CN117487842A - 雄性不育基因ZmGMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用 - Google Patents

雄性不育基因ZmGMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物生物技术育种领域，具体提供雄性不育基因Zm GMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用。本发明所提供的雄性不育基因ZmGMS2具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明在野生型玉米中定点突变ZmGMS2基因，虽然花药可以正常形成，但花粉完全败育，首次发现了ZmGMS2基因对玉米雄性生殖发育的调控功能，对研究玉米雄性生殖发育具有重要意义。本发明还提供zmgms2雄性不育突变体的分子标记，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值。

Description

雄性不育基因ZmGMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术育种领域，具体提供雄性不育基因ZmGMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用。
背景技术
玉米种业健康发展对保障国家粮食安全有着重大的战略意义。同时，玉米种业也是全球市值最大、商业化程度最高、科技含量最高的种业领域，是全球种业竞争的战略要地。受限于玉米雄性不育基础研究尚未取得根本性突破等因素，导致玉米自交系知识产权保护困难，造成近年来玉米种业长期存在跟随性、模仿性育种现象，重大新品种选育效率缓慢。玉米制种产业仍然处于依靠人工去雄为主的阶段，成本高，资源消耗巨大，种子质量难以保障。
玉米是杂种优势利用最成功的作物之一，雄性不育系是作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料，根据雄蕊发育的特征，包括两种情况：一是不能产生正常的花粉，二是花粉育性正常但花药开裂异常不能及时散粉。根据控制的基因分类，雄性不育主要包括细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。CMS是由线粒体基因和核基因共同控制的，虽然已应用于玉米育种和杂交种生产中，但存在资源利用率低、不育系胞质单一、易感病等问题。GMS由核基因单独控制，可以克服CMS缺陷，但很难通过常规育种方法大量繁殖纯合不育系。近年来，随着生物技术的进步，通过基因工程和分子设计育种相结合创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，可以有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题。实现上述技术应用的重要前提是获得大量功能明确的控制玉米雄性发育的GMS基因和对应的雄性不育材料。
与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，玉米中已克隆和鉴定的GMS基因和创制的雄性不育材料均相对较少。CRISPR/Cas9(Clustered,Regularly Interspaced,ShortPalindromic Repeatsassociated Endonuclease 9)基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。
利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定玉米雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富玉米GMS基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用，最终可以有效解决玉米种业行业长期面临缺乏稳定的玉米不育系和突破性大品种的瓶颈问题。
发明内容
本发明提供雄性不育基因ZmGMS2及其在创制玉米雄性不育系中的应用。
第一方面，本发明提供ZmGMS2基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，所述ZmGMS2基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
1)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)所述氨基酸序列为将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的氨基酸序列。
在本发明所提供的ZmGMS2基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用中，所述ZmGMS2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供一种创制玉米雄性不育系的方法，在玉米植株中抑制所述ZmGMS2基因的表达和/或活性。
在本发明所提供的创制玉米雄性不育系的方法中，利用CRISPR/Cas9基因编辑来抑制ZmGMS2基因的表达和/或活性。
所述CRISPR/Cas9基因编辑包括：在所述ZmGMS2基因第1外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
第三方面，本发明提供一种适用于CRISPR/Cas9系统对植物ZmGMS2基因进行定向敲除的靶位点，所述靶位点包括：靶位点1(简称B1，如SEQ ID NO.3所示)：GGCGTCCGCCCACAACATCA和/或靶位点2(简称B2，如SEQ ID NO.4所示)：CGAGATCAATAGCCGGAGCT。
第四方面，本发明提供一种CRISPR/Cas9系统打靶载体，含有特异性靶向所述靶位点的sgRNA。
第五方面，本发明提供ZmGMS2突变基因，所述突变基因为野生型ZmGMS2外显子任意碱基突变造成氨基酸变异和/或蛋白功能异常从而造成雄性不育表型的核苷酸突变类型。
突变基因为ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第41位碱基至第166位碱基的缺失，序列如SEQ ID NO.19所示；或野生型ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第70位碱基至第159位碱基的缺失，序列如SEQ ID NO.20所示；或野生型ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第45位碱基至第110位碱基的缺失，并且37-38位TG碱基被替换为GT碱基，115位碱基A被替换为碱基G，序列如SEQ ID NO.21所示。
第六方面，本发明提供一种获得zmgms2雄性不育系的方法，包括：以上述方法获得的玉米雄性不育系作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的F1代与目标材料进行回交，从而使回交后代获得与所述玉米雄性不育系相同的性状和基因突变；
优选地，所述玉米雄性不育系中ZmGMS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQID NO.20或SEQ ID NO.21所示
第七方面，本发明提供与zmgms2雄性不育系连锁的共分离分子标记的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
第八方面，本发明提上述的靶位点或上述的sgRNA或上述的ZmGMS2突变基因或上述的引物在以下任一项中的应用：
(1)在调控玉米雄性育性性状中的应用；
(2)在玉米杂交育种和制种中的应用；
(3)玉米不育系的选育或种质资源改良中的应用。
所述的杂交育种和制种是指将zmgms2雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交；包括将获得的zmgms2雄性不育系与其他目标材料进行杂交，获得F1代后，与目标材料进行回交，从而使目标材料获得zmgms2雄性不育的性状和基因突变。
所述改良包括提高作物产量、提高作物品质、提高作物抗病虫害、抗逆、抗倒伏能力。
本发明的有益效果在于：
ZmGMS2(GRMZM2G003752)基因及编码的蛋白调控玉米雄性生殖发育是之前没有报道过的。本发明利用CRISPR/Cas9方法突变玉米基因ZmGMS2(GRMZM2G003752)，发现了ZmGMS2(GRMZM2G003752)基因对玉米花药发育的调控功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后获得的雄性不育突变体，可以创制玉米雄性不育系，从而可以应用于玉米杂交育种和制种。针对zmgms2的雄性不育系开发共分离分子标记，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ZmGMS2基因的表达模式分析。
图2为pEGCas9Pubi-B-ZmGMS2定点突变靶位点模式图。
图3为pEGCas9Pubi-B-ZmGMS2敲除表达载体图谱。
图4为CRISPR/Cas9基因编辑载体pEGCas9Pubi-B-ZmGMS2 Hind III酶切验证琼脂糖胶图。
图5为野生型ZmGMS2与其敲除株系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2、ZmGMS2-Cas9-3的DNA序列比对分析结果。
图6为野生型B104与敲除株系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2、ZmGMS2-Cas9-3纯合突变体的雄穗表型分析。
图7为野生型B104与敲除株系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2、ZmGMS2-Cas9-3纯合突变体的花药表型分析。
图8为野生型B104与敲除株系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2、ZmGMS2-Cas9-3纯合突变体的花粉碘化钾染色表型分析。
图9为利用共分离标记对ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2、ZmGMS2-Cas9-3不育系的F2代植株进行基因分型。
图10为实施例5的杂交转育的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1玉米ZmGMS2基因序列和表达模式分析
在maizeGDB库(https://www.maizegdb.org/)中，查询到玉米ZmGMS2(GRMZM2G003752)基因，在B73中的核酸序列见SEQ ID NO.1所示，基因功能注释为成束样阿拉伯半乳聚糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan protein)，其编码蛋白包含429个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
阿拉伯半乳聚糖蛋白是一类广泛分布于植物界的富含羟脯氨酸并高度糖基化的糖蛋白家族，它们主要分布在细胞质膜、质膜-细胞壁间隙、细胞壁和胞外基质中，功能涉及细胞间的信息交流和相互识别、细胞和细胞之间或细胞和基质之间的粘附，以及细胞和环境的相互作用等。由于ZmGMS2基因在玉米中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系，本发明首先利用基因表达数据库分析了该基因在玉米不同组织部位的表达模式(图1)。表达分析结果显示ZmGMS2基因在玉米雄穗和胚乳中高表达，在其他部位也有表达，但表达量较低。
实施例2玉米ZmGMS2基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法创制玉米雄性不育系
为了明确玉米ZmGMS2在玉米中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法定点突变GRMZM2G003752基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米自交系B104作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因编码区自起始密码子ATG开始第54位碱基至第73位碱基的SEQ ID NO.3和自起始密码子ATG开始第144位碱基至第163位碱基的SEQID NO.4所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域1(简称B1)和靶标区域2(简称B2)(见图2)。
1、ZmGMS2的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为pEGCas9Pubi-B-ZmGMS2(载体图谱见图3)，该载体的基础载体为pEGCas9Pubi-B。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sg RNA进而通过一步克隆法连接到基础载体中，具体的构建流程如下：
(1)靶标gRNA的设计。将ZmGMS2(GRMZM2G003752)的基因序列输入https://zlab.bio/guide-design-resources进行靶标设计。本发明选择的两个靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
(2)通过重叠PCR和巢式PCR扩增sgRNA表达盒。
第一轮PCR扩增U6，U3启动子和gRNA。PU6扩增体系：2X Pfu MIX：5μl；U-F引物(SEQID NO.9)：0.2μl；zmgms2-ZmU6a-T1引物(SEQ ID NO.10)或zmgms2-ZmU6b-T2引物(SEQ IDNO.11)：0.2μl；pZmU6a或pZmU6b模板：0.1μl；加ddH2O至10μl。gRNA扩增体系：2X Pfu MIX：5μl；gRNA-R引物(SEQ ID NO.12)：0.2μl；zmgms2-gR-T1引物(SEQ ID NO.13)或zmgms2-gR-T2(SEQ ID NO.14)：0.2μl；sgRNA模板：0.1μl；加ddH2O至10μl。PCR反应程序：95℃5min，95℃20s，55℃20s，72℃20s，72℃5min，20个循环反应。
第二轮PCR扩增sgRNA表达盒。sgRNA表达盒扩增体系：2X Pfu MIX 25μl，Pps-R引物(SEQ ID NO.15)：1μl，Pgs-L引物(SEQ ID NO.16)：1μl，第一轮pU6产物：0.5μl，第一轮gRNA产物：0.5μl，加ddH2O至50μl。PCR反应程序：95℃2min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，72℃5min，30个循环反应。
(3)通过酶切连接构建到骨架载体。将pEGCas9Pubi-B载体和回收的带有靶标的sgRNA片段用Bsa I消化，同时加入T4连接酶将pEGCas9Pubi-B载体和sgRNA片段连接。15μl的酶切连接体系如下，sgRNA片段：30ng/每个片段，pEGCas9Pubi-B载体：150ng，10×CutSmart Buffer：1.5μl，10mM ATP：1.5μl，Bsa I-HF：10U，T4 DNA ligase：35U，加ddH2O至15μl。酶切-连接PCR程序：37℃5s，20℃5s，15个循环反应。
(4)重组质粒pEGCas9Pubi-B-ZmGMS2转化及验证(酶切验证见图4)。取一管100ulDH5α大肠杆菌感受态细胞与2-5μl连接产物混合，冰浴30min；迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；加入500μl LB液体培养基，混匀；37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；将菌液均匀涂布于Kana抗性的LB固体培养基平板上；30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。使用SP-L(SEQ ID NO.17)/RB-R(SEQ ID NO.18)这对引物进行菌落PCR检测，条带大小约1296bp；检测出来的阳性菌斑，进行挑取摇菌。检测出来的阳性菌斑，进行挑取摇菌。菌落PCR扩增体系：2X Taq MIX：10μl，SP-L引物：0.5μl，RB-R引物：0.5μl，挑取少量菌落，加ddH2O至20μl。PCR反应程序：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃5min，25个循环反应。
2、农杆菌介导的玉米遗传转化
将上述构建的pCas9-ZmGMS2载体通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的玉米杂交种B104的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bial aphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3、T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测
为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：
本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：DNA提取方法参照传统CTAB法(Rogers and Bendich,1985)进行，略有改进。取3cm玉米叶片放入已灭菌2mL的离心管中，加入6mm钢珠，使用细胞破碎仪进行组织破碎，之后进行CTAB法提取，提取样品最后加入200μL的灭菌水(ddH2O)，溶解风干的样品DNA，待用。待DNA完全溶解之后，吸取2μL样品使用紫外分光光度计(Nanodrop 2000)进行核酸OD值(OD260/OD280)及核酸浓度测定，将DNA样品稀释至50ng/μL备用。
然后根据ZmGMS2基因序列设计PCR引物。
(1)检测靶标：MT1和MT2；产物大小：231bp；引物序列如下：
ZmGMS2-BF1(SEQ ID NO.5):5’CGCCTAATCCTGCTAGTCCT 3’；
ZmGMS2-BR1(SEQ ID NO.6):5’GAGTGCGTTCTTGATGTCGG 3’；
提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：
PCR使用Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg2+；Taq DNAPolymerase；2.5mM dNTPs；10×PCR Buffer)5μL，1μL引物(含各0.5μL正反向引物)，1μL模板DNA，ddH2O补足10μL。PCR扩增程序为常规SSR程序(94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环，最后72℃延伸5min)。扩增产物使用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，0.1％AgNO3染色，甲醛和NaOH显色拍照后统计基因型。
接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T0代独立阳性转化事件靶标区域的DNA序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现3个T0转化事件靶标区域序列发生了变化，且均为纯合突变，编辑前后的序列如图5所示，对应3个zmgms2突变体：ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2和ZmGMS2-Cas9-3。
对3个zmgms2突变体中核苷酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变后的品系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2和ZmGMS2-Cas9-3其编码的核苷酸在靶标处均发生了大片段的缺失，ZmGMS2-Cas9-1自起始密码子ATG开始第41位碱基至第166位碱基的缺失，126bp的碱基缺失使其丢失了42个氨基酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。ZmGMS2-Cas9-2自起始密码子ATG开始第70位碱基至第159位碱基的缺失，90bp的碱基缺失使其丢失了30个氨基酸，序列如SEQ ID NO.20所示。ZmGMS2-Cas9-3自起始密码子ATG开始第45位碱基至第110位碱基的缺失，并且37-38位TG碱基被替换为GT碱基，115位碱基A被替换为碱基G，66bp的碱基缺失使其丢失了22个氨基酸，序列如SEQ ID NO.21所示。
突变后的品系ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2和ZmGMS2-Cas9-3中编码的核苷酸缺失使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止。因此这些转化体中GRMZ M2G003752蛋白的功能均表现缺失。
实施例3zmgms2不育系的表型分析
1、zmgms2不育系的表型
上述实施例2鉴定的不含有Cas9基因的F1代植株自交后获得F2代种子，三种zmgms2突变类型(ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2和ZmGMS2-Cas9-3)各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。三种F2株系中，可育株与不育株的比例，均符合3:1分离，进一步表明zmgms2不育系的不育性状由单个隐性基因控制，然后针对F2代获得的稳定非转基因zmgms2不育系与野生型进行详细的表型比较。
2、zmgms2不育系的雄穗、花药和花粉活力的观察
在营养生长和雌穗的发育方面，zmgms2不育系(ZmGMS2-Cas9-1、ZmGMS2-Cas9-2和ZmGMS2-Cas9-3)的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而zmgms2不育系虽能正常抽雄，也能正常开花，但是花药干瘪瘦小(图6和图7)；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，而突变体花粉粒不能染色(图8)。这表明ZmGMS2(GRMZM2G003752)基因通过影响花药的雄配子发育来控制玉米的雄性发育。
实施例4zmgms2不育系鉴定的共分离分子标记开发和应用
1、共分离分子标记的开发
在本发明中，针对获得的三种zmgms2不育系的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出一对共分离分子标记：ZmGMS2-BF1(SEQ ID NO.5)和ZmG MS2-BR1(SEQ IDNO.6)，结合PCR与琼脂糖及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG E)或琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
如图9所示，共分离分子标记ZmGMS2-BF1/BR1能够特异性检测玉米ZmGMS2-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因zmgms2，并能同时区分野生型ZmGMS2基因和突变型zmgms2基因；针对突变基因zmgms2中扩增出105bp的条带，而对野生型ZmGMS2基因扩增出231bp的条带；该标记也能够特异性检测玉米ZmG MS2-Cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因，并能同时区分野生型ZmGMS2基因和突变型zmgms2基因；针对突变基因zmgms2中扩增出141bp的条带，而对野生型ZmGMS2基因扩增出231bp的条带引物序列如下：该标记也能够特异性检测玉米ZmGMS2-Cas9-3突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因，并能同时区分野生型ZmGMS2基因和突变型zmgms2基因；针对突变基因zmgms2中扩增出165bp的条带，而对野生型ZmGMS2基因扩增出231bp的条带引物序列如下：
2、共分离分子标记的应用
为了验证上述标记的有效性，以实施例3中获得的F2株系为材料，进行ZmGMS2等位基因的检测。DNA提取方法、PCR扩增体系和条件同实施例2，PCR产物进行琼脂糖和PAGE电泳分离。
理论上，ZmGMS2-BF1/BR1在ZmGMS2/ZmGMS2纯合野生型(AA)DNA中能分别扩增出231bp的条带，在zmgms2/zmgms2纯合突变型材料(aa)DNA中分别扩增出105bp或141bp或165bp的条带，而在ZmGMS2/zmgms2杂合型(Aa)材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ZmGMS2-BF1/BR1分子标记的验证结果如图9所示，结果显示设计的功能性分子标记对F2植株的检测结果完全符合预期，在ZmGM S2/ZmGMS2纯合野生型(AA)、ZmGMS2/zmgms2杂合型(Aa)和zmgms2/zmgms2纯合突变型材料(aa)中分别扩增出对应大小的条带，可以作为ZmGMS2等位基因检测的理想标记。
实施例5用本发明分子标记进行ZmGMS2转基因和zmgms2突变基因的不育系转育
用zmgms2突变体与育性正常的受体，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行ZmGMS2基因和遗传背景选择，最终获得目标受体背景下带有纯合ZmGM S2基因的隐性核不育系(图10)。下面以郑单958为例，具体转育实施步骤如下：
1、以受体亲本，如郑单958，为父本与zmgms2杂交获得F1。
2、以F1为母本与受体亲本，如郑单958，回交获得BC1F1。
3、种植BC1F1，使用序列如SEQ ID NO.5-6的引物检测ZmGMS2基因型。选择ZmGMS2杂合基因型，即同时能扩增出231bp和105bp或同时能扩增出231bp和141bp或同时能扩增出231bp和165bp条带的植株。
4、使用一组基因型(例如100个，或200个等)在zmgms2突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。
5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如郑单958，回交获得BC2F1。
6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出ZmGMS2基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。
7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出ZmGMS2基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的ZmGMS2纯合基因型植株即ZmGMS2隐性核不育系，BC2F3用于保存ZmGMS2隐性核不育系种质资源。用字母G来命名隐性核不育系，例如本实施例中郑单958的ZmGMS2纯合隐性核不育系被命名为郑单958G。
以上仅以郑单958作为转育实施例，但并不限于郑单958，可以为任何玉米材料。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.ZmGMS2基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述ZmGMS2基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
1)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)所述氨基酸序列为将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZmGMS2基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
3.一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，在玉米植株中抑制权利要求1或2所述ZmGMS2基因的表达和/或活性。
4.根据权利要求3所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑来抑制ZmGMS2基因的表达和/或活性。
5.一种适用于CRISPR/Cas9系统对植物ZmGMS2基因进行定向敲除的靶位点，其特征在于，所述靶位点包括：如SEQ ID NO.3所示的靶位点1：GGCGTCCGCCCACAACATCA和/或如SEQID NO.4所示的靶位点2：CGAGATCAATAGCCGGAGCT。
6.一种CRISPR/Cas9系统打靶载体，其特征在于，含有特异性靶向权利要求5所述靶位点的sgRNA。
7.ZmGMS2突变基因，其特征在于，所述突变基因为野生型ZmGMS2外显子任意碱基突变造成氨基酸变异和/或蛋白功能异常从而造成雄性不育表型的核苷酸突变类型；
优选的，突变基因为野生型ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第41位碱基至第166位碱基的缺失，序列如SEQ ID NO.19所示；或野生型ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第70位碱基至第159位碱基的缺失，序列如SEQ ID NO.20所示；或野生型ZmGMS2基因自起始密码子ATG开始第45位碱基至第110位碱基的缺失，并且37至38位TG碱基被替换为GT碱基，115位碱基A被替换为碱基G，序列如SEQ ID NO.21所示。
8.一种获得zmgms2雄性不育系的方法，其特征在于，包括：以权利要求3-4任一项所述方法获得的玉米雄性不育系或含有权利要求7所述ZmGMS2突变基因的玉米雄性不育系作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的F1代与目标材料进行回交，从而使回交后代获得与所述玉米雄性不育系相同的性状和基因突变；
优选地，所述玉米雄性不育系中ZmGMS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20或SEQ ID NO.21所示。
9.与zmgms2雄性不育系连锁的共分离分子标记检测引物，其特征在于，所述检测引物的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
10.权利要求5所述的靶位点或权利要求6所述的sgRNA或权利要求7所述的ZmGMS2突变基因或权利要求9所述的引物在以下任一项中的应用：
(1)在调控玉米雄性育性性状中的应用；
(2)在玉米杂交育种和制种中的应用；
(3)玉米不育系的选育或种质资源改良中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439667A (zh) * 2017-09-30 2019-03-08 海南波莲水稻基因科技有限公司 玉米基因ZmABCG20在调控作物雄性育性中的应用
CN109852590A (zh) * 2018-12-13 2019-06-07 海南波莲水稻基因科技有限公司 玉米ipe1突变体及其检测方法与应用
CN112961231A (zh) * 2021-03-12 2021-06-15 北京科技大学 雄性不育基因ZmbHLH122及其在创制玉米雄性不育系中的应用
CN113754746A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 海南波莲水稻基因科技有限公司 水稻雄性育性调控基因、其应用以及利用CRISPR-Cas9调控水稻育性的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439667A (zh) * 2017-09-30 2019-03-08 海南波莲水稻基因科技有限公司 玉米基因ZmABCG20在调控作物雄性育性中的应用
CN109852590A (zh) * 2018-12-13 2019-06-07 海南波莲水稻基因科技有限公司 玉米ipe1突变体及其检测方法与应用
CN113754746A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 海南波莲水稻基因科技有限公司 水稻雄性育性调控基因、其应用以及利用CRISPR-Cas9调控水稻育性的方法
CN112961231A (zh) * 2021-03-12 2021-06-15 北京科技大学 雄性不育基因ZmbHLH122及其在创制玉米雄性不育系中的应用

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