CN109852590A - 玉米ipe1突变体及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玉米IPE1突变体及其检测方法与应用，本发明提供的玉米IPE1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的玉米IPE1突变体能够导致玉米雄性的完全不育，而且仅影响玉米的雄性育性性状，对雌性育性性状以及各种农艺性状均没有影响；同时，IPE1突变体为基因内部点突变，不会影响IPE1基因两侧相邻基因的功能。因此，玉米IPE1突变体能够直接用于杂交玉米选育、不育系改良等玉米的遗传育种和种质改良，具有极大的推广应用潜力和经济价值。本发明还提供了的IPE1突变体的检测方法，能够实现快速准确的IPE1突变体和玉米雄性育性性状的检测。

Description

玉米IPE1突变体及其检测方法与应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及玉米IPE1突变体及其检测方法与应用。

背景技术

植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育、细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：(1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，可分为显性突变和隐性突变，也可分为孢子体基因突变和配子体基因突变。其中，显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传；隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的MS2，玉米的MS45和水稻的MIL1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因MS44。(2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属于母性遗传。(3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核的遗传物质不匹配的结果。不育细胞质是由一些线粒体基因突变引起，但有相对应的核恢复基因，能够抑制不育细胞质基因；不育细胞质基因可产生新的蛋白质，能够影响线粒体正常功能。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因。

玉米在中国乃至全世界的粮食生产中有着举足轻重的地位。2013年，中国玉米的总产量达到2.15亿吨，占据粮食总产量的35％，首次超过水稻成为第一大粮食作物。玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，可以使用机械去雄、化学杀雄等方法，但是这些策略也存在一些问题：一方面使用这些方法大大增加了制种的成本，另一方面因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上的大面积减产，最终造成经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。

玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上一直没有得到有效的利用。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和应用方面的尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试核不育材料在玉米生产中的应用并没有得到推广。

随着现代生物技术的迅速发展，部分玉米核雄性不育材料的不育机理逐渐明确，为分子设计创制稳定的玉米不育系奠定了理论基础。利用人工诱变，如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，研究人员获得了多种玉米新的不育突变体，ipe1突变体是其中之一。IPE1突变体的花药不能产生成熟的花粉粒。IPE1基因作为不育基因已被克隆，其编码区有3个外显子，编码一个582个氨基酸的蛋白(Chen,et al.IRREGULAR POLLEN EXINE1is anovel factor in anther cuticle and pollen exine formation.Plant Physiology,2017,173：307-325)。IPE1基因主要在早期单核小孢子时期的绒毡层中特异表达。IPE1编码一种GLC-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶，在其N端含有一段27个氨基酸的能够锚定在内质网中的前导肽，该蛋白的N端和C端分别含有一个GMC结构域，参与花粉外壁和角质层的形成。IPE1的缺失突变，引起绒毡层降解，花粉外壁不能形成，最终没有花粉粒，导致完全雄性不育。其中，ipe1-1突变体来源于Mu3转座子插入突变体，ipe1-2突变体是缺失整个基因片段造成，ipe1-3突变体则是在第691位碱基后插入1331个碱基造成，然而，这些突变体均可能存在潜在的非目标性状变异，为其应用带来潜在的不利影响。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种玉米IPE1突变体及其检测方法与应用。

本发明通过对玉米品种京科糯2000种子进行钴60辐射诱变处理，处理后的种子经种植获得M1代植株，通过种植M1代植株的自交种获得M2代植株。对M2代植株进行形态学、组织化学和遗传学鉴定，筛选不育植株，然后通过图位克隆和DNA测序得到导致玉米雄性不育性状的突变基因ipe1-2805(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，其为玉米IPE1基因第1837位(以起始密码子的第一个碱基为第1位计算)的碱基C突变为A，导致编码蛋白的第555位的丝氨酸突变为酪氨酸(ipe1-2805编码的突变后的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，编码的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该突变位点位于玉米IPE1基因的第3外显子上。

首先，本发明提供一种玉米IPE1突变体，以玉米的野生型IPE1的氨基酸序列为参考序列，所述玉米IPE1突变体含有第555位丝氨酸突变为酪氨酸的突变位点。

本发明中，所述玉米的野生型IPE1由玉米的野生型IPE1基因编码，所述玉米的野生型IPE1基因为B73_RefGen_v4数据库中ID为GRMZM2G434500的基因。

具体地，本发明所述的玉米IPE1突变体具有如下任意一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

进一步地，本发明提供编码所述玉米IPE1突变体的基因。

优选地，所述编码玉米IPE1突变体的基因的CDS具有如下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明中，所述严格条件为本领域公知的核苷酸杂交的严格条件，如：在含400mMNaCl、40mM PIPES(pH6.4)和l mM EDTA的杂交液中，于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS和0.1×SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

作为本发明的优选实施方式，所述编码玉米IPE1突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，本发明还提供含有所述编码IPE1突变体的基因的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。

本发明通过实验发现，所述IPE1突变体能够导致植物的花粉粒发育异常，导致植物的隐性核雄性不育，因此，本发明还提供所述编码玉米IPE1突变体的基因或含有所述基因的生物材料的如下任意一种应用：

(1)在调控植物花药或花粉粒形成中的应用；

(2)在调控植物雄性育性中的应用；

(3)在制备转基因植物中的应用；

(4)在植物种质资源改良中的应用。

优选地，所述调控植物花药或花粉粒形成为下调植物花药或花粉粒的发育；所述调控植物雄性育性为降低植物的雄性育性。

本发明中，所述植物包括但不限于玉米、水稻、拟南芥、小米、二穗短柄草、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、短药野生稻、非洲栽培稻、棉花和高粱。

优选地，所述植物为玉米。

本发明中，转基因植物的制备和植物的遗传育种为本领域常规技术手段，本发明不另作限定，利用本发明所述IPE1突变体基因进行植物的转基因或遗传育种的技术方案均在本发明的保护范围之内。

本发明还提供用于检测所述的玉米IPE1突变体的基因或玉米雄性核不育性状的分子标记，其含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第1837位碱基由C突变为A的突变位点。

进一步地，本发明提供所述分子标记的检测引物，其具有如下核苷酸序列：

SEQ ID NO.10：正向引物2805_F：

CAGCTCCACGTTCAAGGACT；

SEQ ID NO.11：反向引物2805_R：

ATCATTTCCTCCATCTCTCGG。

更进一步地，本发明提供含有所述分子标记的检测引物的试剂盒。

此外，本发明还提供所述分子标记或所述的检测引物或含有所述检测引物的试剂盒在检测玉米IPE1突变体或玉米雄性核不育性状中的应用。

本发明还提供所述玉米IPE1突变体的基因或玉米雄性核不育性状的检测方法，所述方法包括采用检测引物正向引物2805_F和反向引物2805_R或包括上述检测引物的试剂盒扩增待检玉米的IPE1基因片段，分析扩增产物的序列特征的步骤。

所述分析扩增产物的序列特征可以采用本领域任意常规的方法，包括但不限于DNA测序、限制性内切酶酶切等。

优选地，所述分析扩增产物的序列特征为采用Hinf I酶切扩增产物，通过电泳检测酶切产物的条带类型，判断IPE1的基因型。

所述判断IPE1的基因型的方法如下：当酶切产物大小为91bp时，待检玉米的IPE1基因型为野生型(第1837位的碱基为C/C)，待检玉米表现为雄性可育；当酶切产物大小为107bp时，待检玉米的IPE1基因型为突变体(第1837位的碱基为A/A)，待检玉米表现为雄性不育；当酶切产物大小分别为91bp和107bp时，待检玉米的IPE1基因型为野生型和突变体的杂合基因型(第1837位的碱基为C/A)，待检玉米表现为雄性可育。

本发明通过诱变获得一种玉米IPE1突变体，该突变体导致玉米的隐形雄性核不育，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的玉米IPE1突变体能够导致玉米雄性的完全不育，而且仅影响玉米的雄性育性性状，对雌性育性性状以及株高、叶色、抽穗期等其它农艺性状均没有影响；同时，IPE1突变体为基因内部点突变，不会影响IPE1基因两侧相邻基因的功能。因此，玉米IPE1突变体能够直接用于杂交玉米选育、不育系改良等玉米的遗传育种和种质改良，具有优秀的推广应用潜力和巨大的经济价值。

(2)本发明提供的玉米隐性核雄性不育突变体，丰富了玉米雄性核不育突变体材料库，为发展雄性不育制种方法奠定了材料基础。

(3)本发明提供了的IPE1突变体的检测方法，通过引物设计在突变位点添加酶切位点，经PCR扩增和酶切后即可通过电泳检测条带类型，进而判断IPE1的基因型；该方法具有简单、高效等优势，能够实现快速准确的IPE1基因型和玉米雄性育性性状检测。

附图说明

图1为本发明实施例2中野生型京科糯2000和ipe1-2805突变体的花药形态和花粉碘染显微镜观察结果；其中，A为野生型京科糯2000的花药形态，B为ipe1-2805突变体的花药形态，C为野生型京科糯2000花粉碘染的观察结果，D为ipe1-2805突变体花粉碘染的观察结果。

图2为本发明实施例3中ipe1-2805突变体IPE1基因的突变位点及氨基酸残基改变示意图。

图3为本发明实施例4中京科糯2000与ipe1-2805的M3群体中可育株和不育株的IPE1基因型鉴定。泳道1：京科糯2000；泳道2-16：M3表型不育株；泳道17-31：M3表型正常株。

图4为本发明实施例5的IPE1基因突变体的杂交转育技术路线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1钴60辐射诱变突变体库的构建和育性突变体的获得

2015年秋，于长沙用钴60辐射京科糯2000种子3公斤(M₁代)，2015年10月种植于海南三亚田间，分单株收获M₁代的种子，共收获约5495份种子。

2016年春季，选取4678份M₁代的种子种成M₂株系，每个株系50株，种植于海南临高田间。在孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。每个株系收6个单株，共收获28068个单株作为突变体库资源保存。

其中，对于育性性状的筛查，在M₂代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为2805的家系中发现6株育性异常的植株(命名为2805突变体)，该突变体花药比野生型瘪小，颜色浅黄，无可见花粉，但在营养生长、株高、叶色、抽穗期、穗型等农艺性状方面均与野生型没有明显区别，被选作候选突变体材料进行下一步研究。

实施例2育性突变体小花表型的鉴定及其遗传分析

在体式显微镜下观察2805突变体的小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，但突变体的花药比野生型小(如图1的A所示)，颜色较浅(如图1的B所示)。田间采集开花期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)中轻轻挤压花药，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照。野生型花粉多而染成蓝黑色(如图1的C所示)，而突变体则看不到花粉粒如图1的D所示)。

2805突变体在开放授粉下可正常结实，表明该突变体为雄性不育突变体，雌性不受影响。对同家系野生型植株进行套袋自交，均正常结实，获得5份M3种子。将M3种子播种种成株系，抽穗后鉴定育性，其中3个株系的雄性育性发生分离。将分离株系的花药碘染后在显微镜下观察，其中115株花粉正常碘染，42株染败，符合3∶1分离，表明突变体的不育性状由单个隐性基因控制。

实施例3 IPE1基因突变体的获得和序列分析

通过对所有玉米育性控制基因的扩增和序列分析发现，导致2805突变体育性性状的基因突变为IPE1基因突变体，其中，IPE1基因突变体的扩增和序列分析方法如下。

1、玉米基因组DNA的提取

采用CTAB法提取玉米的基因组DNA，具体步骤如下：取3cm长的玉米叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/LEDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH₂O溶解DNA。

2、IPE1基因的PCR扩增与产物回收

根据玉米自交系B73的IPE1基因序列设计引物，分别以野生型京科糯2000和2805突变体的基因组DNA为模板，以表1中的引物扩增，扩增产物经测序后拼接出完整序列。

用于扩增玉米IPE1的引物对序列见下表1：

表1用于扩增IPE1的引物对序列

PCR反应体系(10μL)为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL 10mM dNTP，0.25μL 10μM正向引物和0.25μL 10μM反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。

PCR反应程序为：95℃变性3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30-40个循环。循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。

配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用市售DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

3、DNA序列分析

用ABI3730测序仪对上述回收所得的野生型与2805突变体的PCR产物进行DNA测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接；2805突变体的IPE1基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，由1922个碱基组成，将2805突变体玉米的IPE1基因命名为ipe1-2805。对野生型和突变体序列进行比对发现，在IPE1基因的基因组序列的第1837位的C碱基替换为A碱基(图2)；该突变位点位于第3外显子上。蛋白序列比对分析显示，上述碱基突变引起了IPE1蛋白的555位丝氨酸转变为酪氨酸(图2)，该突变位点在C端的GMC结构域上，导致2805突变体中IPE1基因编码的GLC-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶的功能丧失。

实施例4 IPE1突变体的分子标记和检测引物的设计以及基因型-表型共分离的鉴定

1、IPE1突变体的分子标记和检测引物的设计

根据实施例3中得到的IPE1突变体的突变位点两侧的序列设计基因特异引物，序列如下：

SEQ ID NO.10：正向引物2805_F：CAGCTCCACGTTCAAGGACT；

SEQ ID NO.11：反向引物2805_R：ATCATTTCCTCCATCTCTCGG。

上述扩增引物在突变位点处引入了Hinf I的酶切位点，因此，上述引物扩增后可以采用Hinf I酶切进行扩增产物的序列类型的鉴定，具体如下：如果酶切产物长91bp，则待检玉米的IPE1基因型为野生型；如果酶切产物长107bp，则待检玉米的IPE1基因型为ipe1-2805突变体；如果酶切产物为91bp和107bp两种带型，则待检玉米的IPE1基因型为野生型和突变体的杂合型。

2、IPE1突变体的基因型-表型共分离的鉴定

在实施例2获得的有表型分离的M₃群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株，提取叶片DNA。将上述获得的M3群体的野生型和突变体植株的DNA与京科糯2000基因组DNA分别以2805_F和2805_R引物进行扩增。

PCR反应体系(10μL)为：10×反应缓冲液1μL，10mM dNTP0.25μL，10μM引物2805_F1、2805_R1各0.25μL，Taq酶0.5U，10ng/μL模板DNA 1μL，加超纯水将总体积补至10μL；

PCR反应程序为：95℃变性3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，55℃复性20s，72℃延伸30s，35个循环。

扩增产物用HinfI酶切，酶切方法如下：按照PCR扩增产物10μL、去核酸酶水18μL、10×Buffer R 2μL、HinfI 1-2μL混合各反应物，微离心几秒钟，在37℃下孵育1-2小时，最后在80℃下终止反应20分钟。

酶切产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如下：

(1)聚丙烯酰胺胶的配制：6％PA胶80mL，10％过硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2％的Repel Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另一块平板涂上0.5％的Binding Silane 1.5mL(在1.5ml离心管中加入7.5μL Binding Silane和7.5μL冰醋酸，补足95％乙醇至1.5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。

(2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽(阴极)装入1×TBE的电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入0.5×TBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。

(3)电泳：扩增产物中加入5μl的5×Loading Buffer混合后，95℃变性5分钟，立刻转移到冰上冷却，吸取1.5-3μl加入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。

(4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2次，每次5min；将冲洗后的胶板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸银、3mL 37％甲醛)中65r/min摇动30min；将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶板快速转移到4℃预冷的显影液(2L水中加入30g氢氧化钠，10ml 37％甲醛)，轻轻摇动至带纹出现；将胶板置于10％的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次2min；室温下自然干燥后，拍照保存图像。

电泳结果如图3所示，M3群体中表型为野生型的植株的扩增产物用HinfI酶切，酶切产物全部为大小为91bp的一条带或大小分别为91bp和107bp的两条带；突变体的酶切产物全部为大小为107bp的一条带。结果表明，实施例3中所述IPE1基因的突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。基因型-表型共分离的结果结合玉米突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可以确定2805突变体的雄性不育表型是由实施例3所述的IPE1基因的突变造成的。

实施例5 IPE1基因突变体的杂交转育

按图4的步骤将2805突变体的不育突变基因ipe1-2805通过杂交转育到其它遗传背景的玉米中：

①杂交：

以2805为母本，以受体玉米材料为父本，杂交获得F₁种子；

②第一轮回交：

F₁播种后获得F₁植株，将F₁植株与轮回亲本进行杂交，获得BC₁种子；

③BC₁不育基因的选择(前景选择)：

播种BC₁种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例3中所述方法提取DNA，以实施例4中所述的检测引物2805_F和2805_R和检测方法进行扩增、酶切和电泳，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；

④BC₁背景选择：

采用一组(例如100个，或200个等)在2805和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；

⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC₂种子；

⑥BC₂的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC₂代植株；

⑦自交获得BC₂F₂种子：对步骤⑥中选出的BC₂植株进行自交，获得BC₂F₂种子；

⑧BC₂F₂的前景选择：将步骤⑦中获得的BC₂F₂种子播种，获得500株以上幼苗，在幼苗期采集叶片，以实施例3中所述方法提取DNA，以实施例4中所述的检测引物2805_F和2805_R以及检测方法进行扩增、酶切和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；

⑨BC₂F₂的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的2805_F/2805_R引物对扩增后酶切带型为纯合突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交后保存玉米材料，或与其它玉米材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存玉米种质，或通过自交获得不育株再用于杂交育种或制种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 玉米IPE1突变体及其检测方法与应用

<130> KHP181117641.0

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Pro Gly Leu Ala Asn Trp Val Ala Leu Val Leu Thr Val Leu

1 5 10 15

Leu Gly Leu Ser Cys Leu Val Val Ala Leu Ser Glu Asp Glu Thr Leu

20 25 30

Asp Lys Leu Arg Phe Val Arg His Ala Gln Asp Ala Pro Leu Val Ser

35 40 45

Gln Tyr Asn Tyr Ile Val Ile Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Pro Leu

50 55 60

Ala Ala Thr Leu Ser Glu His Ser Arg Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser Arg Asn Met Ser Asp Gln Gln His Phe Thr Asp Ala

85 90 95

Leu Ala Asp Thr Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gln Arg Phe Val Ser Glu

100 105 110

Asp Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Cys

115 120 125

Leu Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Arg Ala Ser Thr Asp Tyr Val Arg Ala

130 135 140

Ala Gly Trp Asp Ala Arg Leu Val Asn Ser Ser Tyr Arg Trp Val Glu

145 150 155 160

Arg Ala Leu Val Phe Arg Pro Ala Val Pro Pro Trp Gln Ala Ala Leu

165 170 175

Arg Asp Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Thr Pro Asp Asn Gly Phe Thr

180 185 190

Phe Asp His Val Thr Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr Ile Phe Asp Ser

195 200 205

Ser Gly Gln Arg His Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg His Ala Arg Pro

210 215 220

Arg Gly Leu Thr Val Phe Leu Tyr Ala Thr Val Ser Arg Ile Leu Phe

225 230 235 240

Arg Gln Gln Glu Gly Val Pro Tyr Pro Val Ala Tyr Gly Val Val Phe

245 250 255

Thr Asp Pro Leu Gly Val Gln His Arg Val Tyr Leu Arg Asp Gly Ala

260 265 270

Lys Asn Glu Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Leu Gly Ser Pro Gln Leu

275 280 285

Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Gln Ala His Leu Glu Ala His Gly

290 295 300

Val Gln Val Leu Val Asp Gln Pro Met Val Gly Gln Gly Val Ala Asp

305 310 315 320

Asn Pro Met Asn Ser Val Phe Ile Pro Ser Pro Val Pro Val Thr Leu

325 330 335

Ser Leu Val Gln Val Val Gly Ile Thr Arg Ser Gly Ser Phe Ile Glu

340 345 350

Gly Val Ser Gly Ser Glu Phe Gly Ile Pro Val Ser Glu Gly Ala Arg

355 360 365

Arg Leu Ala Arg Ser Phe Gly Leu Phe Ser Pro Gln Thr Gly Gln Leu

370 375 380

Gly Thr Leu Pro Pro Lys Gln Arg Thr Pro Glu Ala Leu Glu Arg Ala

385 390 395 400

Ala Glu Ala Met Arg Arg Leu Asp Arg Arg Ala Phe Arg Gly Gly Phe

405 410 415

Ile Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Val Ser Ser Gly His Val Glu Leu

420 425 430

Arg Ser Ala Asp Pro Arg Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Asn Tyr Phe

435 440 445

Gln Glu Ser Glu Asp Leu Gln Arg Cys Val Arg Gly Ile Gln Thr Ile

450 455 460

Glu Arg Val Ile Gln Ser Arg Ala Phe Ala Asn Phe Thr Tyr Ala Asn

465 470 475 480

Ala Ser Thr Glu Ser Ile Phe Thr Asp Ser Ala Asn Phe Pro Val Asn

485 490 495

Leu Leu Pro Arg His Val Asn Asp Ser Arg Thr Pro Glu Gln Tyr Cys

500 505 510

Arg Asp Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His Gly Gly Cys Gln Val

515 520 525

Gly Ala Val Val Asp Asp Asp Tyr Arg Val Phe Gly Val Gln Arg Leu

530 535 540

Arg Val Ile Asp Ser Ser Thr Phe Lys Tyr Tyr Pro Gly Thr Asn Pro

545 550 555 560

Gln Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met Gly Val Lys Ile Gln

565 570 575

Ala Glu Arg Trp Arg Lys

580

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgcctg ggcttgcgaa ctgggtcgcg ctggttctga ccgtcctcct tggtctctcg 60

tgcctcgtcg tcgcgctctc ggaggatgaa acactggaca agctgcggtt cgtgcgccac 120

gcacaggacg cgcccctggt gtcgcagtac aactacatcg tgatcggcgg cggcacggcg 180

gggtgcccgc tggcggcgac gctgtcggag cactcgcgcg tgctgctcct ggagcgcggg 240

ggcctcccgt cccgcaacat gtccgaccag cagcacttca cggacgcgct ggcggacacg 300

tccccggcgt cgcccgcgca gcggttcgtg tccgaggacg gcgtggtgaa cgcgcgggcc 360

cgggtgctgg gcgggggcag ctgcctcaac gccgggttct acacgcgggc cagcaccgac 420

tacgtgcgcg ccgccggctg ggacgcccgc ctcgtcaact cgtcctaccg ctgggtggag 480

cgcgcgctcg tgttccgccc cgccgtgccc ccgtggcagg ccgcgctccg cgacgcgctg 540

ctcgaggccg gcgtcacgcc cgacaacggc ttcaccttcg accacgtcac gggcaccaag 600

atcgggggca ccatcttcga cagcagcggc cagcgccaca ccgccgccga cttcctccgc 660

cacgcgcgcc ccagggggct caccgtgttc ctctacgcta ccgtctccag gatcctcttc 720

agacagcaag agggcgtgcc gtacccggtg gcgtacggtg tggtgttcac ggacccgctc 780

ggggtgcagc accgggtgta cctccgggac ggcgccaaga acgaggtgat cctgtcggcg 840

gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tcggcccgca ggcgcacctg 900

gaggcgcacg gcgtccaggt gctggtggac cagcccatgg tcgggcaggg cgtggctgac 960

aacccgatga actcggtgtt catcccgtcg ccggtgcccg tcacgctgtc gctcgtgcag 1020

gtcgtcggga tcacccggtc cggcagcttc atcgagggcg tgagcggctc cgagttcggc 1080

atccccgtct ccgagggcgc ccgtcgcctg gctcgcagct tcggcctctt ctctccgcag 1140

acggggcagc tgggcacgtt gccgccgaag cagagaaccc cagaggccct ggagcgcgcg 1200

gcggaggcga tgcggcggct ggacaggcgg gcgttccggg gcggattcat cctggagaag 1260

atcctgggcc ccgtctcctc gggccacgtc gagctgcggt ccgccgaccc gcgcgcgaac 1320

ccggcggtga cgttcaacta cttccaggag tcggaggacc tgcagcggtg cgtgcgcggc 1380

atccagacga tcgagcgcgt gatccagtcc cgggccttcg ccaacttcac ctacgccaac 1440

gcttccacgg agtccatctt caccgactcc gccaacttcc ccgtcaacct cctgccgcgg 1500

cacgtcaacg actcccggac gcccgagcag tactgcaggg acaccgtcat gaccatctgg 1560

cattaccacg gcgggtgcca ggtcggcgcc gtcgtggacg acgattaccg ggtgttcggc 1620

gtgcagcgac tgagggtgat cgacagctcc acgttcaagt actaccccgg caccaacccg 1680

caggccaccg tcatgatgct cggaaggtat atgggtgtga aaattcaggc cgagagatgg 1740

aggaaatga 1749

<210> 3

<211> 1922

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcgcctg ggcttgcgaa ctgggtcgcg ctggttctga ccgtcctcct tggtctctcg 60

tgcctcgtcg tcgcgctctc ggaggatggt ttgtgccgga cttgtcacgc gctctttggt 120

atttctgcag ttctgcaaac gtgtgaattg gcatggacat gtgcagaaac actggacaag 180

ctgcggttcg tgcgccacgc acaggacgcg cccctggtgt cgcagtacaa ctacatcgtg 240

atcggcggcg gcacggcggg gtgcccgctg gcggcgacgc tgtcggagca ctcgcgcgtg 300

ctgctcctgg agcgcggggg cctcccgtcc cgcaacatgt ccgaccagca gcacttcacg 360

gacgcgctgg cggacacgtc cccggcgtcg cccgcgcagc ggttcgtgtc cgaggacggc 420

gtggtgaacg cgcgggcccg ggtgctgggc gggggcagct gcctcaacgc cgggttctac 480

acgcgggcca gcaccgacta cgtgcgcgcc gccggctggg acgcccgcct cgtcaactcg 540

tcctaccgct gggtggagcg cgcgctcgtg ttccgccccg ccgtgccccc gtggcaggcc 600

gcgctccgcg acgcgctgct cgaggccggc gtcacgcccg acaacggctt caccttcgac 660

cacgtcacgg gcaccaagat cgggggcacc atcttcgaca gcagcggcca gcgccacacc 720

gccgccgact tcctccgcca cgcgcgcccc agggggctca ccgtgttcct ctacgctacc 780

gtctccagga tcctcttcag acagcaaggt acgtacgtgc gtgcacggct tccgcatttt 840

tttttcgaca gtgcgggctg gcacgatcgc gctctgaagc ggagaatcgt gcgctgtcga 900

cagagggcgt gccgtacccg gtggcgtacg gtgtggtgtt cacggacccg ctcggggtgc 960

agcaccgggt gtacctccgg gacggcgcca agaacgaggt gatcctgtcg gcggggacgc 1020

tggggagccc gcagctgctg atgctgagcg gcgtcggccc gcaggcgcac ctggaggcgc 1080

acggcgtcca ggtgctggtg gaccagccca tggtcgggca gggcgtggct gacaacccga 1140

tgaactcggt gttcatcccg tcgccggtgc ccgtcacgct gtcgctcgtg caggtcgtcg 1200

ggatcacccg gtccggcagc ttcatcgagg gcgtgagcgg ctccgagttc ggcatccccg 1260

tctccgaggg cgcccgtcgc ctggctcgca gcttcggcct cttctctccg cagacggggc 1320

agctgggcac gttgccgccg aagcagagaa ccccagaggc cctggagcgc gcggcggagg 1380

cgatgcggcg gctggacagg cgggcgttcc ggggcggatt catcctggag aagatcctgg 1440

gccccgtctc ctcgggccac gtcgagctgc ggtccgccga cccgcgcgcg aacccggcgg 1500

tgacgttcaa ctacttccag gagtcggagg acctgcagcg gtgcgtgcgc ggcatccaga 1560

cgatcgagcg cgtgatccag tcccgggcct tcgccaactt cacctacgcc aacgcttcca 1620

cggagtccat cttcaccgac tccgccaact tccccgtcaa cctcctgccg cggcacgtca 1680

acgactcccg gacgcccgag cagtactgca gggacaccgt catgaccatc tggcattacc 1740

acggcgggtg ccaggtcggc gccgtcgtgg acgacgatta ccgggtgttc ggcgtgcagc 1800

gactgagggt gatcgacagc tccacgttca agtactcccc cggcaccaac ccgcaggcca 1860

ccgtcatgat gctcggaagg tatatgggtg tgaaaattca ggccgagaga tggaggaaat 1920

ga 1922

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcccaatata taagcgagcc gaac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtccgtgaac accacaccgt a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaccgtgtt cctctacgct a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctctggggtt ctctgcttcg 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctcttctct ccgcagac 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacccagtta cagatgtgtt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagctccacg ttcaaggact 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcatttcct ccatctctcg g 21

Claims (10)

1.玉米IPE1突变体，其特征在于，以玉米的野生型IPE1的氨基酸序列为参考序列，所述玉米IPE1突变体含有第555位丝氨酸突变为酪氨酸的突变位点。

2.根据权利要求1所述的玉米IPE1突变体，其特征在于，其具有如下任意一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述的玉米IPE1突变体的基因；

优选地，所述编码玉米IPE1突变体的基因的CDS具有如下任意一种的核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

4.含有权利要求3所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。

5.权利要求3所述基因或权利要求4所述生物材料的如下任意一种应用：

(1)在调控植物花药或花粉粒形成中的应用；

(2)在调控植物雄性育性中的应用；

(3)在制备转基因植物中的应用；

(4)在植物种质资源改良中的应用。

6.用于检测权利要求3所述的玉米IPE1突变体的基因的分子标记，其特征在于，含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第1837位碱基由C突变为A的突变位点。

7.权利要求6所述的分子标记的检测引物，其特征在于，具有如下核苷酸序列：

SEQ ID NO.10：正向引物2805_F：

CAGCTCCACGTTCAAGGACT；

SEQ ID NO.11：反向引物2805_R：

ATCATTTCCTCCATCTCTCGG。

8.含有权利要求7所述的检测引物的试剂盒。

9.权利要求6所述的分子标记或权利要求7所述的检测引物或权利要求8所述的试剂盒在检测玉米IPE1突变体或玉米雄性核不育性状中的应用。

10.权利要求3所述的玉米IPE1突变体的基因或玉米雄性核不育性状的检测方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求7所述的检测引物或权利要求8所述的试剂盒扩增待检玉米的IPE1基因片段，并分析扩增产物的序列特征的步骤；

优选地，所述分析扩增产物的序列特征为采用Hinf I酶切扩增产物，通过电泳检测酶切产物的条带类型，判断IPE1的基因型；

所述判断IPE1的基因型的方法如下：当酶切产物大小为91bp时，待检玉米的IPE1基因型为野生型，待检玉米表现为雄性可育；当酶切产物大小为107bp时，待检玉米的IPE1基因型为突变体，待检玉米表现为雄性不育；当酶切产物大小分别为91bp和107bp时，待检玉米的IPE1基因型为野生型和突变体的杂合基因型，待检玉米表现为雄性可育。