Ala Arg Leu Met Gly Met Lys Met Tyr Thr Val Ile Ser Leu Phe Asn

355 360 365

Glu Asn Gly Glu Ile Ile Asp Val Leu Gln Asp Lys Lys Gly Val Val

370 375 380

Met Lys Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Asn Gly Lys Leu Trp Ile

385 390 395 400

Gly Thr Val Ala His Asn His Ile Ala Thr Leu Pro Tyr Pro

405 410

Claims (12)

1.一种培育番茄雄性不育系的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到番茄雄性不育系；所述育性基因为编码Solyc03g053130蛋白的基因；所述Solyc03g053130蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；

所述sgRNA的靶基因片段的核苷酸序列 如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体；

所述番茄基因组编辑的载体为将SEQ ID NO：2所示的DNA分子插入pKSE401载体的BsaI的酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括筛选Solyc03g053130纯合突变体的步骤。

5.如下（1）-（4）中任一种生物材料：

（1）权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体；

（2）含有权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；

（3）权利要求2中所述的靶基因片段；

（4）SEQ ID NO：9所示的Solyc03g053130基因的突变体。

6.如下任一所述生物材料在培育番茄雄性不育系中的应用；

（1）权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体；

（2）含有权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体。

7.权利要求5中所述的生物材料或权利要求1-3中任一所述的方法获得的番茄雄性不育系在番茄育种中的应用。

8.Solyc03g053130蛋白或其编码基因在培育番茄雄性不育系中的应用；所述Solyc03g053130蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

9.一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的方法，包括如下步骤：检测待测番茄的基因型，根据基因型判断待测番茄是否为雄性不育株；

若待测番茄的基因型为T/T，则待测番茄为或候选为雄性不育株；

若待测番茄的基因型为G/G或T/G，则待测番茄为或候选为雄性可育株；

所述T/T基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位均为T的纯合体；

所述G/G基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位均为G的纯合体；

所述T/G基因型为番茄Solyc03g053130基因的第1606位为T和G的杂合体；

所述Solyc03g053130基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述检测待测番茄的基因型的方法为用成套引物对待测番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，检测所述扩增产物中SNP1606位点基因型；

所述成套引物由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为SEQ ID NO：10所示的DNA分子；

所述引物2为SEQ ID NO：11所示的DNA分子；

所述引物3为SEQ ID NO：12所示的DNA分子；

采用ArrayTape平台检测所述扩增产物中SNP1606位点基因型；

所述SNP1606位点为番茄Solyc03g053130基因的第1606位。

11.一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否为雄性不育株的产品，为如下（1）-（3）中的任一种：

（1）权利要求10中所述的成套引物；

（2）含有（1）所述的成套引物的PCR试剂；

（3）含有（1）所述的成套引物或（2）所述的PCR试剂的试剂盒。

12.权利要求9或10所述的方法或权利要求11所述的产品在选育番茄雄性不育株中的应用。

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