CN109554373B - 一种水稻fon2基因突变体及其分子鉴定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水稻FON2基因突变体及其分子鉴定方法和应用，属于基因工程技术领域。水稻FON2基因突变体是将籼稻品种93‑11经钴60辐射诱变后造成FON2基因编码区第三外显子上第443位至第447位碱基的CGCGGC被一个T碱基替换而获得，其突变后的FON2也被命名为fon2‑1907，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该突变引起水稻花器官同源转化和数目增加，可用作转基因水稻的表型筛选标记。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在转育新种质中的应用。

Description

一种水稻FON2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种水稻FON2基因突变体fon2-1907及其应用。
背景技术
花是区别被子植物与其他陆生植物的特征器官，具有复杂的结构和多变的类型。双子叶植物的花由呈同心圆排列的四轮花器官组成，从外向内依次为萼片、花瓣、雄蕊和心皮(雌蕊)。不同双子叶植物每轮花器官的数目和类型有所差异，例如拟南芥有4片萼片、4片花瓣，6枚雄蕊和1枚雌蕊。单子叶植物的花器官结构也呈轮状排列，但与双子叶植物的器官形态不完全相同。以水稻小花为例，在萼片轮生长的是1枚外稃和1枚內稃，在花瓣轮生长的是2枚浆片，再向内分别生长着6枚雄蕊和1枚雌蕊。水稻小花是一朵完全花，在小花外侧着生着一对护颖，是两朵不完全花。在护颖的外侧还着生一对退化的颖片，叫副护颖。副护颖、护颖和小花组成了水稻的一个小穗。
花是由茎顶端分生组织分化发育而来。被子植物从营养生长转入生殖生长后，茎顶端分生组织会先后分化出花序分生组织、枝梗分生组织、小穗或花分生组织、各轮花器官分生组织。花器官分生组织最后发育成成熟的花器官，组成花。因此顶端分生组织的正常发育对花的形成至关重要。
在被子植物中存在着多条调控顶端分生组织生长的分子途径，其中研究较为透彻的一条是拟南芥的WUS-CLV途径。该途径通过促进或限制茎顶端分生组织细胞的增加，使茎顶端分生组织的大小维持在一个稳定的状态中。WUS编码一个由291个氨基酸组成的同源异型结构域蛋白，WUS蛋白的存在能够促使分生组织细胞保持未分化的状态，并维持茎顶端分生组织的结构和功能的完整性，它的突变会导致茎顶端分生组织的缺失。WUS在分生组织细胞组织中心的细胞中表达，其蛋白从分生组织细胞组织中心转移到中心区的细胞中并诱导CLV3基因的表达。CLV基因(CLV1、CLV2、CLV3)能够限制中心区细胞的分裂速度，并能够促进进入侧翼分生区的细胞从未分化的状态转换成分化状态。CLV3编码一个小分子配体蛋白，作为一个信号分子，从中心区细胞中分泌出来，结合到CLV1、CLV2蛋白复合体中，并激活复合体的的功能，CLV1、CLV2、CLV3共同抑制WUS的表达(Brand et al.,2000)。WUS-CLV形成一个正-负反馈回路维持分生组织的大小。WUS-CLV途径在拟南芥、水稻、玉米、番茄中具有保守性。在水稻中，FLORAL ORGAN NUMBER1(FON1)和FON4(也叫FON2)与拟南芥的CLV1、CLV3分别同源。fon1和fon4的突变体都增大了花分生组织，以及增加了花器官数目，尤其是雄蕊和雌蕊数目(Suzaki et al.,2004，2006；Chu et al.,2006)。水稻中现在已经克隆了fon1、fon2(fon4)、fon3、fon6、eg1、ddf1等基因。
目前已克隆的FON2(FON4)基因突变体有三个，其中fon4-1是通过辐射诱变获得，带有一段包括FON2在内的约200kb的缺失。fon4-2和fon4-3是自然变异突变体，前者带有一个单碱基的替换，后者带有一段包括FON2在内的约20kb的缺失。前述三个FON2突变体都引起花器官数目增多，内部的柱头和雄蕊增加了2.0-2.9倍。此外，大片段缺失还造成了fon4-1的叶色突变(Chu,et al,The FLORAL ORGAN NUMBER4Gene Encoding a PutativeOrtholog of Arabidopsis CLAVATA3Regulates Apical Meristem Size in Rice.PlantPhysiology.2006,142:1039–1052)。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻FON2基因突变体fon2-1907及其分子鉴定方法和应用。
本发明首先对籼稻品种93-11种子进行钴60辐射诱变处理，种植处理过的种子获M1代植株。M1代植株自交产生M2代。种植M2代植株，对M2代植株进行形态学，组织化学和遗传学鉴定，筛选花器官异常植株，然后通过图位克隆和DNA测序得到相应突变基因。
本发明提供的水稻FON2基因突变体fon2-1907，其为水稻FON2基因第443位到第447位碱基的CGCGGC被一个T碱基替换，该突变位点位于第三外显子上，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
本发明提供了含有FON2基因突变体fon2-1907的水稻材料。
本发明提供了含有本发明所述水稻FON2基因突变体fon2-1907编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体，含有上述表达载体的宿主细胞和菌株。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或含有该突变体编码基因的生物材料在水稻花器官同源转化和数目增加中的应用。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或含有该突变体编码基因的生物材料在作为转基因水稻的表型筛选标记中的应用。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或含有该突变体编码基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或含有该突变体编码基因的生物材料在制备隐性异常花穗的转基因水稻中的应用。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或含有该突变体编码基因的生物材料在水稻改良育种、制种中的应用。
本发明提供了检测水稻FON2基因突变体fon2-1907的分子标记，可以检测FON2基因第443位到第447位碱基的CGCGGC被一个T碱基替换的突变。优选的，该分子标记可以通过如下引物对通过PCR扩增获得：
上游引物1907_F：ACCTCTGTTTACCGGATCGAG(如SEQ ID NO.2所示)
下游引物1907_R：TCGACGACCAAGAAGACCAC(如SEQ ID NO.3所示)。
本发明提供了用于检测上述分子标记的引物的试剂盒，优选地，所述检测引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了所述分子标记或所述的检测引物或所述的试剂盒在检测fon2-1907或水稻异常花穗性状中的应用。
本发明提供了水稻FON2基因突变体fon2-1907或水稻异常花穗性状的分子鉴定方法，所述方法包括采用本发明所述的检测引物或含有该检测引物的试剂盒扩增FON2基因片段，并分析扩增产物的长度：如果扩增出的产物为166bp，则标志着该待检植物FON2基因型为野生型，花穗性状正常；如果扩增产物为161bp，则标志着该待检植物FON2基因型为fon2-1907突变体，花器官发生同源转化且数目增加；如果扩增产物为166bp和161bp两种带型，则标志着该待检植物FON2基因型为杂合基因型，花穗性状正常。
本发明还提供了检测水稻FON2基因突变体fon2-1907的特异性引物对，该特异性引物对的核苷酸序列为：
上游引物1907_F：ACCTCTGTTTACCGGATCGAG(如SEQ ID NO.2所示)
下游引物1907_R：TCGACGACCAAGAAGACCAC(如SEQ ID NO.3所示)
本发明的有益效果在于，本发明提供的水稻FON2基因突变体是将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变后造成FON2基因编码区第三外显子上第443位至第447位碱基的CGCGGC被一个T碱基替换而获得，该突变引起水稻花器官同源转化和数目增加，可用作转基因水稻的表型筛选标记。本发明提供了该突变体的分子标记鉴定方法在转育新种质中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中野生型植株和fon2-1907突变体的株型(A)与穗型比较(B)。
图2是实施例1中野生型外颖(A)、雄蕊及雌蕊(D)和fon2-1907突变体的颖壳(B、C)及雄蕊(E)、雌蕊(F)图片。
图3是实施例1中fon2-1907突变体FON2基因的突变位点示意图。
图4是实施例1中野生型93-11与fon2-1907突变体的FON2基因蛋白质序列的比对图。差异氨基酸残基序列用高亮显示。
图5是实施例2中fon2-1907与93-11组合F2群体中异常花穗株和正常花穗株FON2基因突变位点的PCR产物的电泳照片。
图6是实施例3的杂交转育的技术路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1水稻FON2基因突变体fon2-1907的获得与鉴定
1、钴60辐射诱变突变体库
选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利。
2013年夏，于长沙用钴60辐射93-11种子10公斤，7月种植于海南临高田间获得M1代。分单株收获M1代的种子，共收获约6500份种子。2014年春季，选取3200份M1代的种子在海南临高试验田种成M2代株系，每个株系种植50棵单株。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存。每个株系另收6个单株，作为突变体库资源保存。
2、M2代种植与性状观察
在M2代抽穗、开花期间，在田间对稻穗及小花的形态进行观察，选取颖壳、雄蕊、雌蕊、花柱、穗型等表型异常的植株再进行进一步镜检。在编号为1907的家系中发现1株花器官异常的植株(见图1、2)，该突变体株型(图1的A)和穗型(图1的B)与野生型没有明显区别，但颖壳数目(图2的B和图2的C)、雄蕊数目(图2的E)、雌蕊数目(图2的F)比野生型(图2的A、D)多，被选作候选突变体材料进行下一步研究。
3、小花表型及遗传分析
在体式显微镜下观察1907突变体小花形态(见图2)，发现雌蕊(图2的F)比野生型(图2的D)多两到三枚，部分小穗浆片同源转化成外颖(图2的B和C)，雄蕊数目6-10枚不等(图2的E)。田间采集开花期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I2，w/w)中轻轻挤压花药，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照。野生型与突变体花粉均能染成蓝黑色，说明雄性育性不受影响。
同一家系野生型植株与突变体1907植株套袋自交后均正常结实，但1907突变体每穗小花结子1-2粒。用93-11和中花11为突变体授粉，均可正常结实，得到F1代种子。表明该突变体雌性育性不受影响。
对F1代自交得到F2代种子，种植F2代植株781株，观察花器官异常情况，其中595株花发育正常，186株花器官异常，符合3:1分离，表明该异常花穗性状由单个隐性基因控制。
4、叶片采样与DNA提取
采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/LEDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH2O溶解DNA。
5、PCR反应与产物回收
根据FON2基因的基因组序列设计引物扩增野生型93-11和fon2-1907突变体DNA。
用于扩增FON2的引物对序列见下表1：
表1用于扩增FON2的引物对序列
Figure BDA0001904703340000071
PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL 10mM dNTP，0.25μL 10μM正向引物和0.25μL 10μM反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：94℃变性5min，然后执行以下循环：95℃变性20s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环。循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用市售DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
6、DNA和氨基酸序列分析
用ABI3730测序仪对回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接；1907突变体FON2基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由638个碱基组成，将水稻FON2基因的该突变体基因命名为fon2-1907。对野生型和突变体序列进行比对发现，在FON2基因的基因组序列第443位碱基到第447位碱基的CGCGGC碱基被一个T碱基替换，该突变位点位于第三外显子上(参见图3)。蛋白序列分析比对显示，该突变引起移码突变，造成第56位氨基酸后的所有氨基酸改变，并使氨基酸序列延长19个氨基酸。导致野生型中CLE功能域发生改变(参见图4，fon2-1907与野生型FON2蛋白的氨基酸序列差异用高亮显示)。
实施例2突变位点检测引物设计与基因型-表型共分离验证
根据实施例1中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：
上游引物1907_F：ACCTCTGTTTACCGGATCGAG(如SEQ ID NO.2所示)
下游引物1907_R：TCGACGACCAAGAAGACCAC(如SEQ ID NO.3所示)。
如果用上述引物对扩增出的产物为166bp，则标志着该待检植物FON2基因型为野生型；如果扩增产物为161bp，则标志着该待检植物FON2基因型为fon2-1907突变体；如果扩增产物为166bp和161bp两条带型，则标志着该待检植物FON2基因型为杂合基因型。
在1907×93-11的F2群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株各15株提取叶片DNA，方法同实施例1。用1907_F和1907_R扩增上述F2单株DNA，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如下：(1)聚丙烯酰胺胶的配制：6％PA胶80mL，10％过硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2％的RepelSilane后，再用酒精擦净、干燥，将另一块平板涂上0.5％的Bingding Silane 1.5mL(在1.5ml离心管中加入7.5μL Binding Silane和7.5μL冰醋酸，补足95％乙醇至1.5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。(2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽(阴极)装入1×TBE的电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入0.5×TBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。(3)电泳：扩增产物中加入5μl 5×Loading Buffer混合后95℃变性5分钟，立刻转移到冰上冷却，吸取1.5-3μl加入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。(4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2次，每次5min；将冲洗后的胶板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸银、3mL 37％甲醛)中65r/min摇动30min；将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶板快速转移到4℃预冷的显影液(2L水中加入30g氢氧化钠，10ml 37％甲醛)轻轻摇动至带纹出现；将胶板置于10％的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次2min；室温下自然干燥后，拍照保存图像。
电泳结果见图5，表型为正常花穗的野生型植株扩增产物的电泳带型全部为166bp，或166bp和161bp两条带，表型为异常花穗的突变体fon2-1907扩增产物的电泳条带全部161bp。这一结果表明实施例1中所述的突变位点(在FON2基因的基因组序列第443位碱基到第447位碱基的CGCGGC碱基被一个T碱基替换，该突变位点位于第三外显子上)与隐性异常花穗基因是共分离的。这一结果结合该突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断fon2-1907突变体的异常花穗表型是由实施例1中所述的突变造成的。
实施例3突变基因的杂交转育
可按图6的步骤将fon2-1907突变体的异常花穗基因FON2通过杂交转育到其它水稻遗传背景中：
①杂交：
以fon2-1907为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得F1种子；
②第一轮回交：
F1播种后获得F1植株，将F1植株与轮回亲本进行杂交，获得BC1种子；
②BC1异常花穗基因选择(前景选择)：
播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例1中所述方法提取DNA，以实施例2中所列的引物对(1907_F和1907_R)进行扩增和电泳，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；
③BC1背景选择：
采用一组(例如100个，或200个等)在fon2-1907突变体和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；
⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC2种子；
⑥BC2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC2代植株；
⑦自交获得BC2F2种子：对步骤⑥中选出的BC2植株进行自交，获得BC2F2种子；
⑧BC2F2的前景选择：将步骤⑦中获得的BC2F2种子播种，获得500株以上幼苗，在幼苗期采集叶片，以实施例1中所述方法提取DNA，以实施例2中所列的引物对(1907_F和1907_R)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；
⑨BC2F2的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的1907_F/1907_R引物对扩增带型为纯合突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得花穗异常株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种水稻FON2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
<130> KHP181117643.2
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 638
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggccggc tcttcttgtg tttggtggtt gcatggtgtt gggttgctct gctgcttgtt 60
gctccggtgc atggacgtgt tggtacgtcg taggagcttc agttctgagc ctttcctttt 120
ttctcacttg aatctctttt ctttcttttt tttcttgttt ttcatacatg catttggtta 180
atgcattgct gacattttct ttggactgat cactttcagg cttgcccggt gagtttagtg 240
gtgaccagag gccagtcccg gcgacatctt ttgatctcgt gacagaggta catgttttat 300
tttcacttca atctcaatta tttgcacctc tgtttaccgg atcgagttag attttgtttc 360
attagagaag tagtttgcat gcattgctga cattttgctt gtataacgtg tgcaaactgg 420
ttagccgaag acgaagcagc cgtgtgaagg gcacccgcag gccgtcgtgg tcttcttggt 480
cgtcgacggc gtcgagatcg tcgccgccgc cggggagagg ggcgccctcg gccgccgcgg 540
cggcggagct ccggtcggtg ccggccggcc cggacccgat gcaccaccac ggcagcccga 600
ggcggccgga gcacgcgcgc agcacaggcc ggccatga 638
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctctgttt accggatcga g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgacgacca agaagaccac 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acatctcaaa gacacaacgg ttt 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgcctcatc cagagcaat 19

Claims (5)

1.一种水稻FON2基因突变体fon2-1907，其为水稻FON2基因第443位到第447位碱基的CGCGGC被一个T碱基替换得到，该突变位点位于第三外显子上；
该突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.含有权利要求1所述FON2基因突变体fon2-1907编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、菌株。
3.权利要求1所述的水稻FON2基因突变体fon2-1907或权利要求2所述的生物材料在水稻花器官同源转化和数目增加中的应用。
4.权利要求1所述的水稻FON2基因突变体fon2-1907或权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物或在水稻改良育种、制种或作为转基因水稻的表型筛选标记中的应用。
5.一种权利要求1所述的水稻FON2基因突变体fon2-1907或水稻异常花穗性状的分子鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测引物扩增FON2基因片段，并分析扩增产物的长度：
所述检测引物的核苷酸序列为：
上游引物1907_F：ACCTCTGTTTACCGGATCGAG，
下游引物1907_R：TCGACGACCAAGAAGACCAC；
如果扩增出的产物为166 bp，则标志着该待检植物FON2基因型为野生型，花穗性状正常；如果扩增产物为161 bp，则标志着该待检植物FON2基因型为fon2-1907突变体，花器官发生同源转化且数目增加；如果扩增产物为166 bp和161 bp两种带型，则标志着该待检植物FON2基因型为杂合基因型，花穗性状正常。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002191A (zh) * 2015-07-03 2015-10-28 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
CN106434708A (zh) * 2016-08-24 2017-02-22 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种水稻msp1基因突变体及其分子鉴定方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002191A (zh) * 2015-07-03 2015-10-28 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
CN106434708A (zh) * 2016-08-24 2017-02-22 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种水稻msp1基因突变体及其分子鉴定方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AB245090.1;Suzaki等;《NCBI,GenBank》;20090717;全文 *
CONSERVATION AND DIVERSIFICATION OF MERISTEM MAITENANCE MECHANISM IN ORYZA SATIVA:FUNCTION OF THE FLORAL ORGAN NUMBER2 GENE;TAKUYA等;《PLANT AND CELL PHYSIOLOGY》;20061231;第47卷(第12期);图1以及表1 *
Suzaki等.AB245090.1.《NCBI,GenBank》.2009,全文. *

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