CN109042299A

CN109042299A - 用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记

Info

Publication number: CN109042299A
Application number: CN201810967760.8A
Authority: CN
Inventors: 杨春燕; 杨永庆; 张孟臣; 赵青松; 闫龙; 陈强; 赵鑫; 王凤敏; 邸锐; 冯燕
Original assignee: Institute of Grain and Oil Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Grain and Oil Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN109042299B

Abstract

本发明公开了一种用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记及其用途，该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQ ID NO：1‑2、SEQ ID NO：3‑4、SEQ ID NO：5‑6。利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过本发明的标记引物检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生。

Description

用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于大豆杂交育种的不育基因鉴定方法。

背景技术

大豆育性主要分为三种类型，雌雄均不育、雄性不育雌性可育、质核互作不育。雌雄均不育因不能获得后代在大豆育种中应用意义不大，质核互作不育和雄性不育可在在大豆杂种优势利用中发挥重要的作用。到目前为止，已发现12个雄性不育雌性可育基因，Gm02中含有4个，分别为ms3、ms4、msMOS、msp；Gm03中ms9基因；Gm07中含有ms8基因；Gm09中含有ms7基因；Gm10中含有ms2基因；Gm11中含有ms5基因；Gm13中含有三个不育基因，分别为ms1、ms6、st5。

大豆杂交种可以提高大豆产量，研究表明，大豆产量优势可超双亲平均的42%。大豆是一种自花授粉作物，如果想获得杂交种子，需要进行人工杂交，此方法不仅费时费力，而且不可能获得大量的杂交种子，如果大豆是雄性不育、雌性可育则可省去了人工去雄步骤，使获得大量杂交种子成为可能。

发明人团队开发了一种新的大豆雄性不育（花粉型）基因mst-M，将其用于大豆雄性不育系的构建和杂交种子的育种工作，并进一步开发了上述不育基因的三对标记引物，用于在不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，早期判断材料育性，提前去除可育株，以便获得更多杂交后代。。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供大豆雄性不育基因的标记引物，用于在雄性不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，提前去除可育株，以便获得更多杂交后代。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记，该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQID NO：1-2、SEQ ID NO：3-4、SEQ ID NO：5-6。

上述标记的用途，利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过上述标记引物检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生；所述不育基因为大豆雄性不育基因mst-M。

上述标记的开发方法包含如下步骤：

A、对大豆可育和选定的不育材料样本进行全基因组重测序；

B、在步骤A的基础上，以公共大豆基因组为参考基因组，在SNP富集区进行SNP位点的预测，选取测序深度＞10且测序质量高的位点，将该位点上下游一定长度的序列以wild typeWT和Mutant type MT的形式列出；

C、对于步骤B选取的位点：

C-1、首先预测该位点是否能够引起酶切位点的出现或缺失，如何能够引起变异，即在该位点上下游各150bp左右设计上下游引物形成CAPs标记引物进行利用；

C-2、如果SNP位点不直接引起酶切位点的变异，在设计引物时，对SNP位点相邻的1-2个碱基引入突变，引入突变后仅使WT或MT其中之一产生一种类型的酶切位点，而保证另外一种没有，且引起变异引物的长度控制在25-40bp之间，使得PCR产物长度在150bp-250bp之间。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，所述公共大豆基因组选用Wm82.a2.v1基因组。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，将所选取位点上下游各30或29bp的序列以wild type WT和Mutant type MT的形式列出。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

通过雄性不育系获得大豆杂交种子，与人工授粉相比节省了大量的劳动力，具有明显的优势。雄性不育系的鉴定（及雄性可育系提出）一般需要在大豆生殖成熟之前，否则将导致杂交的失败。本专利的发明人团队开发了一种新的大豆雄性不育（花粉型）基因mst-M，将其用于大豆雄性不育系的构建及杂交种子的育种工作，并进一步开发了上述不育基因的三对标记引物，用于在不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，避免大豆成熟后杂交授粉的失败。

附图说明

图1：不育突变体植株和花粉表型。a, b图分别是可育和不育单株在R7时期表型；c,d图分别是可育和不育植株花粉经由碘化钾染色后在100倍显微镜下的表型；e, f图分别是可育和不育植株花粉在扫描电镜下表型。

图2：不育和可育单株花粉个数与直径。a 图是可育和不育植株的单个花中含有花粉粒的个数；b图表示可育和不育植株花粉的直径。

图3：近等基因系间变异分析.将染色体上SNP和Indel变异数目利用颜色进行表示，颜色越深表示单位长度内变异越多。

图4：不育基因遗传定位和图谱整合.1,2分别是ms1和ms6的遗传图谱(Yang etal. 2014)；3是st5的遗传图谱(Speth et al. 2015)；4是本研究中mst-M的遗传图谱;Integrated-map-F是将已有研究结果根据标记进行整合后的遗传图谱。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。本发明涉及的实验方法均为常规试验方法，包括：碘化钾染色方法；扫描电镜方法，花粉数目统计方法，花粉直径统计方法；遗传分析计算方法；重测序方法描述；Joinmap构建遗传图谱方法；dCAPs标记开发方法，SSR标记方法，dCAPs方法。

实施例1、大豆不育植株表型鉴定。

对田间发现的不育材料，命名为St-M，进行观察发现，结果发现在苗期（V1）至初荚期（R3）不育材料与可育材料表型无显著差异；但在R4时期不育植株荚的发育出现停滞，并且整个植株生育阶段持续维持在R3-R4时期，直至植株死亡（图1，a-b）。

由于St-M在R3时期可以形成荚，表明St-M的雌蕊正常，因此推测不育可能是由于花粉败育引起。为进一步证明此推论，利用碘化钾染色和扫描电镜两种方法对St-M花苞状态的花粉进行观察，结果显示（图1，c-f）St-M的花粉粒不能被正常着色，而对照可育植株则可以被正常染色，结果表明St-M的花粉出现异常；为细致观察异常花粉外观形态，利用扫描电镜进行观察，发现正常花粉在电镜下呈现饱满圆润的状态，而不育的花粉则出现皱缩、干瘪的形态，初步判断St-M的花粉形态异常。

此外，在对St-M的花粉进行观察的时候发现不育植株花粉粒数偏少，单个花粉直径偏大，为进一步量化二则差异，对花粉粒数和直径进行统计。结果显示(图2)，正常可育花的花粉粒数在580个左右，直径在24微米左右，而St-M的单个花苞的花粉粒数仅为150个左右，约为正常花的1/4，直径在40微米左右，为正常花粉粒的2倍左右，结果表明St-M在花粉粒数和直径上均出现了异常。

实施例2、大豆不育性状的遗传分析。

为进一步分析大豆不育突变体St-M的不育类型，利用正反交和回交的方法分析雌蕊，花粉及细胞质对育性的影响。JD12为正常可育品种，利用人工去雄授粉的方式将JD12与突变体St-M进行正反交实验。结果显示，以St-M为母本，JD12为父本，对共计252朵进行独立去雄和授粉试验，最终获得32个果荚，杂交成功率为12.7%；同时以JD12为母本进行杂交试验，共对339朵进行去雄和授粉试验，未获得果荚。结果表明（见下表），St-M雌蕊正常，花粉败育。与花粉观察结果一致。

	S-M（♂）	JD12（♂）	F<sub>1</sub><sup># </sup>(♂）
				St-M（♀）	-	32/252
JD12（♀）	0/339	-	22/243

注：♀表示母本，♂表示父本，F1为St-M♀×JD12♂衍生后代。

进一步，对St-M和JD12及其衍生后代进行遗传分析，结果如下表所示：

	Fertility	Seg	Sterility	Total	Expected Ratio	χ2	P
								St-M（♀）			12	12
F<sub>1</sub>	12			12
								F<sub>2</sub>	316		102	418	3:1	0.05	0.82
F<sub>2:3</sub>	112	204	0	316	1:2:0	0.63	0.73
								JD12（♂）	22			22
BCF<sub>1</sub>(JD12♀×F1♂)	22			22
								BCF<sub>1:2</sub>	13	9		22	1:1	0.41	0.52
BCF<sub>2</sub>-Seg*	378		109	487	3:01	1.64	0.20

注：BCF₁为JD12为母本衍生；BCF₂-Seg为9个育性发生分离的BCF_1:2组成的F2群体。

结果显示，12个F₁全表现为可育，F₂群体可育与不育单株数分别为316和102，经卡方检验符合3（可育）:1（不育）的分离比例，对316个F_2:3家系进行观察发现，其中112个家系表现为全可育，204个家系出现育性分离，经卡方检测符合1（全可育）：2（分离）：0（全不育）的分离比例，结果表明St-M突变体的不育性状有单隐性基因控制，在此将其命名male-sterile mutant (mst-M) 基因。

为进一步判断mst-M 基因的遗传方式是否受细胞质遗传影响，以JD12为母本与获得的F₁进行回交试验，共获得了22个果荚，每个果荚取一粒种子进行后续遗传分析试验。结果显示，22个BCF₁均表现可育，13个BCF_1:2表现为全可育，9个表现为育性分离，经卡方检测符合1（全可育）：1（分离）的分离比例，进一步对由9个发生分离的BCF_1:2构成的BCF₂-Seg群体进行分析，结果显示378棵单株表现为可育，109棵单株表现为不育，经卡方检测符合3（可育）:1（不育）的分离比例，结果表明mst-M基因符合单隐性基因遗传规律，说明细胞质对育性的遗传方式无显著影响。

实施例3、利用高世代近等基因系对mst-M进行初定位分析。

为初步明确mst-M基因在染色体上的位置，根据后代家系育性表现，连续筛选出现育性分离的家系至F_5:6代。根据F_6:7代表型，将所有不育单株DNA和完全可育植株的DNA分别形成两个混池，利用重测序的方法对两个混池间SNP和Indel变异进行分析。结果显示（图3），90%以上纯合的SNP和Indel变异富集在13号染色体20-22M的位置，表明mst-M基因可能位于该物理区间内。

实施例4、用于遗传定位的dCAPs标记的开发。

为明确和验证不育基因mst-M的位置，利用1138个F₂单株和3对SSR标记（见下表），3对dCAPs标记（见下表）和一个形态学花色标记W1对mst-M进行遗传定位分析。其中，3对dCAPs标记的开发也是我们核心的、体现技术创造性的工作之一；其按照如下步骤开展。

A、对大豆可育和选定的不育材料样本进行全基因组重测序；

B、在步骤A的基础上，以公共大豆Wm82.a2.v1基因组为参考基因组，在SNP富集区进行SNP位点的预测，选取测序深度＞10且测序质量高的位点，将该位点上下游各30或29bp的序列以wild type WT和Mutant type MT的形式列出；

C、对于步骤B选取的位点：

按照上述方法开发的3对dCAPs标记如下表所示。

实施例5、遗传定位及等位性分析。

为明确和验证不育基因mst-M的位置，利用1138个F₂单株和3对SSR标记（见下表），3对dCAPs标记（见下表）和一个形态学花色标记W1对mst-M进行遗传定位分析。结果显示（图.4）将mst-M基因定位在形态学标记W1和dCAPs-1之间，遗传距离分别为0.6和1.8厘摩。已知在大豆13号染色体上存在3个不育基因，分别为ms1，ms6和st5，根据已发表结果对13号染色体上不育基因进行整合。从整合后的遗传图谱结果分析，本mst-M与以往结果均不在同一个位置，表明mst-M属于一个新的不育基因。

SSR标记和dCAPs标记（见下表）

实施例6、dCAPs标记在杂交育种中的用途。

利用含有mst-M不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：3-4或SEQ ID NO：5-6所述的标记检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生。

综合以上实施例可见，本发明从不育材料中定位到新基因mst-M，该基因位于Gm13染色体上，此染色体上还有ms1、ms6、st5三个不育基因，该基因与花色基因遗传距离更近，仅为0.6cm。同时，dCAPs标记的开发也是我们核心的、体现技术创造性的工作之一，并且这些dCAPs标记可以用于杂交育种的前期鉴定/剔除工作，具有实际应用价值。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所

<120> 用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Claims

1.用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记，其特征在于：该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：3-4、SEQ ID NO：5-6。

2.权利要求1所述标记的用途，利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；其特征在于：在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过权利要求1所述的标记检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述不育基因为大豆雄性不育基因mst-M。

4.权利要求1所述标记的开发方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：

A、对大豆可育和选定的不育材料样本进行全基因组重测序；

C、对于步骤B选取的位点：

5.根据权利要求4所述的开发方法，其特征在于：步骤B中，所述公共大豆基因组选用Wm82.a2.v1基因组。

6.根据权利要求5所述的开发方法，其特征在于：步骤B中，将所选取位点上下游各30或29bp的序列以wild type WT和Mutant type MT的形式列出。