CN104894144B - 一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻CYP704B2基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变引起水稻CYP704B2基因1267个碱基之后的2个G碱基缺失，将该CYP704B2基因突变体命名为cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实该突变体引起水稻隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。

Description

一种水稻CYP704B2基因突变体及其分子鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2及其分子鉴定方法和应用。

背景技术

植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等(Aarts等，1997，TheArabidopsisMALESTERILITY2proteinsharessimilaritywithreductasesinelongation/condensationcomplexes，PlantJournal，12:615-623；Albertsen，2006，Maletissue-preferredregulatorysequencesofMS45geneandmethodofusingsame，专利号：US7154024B2；Hong等，2012，Somaticandreproductivecelldevelopmentinriceantherisregulatedbyaputativeglutaredoxin，PlantCell，24:577-588)；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecarpollen和geminipollen(Oh等，2010，TheSIDECARPOLLENgeneencodesamicrospore-specificLOB/AS2domainproteinrequiredforthecorrecttimingandorientationofasymmetriccelldivision，PlantJournal，64:839-50；Park等，1998，TheArabidopsisthalianagametophyticmutationgeminipollen1disruptsmicrosporepolarity,divisionasymmetryandpollencellfate，Development，125:3789-99)；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因MS44(CiganandAlbertsen，1998，Reversiblenucleargeneticsystemformalesterilityintransgenicplants，US5750868)；2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能(ChenandLiu，2014，Malesterilityandfertilityrestorationincrops，AnnuRevPlantBiol，65:5.1-5.28)。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因(Komori等，2004，Map-basedcloningofafertilityrestorergene,Rf-1,inrice(OryzasativaL.)，PlantJournal，37:315-325；Itabashi等，2011，Thefertilityrestorergene,Rf2,forLeadRice-typecytoplasmicmalesterilityofriceencodesamitochondrialglycine-richprotein，PlantJournal，65:359-367；Tang等，2014，ThericerestorerRf4forwild-abortivecytoplasmicmalesterilityencodesaPPRproteinthatfunctionsinreductionofWA352transcripts，MolecularPlant，7:1497-500；Hu等，2012，ThericepentatricopeptiderepeatproteinRF5restorersfertilityinHong-LianCytoplasmicmale-sterilelinesviaacomplexwiththeglycine-richproteinGRP162，PlantCell，24:109-22)。

水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的55％左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30％。目前我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻(三系杂交稻)就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系(简称不育系，代号A)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系(简称保持系，代号B)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系(简称恢复系，代号R)携带恢复基因，能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种(即杂交稻)正常可育。三系育种法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95％的水稻资源不能用于杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率，导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研究课题。

利用人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了多种新的不育突变体。cyp704B2突变体是其中之一。这种突变体的花药不产生成熟花粉粒。这个不育基因已克隆，为CYP704B2基因，属于P450家族，编码区有4个外显子，编码一个544个氨基酸的蛋白(Li等，2010，CytochromeP450familymemberCYP704B2catalyzestheω-hydroxylationoffattyacidsandisrequiredforanthercutinbiosynthesisandpollenexineformationinrice，PlantCell，vol.22:173-190)。CYP704B2基因在减数分裂形成小孢子前后，在绒粘层和小孢子特异性表达。CYP704B2蛋白参与脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢产物是角质和孢粉素前体。CYP704B2的缺失突变，使孢粉素合成转运受阻，无法正常形成小孢子外壁，小孢子进一步发育受阻，导致完全雄性不育；此外还造成突变体花药表面角质缺失。cyp704B2突变体来源于粳稻品种9522的钴60辐射诱变突变体，是由一段3102bp片断缺失引起的突变。该缺失片段包括CYP704B2基因的前部1732bp，1112bp编码区上游的基因间序列，以及上游基因编码区3’-端的258bp序列。由于这一突变删除了上游基因的部分序列，因此该突变体可能存在潜在的非目标性状变异，可能为其利用带来不利影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2及其分子鉴定方法和应用。

本发明首先对籼稻品种93-11种子(M₀代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M₁代植株；M₁代植株自交产生种子(为M₂代)，种植M₂代植株，对M₂代植株进行形态学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研究。

本发明提供的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2，其为水稻CYP704B2基因第1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子。

进一步地，水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明提供了含有本发明所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载体。

本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中的应用。

本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。

本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制种中的应用。

本发明还提供了检测水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物2245_F：AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示)

下游引物2245_R：TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO.3所示)。

本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。

本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。

一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物2245_F：AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示)

下游引物2245_R：TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO.3所示)；

如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着该待检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。

本发明提供的突变体优点如下：

1)该突变体来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利。

2)文献“Li等，2010，CytochromeP450familymemberCYP704B2catalyzestheω-hydroxylationoffattyacidsandisrequiredforanthercutinbiosynthesisandpollenexineformationinrice，PlantCell，vol.22:173-190”中的突变体为大片段缺失，不仅CYP704B2基因缺失，而且上游基因3’-端的258个碱基对也被删除，因此带有潜在的附加效应。而本发明的突变发生在一个CYP704B2基因的第4个外显子中2个碱基的缺失，使这一基因发生移码突变，转录提前终止，导致CYP704B2蛋白的C端220个氨基酸缺失，不存在这一潜在的附加效应问题。

3)因辐射诱变造成突变位点比野生型少2个碱基对，采用实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳就能开展分子检测，不需要特别的检测技术和方法。

附图说明

图1是实施例2中2245突变体和野生型的株型与穗型照片。

图2是实施例3中2245突变体的显微镜照片。

图3是实施例6中2245突变体CYP704B2基因的突变位点及蛋白质翻译终止位点示意图。

图4-a和图4-b组成实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因DNA序列的比对图。

图5是实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因蛋白质序列的比对图。

图6是实施例7中野生型93-11、2245突变体CYP704B2基因扩增片段的电泳照片。

图7是实施例8中2245×93-11组合F₂群体中可育株和不育株CYP704B2基因突变位点的PCR产物的电泳照片。

图8是实施例9的杂交转育的技术路线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：钴60辐射诱变突变体库

选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利。

2013年夏，于长沙钴60(⁶⁰Co)辐射93-11种子(M₀代)10公斤，7月种植于海南临高田间，分单株收获M₁代种子，共收获约6500份种子。

选取M₁代种子3200个株系，每个株系种植50棵单株。2014年春季，种植于海南临高田间。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。每个株系收6个单株，作为突变体库资源保存。

实施例2：M₂代种植与性状观察

在M₂代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为2245的家系中发现1株育性异常的植株，该突变体在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，图1为该突变体植株与野生型植株的株型(图1左侧)和穗型(图1右侧)对比照片，但花药比野生型小，颜色浅黄，结实率很低，被选作候选突变体材料进行下一步研究。

实施例3：花粉镜检，自交，异交

通过数碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察2245突变体小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，花药比野生型小，颜色较浅。田间采集开花期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)中轻轻挤压花药，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照(图2)。野生型花粉多而染成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒。

同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而2245突变体不结实。用93-11和中花11为突变体授粉，均可正常结实，得到F₁代种子。表明该突变体为雄性不育突变体，雌性不受影响。

对F₁代自交得到F₂代种子，种植F₂代植株144株，将花药碘染后在显微镜下观察，其中110株花粉正常碘染，且正常自交结实，34株无花粉，且自然结实率低，符合3:1分离，表明该不育性状由单个隐性基因控制。

实施例4：叶片采样与DNA提取

本项研究采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1g叶片，放入离心管，加入600μLCTAB提取缓冲液，5μLRNaseA，震荡分散，65℃水浴0.5hr，其间轻摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚(1:1，v/v)，混匀，轻摇10min；4℃10000rpm离心20min；转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH值5.2)、0.6-1倍体积的冷异丙醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4℃10000rpm离心10min；弃去上清，用体积百分含量70％乙醇洗沉淀2次；风干，加入50μL1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。

实施例5：PCR反应与产物回收

用候选基因OsCYP704B2基因的引物扩增93-11野生型和突变体DNA。

用于扩增OsCYP704B2基因的引物对序列见下表1：

表1用于扩增OsCYP704B2的引物对序列

引物对名称	正向引物	反向引物
			OsCYP704B2_1	CAAAGATTGTCTCAAGGTTGGTAG	GGTATTAGGCAAGGAATTCAGTTG
OsCYP704B2_2	TCGAAGGACAGGACGGTGAC	TTTGAGCAAGAGAGGAAGGATC
			OsCYP704B2_3	GCAAGAACTAACCAAAATTCAGG	GGTCAGACGGAGGTGGAGA

PCR反应体系为：1μL10×反应缓冲液，0.25μLdNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5UTaq酶，1μL10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：94-98℃变性1-3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，30-40个循环。循环结束后72℃补充延伸3-10min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

实施例6：DNA序列分析

将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接；2245突变体CYP704B2基因全长核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，由1928个碱基组成，将水稻CYP704B2基因的该突变体基因命名为cyp704B2-2。对野生型和突变体序列进行比对发现，在CYP704B2基因的基因组序列第1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子，蛋白序列分析比对显示，该突变引起了移码突变，造成提前终止(参见图4-a和图4-b这两张图共同组成野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因DNA序列的比对图，反色显示位置为cyp704B2-2基因的突变位点)，导致野生型中C端220个氨基酸在2245突变体中替换为一个丙氨酸(参见图5，反色显示位置为cyp704B2-2翻译的氨基酸序列中与野生型不同的氨基酸，短横线表示缺失的氨基酸)。

实施例7：突变位点分子标记设计与基因型鉴定

根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：正向引物2245_F，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；反向引物2245_R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

在实施例5中所述PCR反应条件下，用上述引物对对93-11和2245突变体进行扩增。

扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如下：(1)聚丙烯酰胺胶的配制：12％PA胶80mL，10％过硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2％的RepelSilane后，再用酒精擦净、干燥，将另一块平板涂上0.5％的BingdingSilane1.5mL(在1.5ml离心管中加入7.5μLBindingSilane和7.5μL冰醋酸，补足95％乙醇至1.5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。(2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽(阴极)装入1×TBE的电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入0.5×TBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。(3)电泳：扩增产物中加入5μl5×LoadingBuffer混合后95℃变性5分钟，立刻转移到冰上冷却，吸取1.5-3μl加入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。(4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2次，每次5min；将冲洗后的胶板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸银、3mL37％甲醛)中65r/min摇动30min；将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶板快速转移到4℃预冷的显影液(2L水中加入30g氢氧化钠，10ml37％甲醛)轻轻摇动至带纹出现；将胶板置于10％的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次2min；室温下自然干燥后，拍照保存图像。

结果见图6，2245突变体的扩增产物比野生型93-11略短，与测序结果一致。

实施例8：基因型-突变表型共分离验证

在2245×93-11的F₂群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株各18株提取叶片DNA，方法同实施例4。用实施例7中所述引物2245_F和2245_R进行扩增这些DNA，并如实施例7中所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

电泳结果见图7，表型为野生型植株扩增产物的电泳带型全部为野生型93-11或杂合型带型，突变体扩增产物的电泳带型全部与2245(cyp704B2-2)的带型相同。这一结果表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断2245突变体的雄性不育表型是由实施例6中所述的突变造成的。

实施例9：突变基因的杂交转育

可按图8的步骤将2245的不育基因cyp704B2-2通过杂交转育到其它水稻遗传背景中：

①杂交：

以2245为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得F₁种子；

②第一轮回交：

F₁播种后获得F₁植株，将F₁植株与轮回亲本进行杂交，获得BC₁种子；

③BC₁不育基因选择(前景选择)：

播种BC₁种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对(2245_F和2245_R)进行扩增和电泳，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；

④BC₁背景选择：

采用一组(例如100个，或200个等)在2245和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；

⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC₂种子；

⑥BC₂的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC₂代植株；

⑦自交获得BC₂F₂种子：对步骤⑥中选出的BC₂植株进行自交，获得BC₂F₂种子；

⑧BC₂F₂的前景选择：将步骤⑦中获得的BC₂F₂种子播种，获得500株以上幼苗，在幼苗期采集采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对(2245_F和2245_R)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；

⑨BC₂F₂的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的2245_F/2245_R引物对扩增带型为纯合突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株用于杂交育种或制种。

Claims (10)

1.一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2，其为水稻CYP704B2基因第1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子。

2.如权利要求1所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

3.含有权利要求1或2所述CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。

7.权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制种中的应用。

8.检测权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物2245_F：AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示)

下游引物2245_R：TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO.3所示)。

9.权利要求8所述的分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。

10.权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法，其特征在于，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物2245_F：AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示)

下游引物2245_R：TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO.3所示)；

如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着该待检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。