CN109566399A - 一种s单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜分子育种技术领域，公开了一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法，包括利用分子标记技术鉴别自交系的S单倍型，以及自交不亲和系与自交系的双单倍体群体、自交不亲和系与自交系的F2群体、自交不亲和系与自交系的回交群体及其后代的S单倍型，得到新的甘蓝型油菜自交不亲和系。本发明可以克服油菜育种过程中根据自交不亲和表型选择的缺点，大大地减少育种工作量，促进快速培育甘蓝型油菜自交不亲系。同时，利用多重PCR分子标记检测S单倍型，克服了实验操作过程失误导致对结果的错判，可以准确判断植株S单倍型。
Description
技术领域
本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法；具体设计一种利用人工创造的自交不亲和S单倍型分子检测技术与杂交、回交和小孢子培养技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲和系的方法
背景技术
选育杂交种是提高甘蓝型油菜(又称油菜)的重要途径。自交不亲和性是油菜杂种优势利用途径之一。傅廷栋等在通过甘蓝型油菜与白菜杂交创建了自交不亲和甘蓝型油菜，并提出自交不亲和“三系”(自交不亲和系、保持系、恢复系)杂种选育方法。在研制出一种大量繁殖自交不亲和系的方法(专利号：ZL200810236719.X)的基础上，提出“两系”(自交不亲和系、恢复系)杂种选育方法(专利号：ZL200810236960.2)。与波里马细胞质雄性不育和萝卜细胞质雄性不育相比，自交不亲和三系和两系杂交种选育方法具有育种程序简单、杂交种选育周期短、杂种优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。
不论是自交不亲和三系、还是自交不亲和两系杂种选育方法，自交不亲和系的选育是关键之一。通常，利用杂交育种方法、回交育种方法，或者小孢子培养技术选育新的自交不亲和系。首先将已有的自交不亲和系与自交系杂交得到F1，当利用杂交育种方法时，对F1植株自交或剥蕾自交创建F2群体，再对F2群体的个体进行套袋自交并进行剥蕾自交，种植自交不亲和植株的剥蕾自交种子；当利用回交育种方法时，取F1植株花粉与自交系杂交创建BC1群体，在BC1群体分单株与自交系杂交、并自交得BC2群体和BC1F2群体，选择与自交亲和性有分离的BC1F2群体对应的BC2群体，继续进行回交，直至BCn(n＞4)群体；当利用小孢子培养技术时，取F1植株幼蕾，经胚状体、愈伤组织、再生苗，到大田植株，然后对所有植株进行套袋自交并进行剥蕾自交，成熟期收获自交不亲和植株的剥蕾自交种子。自交不亲和表型鉴别在自交不亲和系的选育中起着首要作用。通常用亲和指数法来进行判别，即在田间通过套袋自交、成熟期调查结籽情况、计算自交亲和指数(Self-compatibility Index，SCI＝籽粒数/花朵数)。亲和指数法不仅费时因而效率低下、受时间限制(必须在油菜开花后进行)，而且结果还易受环境影响。利用候选基因法，发展了与“S-1300”的自交不亲和性连锁的SCAR标记、与“丙409”自交不亲和保持性连锁的SCAR标记，发现甘蓝型油菜普遍存在S单倍型，上述SCAR标记在很多材料上检测不到、应用具有很大的局限。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现有技术缺乏早期鉴别自交不亲和表型的方法，导致筛选目标植株的盲目性，造成开花期套袋自交和剥蕾自交、成熟期考察结籽情况等大量人力和物力的浪费。
现有技术缺乏早期鉴别自交不亲和表型的方法，导致自交不亲和植株不能及时剥蕾自交结籽而丢失。
现有技术缺乏早期鉴别自交不亲和表型的方法，导致自交不亲和植株和亲和植株混合群体中自交不亲和植株少，选择到优良自交不亲和系难度大。
亲和指数法来进行自交不亲和表型鉴别中，在田间通过套袋自交、成熟期调查结籽情况、计算自交亲和指数时，费时，效率低、受时间限制，而且结果还易受环境影响；利用候选基因法，SCAR标记的在很多材料上检测不到、应用具有很大的局限。
解决上述技术问题的难度和意义：
亲和/不亲和表型鉴别困难，导致了难以选育到优良自交不亲和系，而自交不亲和系的好坏在很大程度上决定杂种的优劣。自交不亲和植株的花器官发育正常，只能通过自交、成熟时的角果结籽情况进行判断，不仅费时、而且效率低下，还受时间限制(必须在油菜开花后进行)和环境影响(倒春寒等异常天气也会引起植株不正常结籽)。
花粉管荧光显微观察法(Kho Y O,J.Observing pollen tubes by meansof fluorescence.Euphytica,1968,17:298-302.)，利用油菜等植株孢子体自交不亲和花粉管不萌发、或者萌发但不伸长的细胞学特点，通过观察授粉后花粉管的生长状况作出判断。该方法在开花期就可以鉴别植株亲和性，但是应用于大田育种有困难：一是不能准确判断亲和/不亲和性，有的植株在早花期花粉管不伸长、表现为强自交不亲和，晚花期自交不亲和性消失、自交仍能正常结籽；二是，需要在开花期进行，可检测时间极其短暂，因而没法鉴定大量植株的表型。
本发明利用两对多重PCR标记结合杂交、回交和小孢子培养技术，成功地选育出甘蓝型油菜新自交不亲和系。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法。
本发明是这样实现的，一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法包括：
通过双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测自交不亲和系、自交系及其F1，得到自交系的S单倍型，通过取F1植株幼蕾进行小孢子培养、对F1植株进行自交、F1植株与自交系回交，创建双单倍体(DH，double haploid)群体、F2群体、回交群体，利用双重PCR标记鉴别分离这些群体的植株及其后代植株S位点基因型，得到新的甘蓝型油菜自交不亲和系。
进一步，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法具体步骤包括：
步骤一：自交系S单倍型检测：以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”和自交亲和系为亲本进行杂交，包括正交和反交，得到F1种子，将F1种子播种得到F1植株；利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”、甘蓝型油菜自交系及其F1的S位点单倍型；标记SRK-1300、SRK1-1和SCR7-2检测的分别是自交不亲和系的S单倍型BnS-1300、恢复系的S单倍型BnS-1和保持系的S单倍型BnS-7，若双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300在“S-1300”、自交亲和系和F1的情况判断自交系的S单倍型，若SRK1-1+SRK-1300在F1中只有1个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有2个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS-7BnS-7，反之，SRK1-1+SRK-1300在F1中只有2个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有1个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS-1BnS-1；
步骤二：S位点单倍型分子标记结合小孢子培养技术选育油菜自交不亲和系：取F1植株的幼蕾进行小孢子培养，得到胚状体、并进一步培养成愈伤；利用在F1中有2个标记的双重PCR标记筛选S单倍型BnS-1300的愈伤；将愈伤培养成苗，得到加倍的双单倍体(Doublehaploid，DH)植株；对DH植株套袋自交，检测DH植株的自交结籽情况以验证为自交不亲和，对DH植株进行蕾期剥蕾授粉，得到自交不亲和DH系；
步骤三：S位点单倍型分子标记结合杂交技术选育油菜自交不亲和系：对F1植株套袋自交得到F2种子，分单粒播种F2种子得F2植株；在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定F2植株的S单倍型，保留S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株；在油菜开花期，对F2植株进行套袋自交以检测其自交不亲和性、进行剥蕾授粉以繁殖F3种子；播种F3的种子，选择F3家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到F4的种子；播种单株亲和指数均小于1的F3家系上收获的种子，选择F4家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，选亲和指数均小于1的F4家系为所需要的甘蓝型油菜自交不亲和系；
步骤四：分子标记与回交技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲系：取F1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与F1进行回交，获得BC1分离群体种子；分单粒播种BC1种子，在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定BC1植株的S单倍型，保留具有2个标记的植株，即含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株；取BC1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与BC1植株进行回交，获得BC2分离群体种子；重复上述选育步骤，直至BCn(n＞4)世代，选择含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株，套袋自交或剥蕾自交，得到BCnF2种子；播种BCnF2的种子，利用双重PCR标记选择S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株，对中选植株套袋自交，选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到BCnF3的种子；播种单株亲和指数小于1的BCnF2植株上收获的种子，得到自交不亲和性稳定的甘蓝型油菜自交不亲和系；
进一步，步骤一中，所述引物的序列包括：
SRK1-1
正向引物5'-CTTCTGATCATGTTTTGCCTCTG-3'SEQ ID NO：1，
反向引物5'-CGAGATCTTTGGGACCATATTTC-3'SEQ ID NO：2；
SCR1-1
正向引物5'-TCTGAATCATGAAATCTGCTGT-3'SEQ ID NO：3，
反向引物5'-TTAAAAGGATTCTGCAAAGTTCT-3'SEQ ID NO：4；
SRK-1300
正向引物5'-GTTCGGTTCACTACGTAAAAAC-3'SEQ ID NO：5，
反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3'SEQ ID NO：6；
SCR7-2
正向引物5'-GACTTTGACATCTGTTCAAGGT-3'SEQ ID NO：7，
反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'SEQ ID NO：8；
本发明的另一目的在于提供一种利用所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法选育的S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系。
本发明提供的甘蓝型油菜自交不亲和系、保持系和恢复系C基因组具有共同的S单倍型BnS-6，A基因组的S单倍型分别为BnS-1300、BnS-7和BnS-1，创建了甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术，得到一套用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记组合，包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。SRK1-1+SRK-1300检测BnS-1和BnS-1300，SCR7-2+SRK-1300检测BnS-7和BnS-1300。在此基础上，本发明创建利用S单倍型分子标记辅助选育甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明利用两对多重PCR标记结合杂交、回交和小孢子培养技术，成功地选育出甘蓝型油菜新自交不亲和系。利用分子标记在幼苗或愈伤组织时期淘汰具有非目标S单倍型的个体，减少后期一系列过程，大大地减少育种工作量；利用分子标记在早期筛选具有目标S单倍型的个体，不仅能及时剥蕾自交以繁殖种子，而且增加了选择到优良自交不亲和个体的可能性，促进快速培育甘蓝型油菜自交不亲系。同时，利用多重PCR分子标记检测S单倍型，克服了实验操作过程失误导致对结果的错判，可以准确判断植株S单倍型。
附图说明
图1是本发明实施例提供的分子标记与回交技术、小孢子培养技术和杂交技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲和系的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术亲和指数法来进行自交不亲和表型鉴别中，在田间通过套袋自交、成熟期调查结籽情况、计算自交亲和指数时，费时，效率低、受时间限制，而且结果还易受环境影响；利用候选基因法，SCAR标记的在很多材料上检测不到、应用具有很大的局限。
为解决上述技术问题，下面结合具体方案对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例提供的S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法包括：通过双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测自交不亲和系、自交系及其F1，得到自交系的S单倍型，通过取F1植株幼蕾进行小孢子培养、对F1植株进行自交、F1植株与自交系回交，创建双单倍体(DH，double haploid)群体、F2群体、回交群体，利用双重PCR标记鉴别分离这些群体的植株及其后代植株S位点基因型，得到新的甘蓝型油菜自交不亲和系。
具体地如图1所示，本发明实施例提供的S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法具体步骤包括：
1)自交系S单倍型检测：以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”和自交亲和系为亲本进行杂交，包括正交和反交，得到F1种子，将F1种子播种得到F1植株；利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”、甘蓝型油菜自交系及其F1的S位点单倍型；标记SRK-1300、SRK1-1和SCR7-2检测的分别是自交不亲和系的S单倍型BnS-1300、恢复系的S单倍型BnS-1和保持系的S单倍型BnS-7，若双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300在“S-1300”、自交亲和系和F1的情况判断自交系的S单倍型，若SRK1-1+SRK-1300在F1中只有1个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有2个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS-7BnS-7，反之，SRK1-1+SRK-1300在F1中只有2个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有1个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS-1BnS-1；
2)S位点单倍型分子标记结合小孢子培养技术选育油菜自交不亲和系：取F1植株的幼蕾进行小孢子培养，得到胚状体、并进一步培养成愈伤；利用在F1中有2个标记的双重PCR标记筛选S单倍型BnS-1300的愈伤；将愈伤培养成苗，得到加倍的双单倍体(Doublehaploid，DH)植株；对DH植株套袋自交，检测DH植株的自交结籽情况以验证为自交不亲和，对DH植株进行蕾期剥蕾授粉，得到自交不亲和DH系；
3)S位点单倍型分子标记结合杂交技术选育油菜自交不亲和系：对F1植株套袋自交得到F2种子，分单粒播种F2种子得F2植株；在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定F2植株的S单倍型，保留S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株；在油菜开花期，对F2植株进行套袋自交以检测其自交不亲和性、进行剥蕾授粉以繁殖F3种子；播种F3的种子，选择F3家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到F4的种子；播种单株亲和指数均小于1的F3家系上收获的种子，选择F4家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，选亲和指数均小于1的F4家系为所需要的甘蓝型油菜自交不亲和系；
4)分子标记与回交技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲系：取F1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与F1进行回交，获得BC1分离群体种子；分单粒播种BC1种子，在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定BC1植株的S单倍型，保留具有2个标记的植株，即含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株；取BC1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与BC1植株进行回交，获得BC2分离群体种子；重复上述选育步骤，直至BCn(n＞4)世代，选择含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株，套袋自交或剥蕾自交，得到BCnF2种子；播种BCnF2的种子，利用双重PCR标记选择S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株，对中选植株套袋自交，选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到BCnF3的种子；播种单株亲和指数小于1的BCnF2植株上收获的种子，得到自交不亲和性稳定的甘蓝型油菜自交不亲和系；
在本发明实施例中，步骤1)中，引物的序列包括：
SRK1-1
正向引物5'-CTTCTGATCATGTTTTGCCTCTG-3'SEQ ID NO：1，
反向引物5'-CGAGATCTTTGGGACCATATTTC-3'SEQ ID NO：2；
SCR1-1
正向引物5'-TCTGAATCATGAAATCTGCTGT-3'SEQ ID NO：3，
反向引物5'-TTAAAAGGATTCTGCAAAGTTCT-3'SEQ ID NO：4；
SRK-1300
正向引物5'-GTTCGGTTCACTACGTAAAAAC-3'SEQ ID NO：5，
反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3'SEQ ID NO：6；
SCR7-2
正向引物5'-GACTTTGACATCTGTTCAAGGT-3'SEQ ID NO：7，
反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'SEQ ID NO：8；
在本发明实施例中，甘蓝型油菜自交不亲和系、保持系和恢复系C基因组具有共同的S单倍型BnS-6，A基因组的S单倍型分别为BnS-1300、BnS-7和BnS-1，创建了甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术，得到一套用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记组合，包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。SRK1-1+SRK-1300检测BnS-1和BnS-1300，SCR7-2+SRK-1300检测BnS-7和BnS-1300。在此基础上，本发明创建利用S单倍型分子标记辅助选育甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：
1)、F1种子的获得：
2010年春天，在华中农业大学试验农场以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”为母本，与常规品种“中双11号”杂交，得到杂种一代(F1)种子。“中双11号”是中国农业科学院油料作物研究所用品种(中双9号/2F10)//26102选育而成的油菜品种，2008年12月2日通过国家农作物品种审定委员会审定，审定编号为国审油2008030。
2)、自交系“中双11号”的S单倍型
2010年秋天将“S-1300”、“中双11号”和F1种子各种植3行，株、行距为15cm和30cm。在3叶期，分别取“S-1300”、“中双11号”和F1各5植株的心叶，混合，提取和纯化DNA。DNA具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法。
分别以“S-1300”、“中双11号”和F1的DNA为模板，利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物进行PCR扩增。标记的创建过程见“甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术(专利号：ZL201310366045.6)”，引物信息具体为：标记SRK1-1的正向引物为5'-CTTCTGATCATGTTTTGCCTCTG-3'、反向引物5'-CGAGATCTTTGGGACCATATTTC-3'，标记SCR1-1的正向引物5'-TCTGAATCATGAAATCTGCTGT-3'、反向引物5'-TTAAAAGGATTCTGCAAAGTTCT-3，标记SRK-1300的正向引物5'-GTTCGGTTCACTACGTAAAAAC-3'、反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3'，标记SCR7-2的正向引物5'-GACTTTGACATCTGTTCAAGGT-3'，反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'。PCR扩增的反应体系：1×PCR buffer，1.35mM MgCl2，0.08mM dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(上述四种试剂购自MBI Fermentas,Lithuania公司)，100ng DNA，正、反向引物(请用编号)各0.45μM，ddH2(下标)O补充至终体积20μl。先进行温度梯度试验，确定适宜的退火温度和时间。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，复性温度45s，72℃60s，38个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存。反应是在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0)，电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存，记录扩增结果。
引物组合SRK1-1+SRK-1300在F1中产生2个标记SRK1-1+SRK-1300、引物组合SCR7-2+SRK-1300在F1只有1个标记SRK-1300，由于SRK-1300、SRK1-1和SCR7-2对应的是自交不亲和系的S单倍型BnS-1300、恢复系的S位点单倍型BnS-1和保持系的S单倍型BnS-7，因此说明“中双11号”的S位点单倍型为BnS-1BnS-1。
3)、小孢子再生苗和DH植株的获得：
2011年2月油菜开花前取F1植株大小合适的花蕾，进行小孢子培养。小孢子培养参照(甘蓝型油菜与诸葛菜的杂种小孢子胚发生和小苗的形态，中国油料作物学报，1994，19(1)：63-64)的方法。具体步骤为：
(1)选蕾：在天气晴朗的上午8：00-10：00之间选取主花序或生长状态较好的侧枝花序，然后在实验室选取大小在2.5～3.5mm之间的花蕾备用。
(2)消毒：在超净工作台内将选取的花蕾用75％的酒精消毒1min(一般不要超过1分钟)，然后再用0.1％的升汞消毒8-10min,最后用无菌水清洗3次，每次5min。
(3)抽提花粉：将经过灭菌的花蕾放置于圆底大试管中，加入1-2滴B5液体培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，倒入过滤器过滤，使花粉滤液盛入10ml离心管；用滴管吸取B5液体培养基冲洗过滤器中的小孢子2-3次后，在10ml的离心管中定容至10ml(离心管口用盖子盖紧)将花粉悬浮液离心，800r/min，离心5min；将离心管中的上清液吸去，再加液体B5抽提液定容至10ml，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心(用盖子盖紧离心管)，800r/min，离心5min，吸去上清液。
(4)加倍培养：将沉淀的花粉加入10ml NLN-16液体培养基悬浮，倒入经高温灭菌的三角瓶在32℃条件下热激暗培养48h-72h。
(5)胚诱导培养：
a)将经热激暗培养后没有污染的花粉悬浮液再次用吸管吸至离心管中，800r/min，离心5min，吸去上清。
b)将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿，一般每皿加入悬浮液3ml左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。
c)将分离的小孢子在25℃的条件下进行暗培养，大概10d左右查看是否有肉眼可见的胚形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚，则移至50rpm、25℃恒温摇床上继续进行暗培养。
d)当胚发育至子叶型胚时，移入B5固体培养基，于20℃，16hr光/8hr暗，2000LUX光强条件下培养。
(6)再生苗培养阶段：
a)将暗培养获得的子叶形胚移入B5固体培养基，于20℃，16hr光/8hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。
b)进行再生苗诱导培养的胚15d左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基中的生长状态决定，继代1-2次直至长出再生植株。
c)长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代。
d)为保障再生苗的成活率，在继代培养过程中通过分离其侧枝最终获得三个单株，但有些再生苗长势弱分枝少，得到单株数不足三个。
本实施例共得到148个再生苗。2011年秋季，将这148株再生苗转移到田间，其中29株由于长势弱而死亡。有45株为单倍体，有74株为双单倍体。通过对45单倍体植株生长点和腋芽处涂抹秋水仙碱加倍，加倍效果并不是很理想，最终只有5株加倍成功。因而，共得到双单倍体植株79株。
4)、DH植株S单倍型的检测：
利用分子标记SRK1-1SRK-1300检测79株双单倍体植株的S位点单倍型。具有标记SRK1-1的植株为61株，说明这61株具有与“华双5号”一样的S位点单倍型BnS-1BnS-1；其余的18株具有标记SRK-1300，说明它们具有“S-1300”的S位点单倍型BnS-1300BnS-1300(表1)。S位点单倍型BnS-1300BnS-1300的18株预期为自交不亲和。
5)、DH植株的自交结籽情况：
对79个DH植株进行套袋自交，检测DH植株的自交结籽情况。利用亲和指数法判断植株表型，具体步骤为：当甘蓝型油菜植株的主枝上有3～5朵花开放时，摘除主枝上已开放的花朵和花序中心的小蕾以限制主枝无限生长，然后用硫酸钠纸袋套住主枝和2～3个侧枝，每隔一天把纸袋向上抽提，在抽提的过程中用手轻拍纸袋进行人工辅助授粉。油菜成熟收获后，脱粒、考察套袋自交结实情况，按照下列公式计算亲和指数：亲和指数＝籽粒数/花朵数。具体方法参见Zhang等(Zhang等，Development of SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L,Molecular Breeding,2008，21:305-315)对甘蓝型油菜亲和指数的分类标准，以指数2为标准，凡亲和指数<2的单株定为自交不亲和，亲和指数≥2的单株定为自交亲和。对自交不亲和单株选择两个分枝进行剥蕾自交以繁殖种子，收获种子。
在79份DH植株中，自交亲和的有61份，不亲和的有18份，套袋自交结籽情况与S位点单倍型检测结果完全一致，即S位点单倍型BnS-1BnS-1的DH植株为自交亲和、S位点单倍型BnS-1300BnS-1300的DH植株为自交不亲和，如下表所示：
表1小孢子培养双单倍体植株S单倍型和自交结籽情况
6)、自交不亲和DH系的验证：
表2自交不亲和DH系的亲和指数
对S位点单倍型为BnS-1300BnS-1300的DH植株进行剥蕾授粉，得到自交不亲和DH系；2012年5月，收获DH植株的种子。2012年9月，播种DH植株的种子，每个DH系种植两行，约20株；花期每行套袋自交5-8单株，待成熟后田间进行表型亲和性调查。18份材料的所有调查植株的亲和指数都小于2，说明这18个DH系都是自交不亲和的。表2是8个自交不亲和系亲和指数的调查结果，由调查结果可以看出这8个DH系的亲和指数均小于2，属于自交不亲和，单个植株的调查结果中也没有出现大于2的单株，但是个体间具有一定差异。
种植上述的18个DH系，考察产量及产量相关性状，以及田间抗倒伏抗病害情况，测定种子的硫苷含量、芥酸含量，选育出具有双低(低芥酸低硫苷)品质、抗倒伏抗病害的甘蓝型油菜自交不亲和系17育138-10。
实施例2:
1)、F1种子的获得
2011年春天，在华中农业大学试验农场以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”为母本，与常规品种“浙油50”为父本进行杂交，得到杂种一代(F1)种子。“浙油50”是浙江省农科院作物与核技术利用研究所，用沪油15/浙双6号选育的油菜品种，2011年11月18日经第二届国家农作物品种审定委员会第六次会议审定通过，审定编号为国审油2011013。
2)、自交系“浙油50”的S单倍型
2011年秋天将“S-1300”、“浙油50”和F1种子各种植2行，每行10株，株距为15cm、行距为30cm。在3叶期，分别取“S-1300”、“浙油50”和F1各5植株的心叶，混合，提取和纯化DNA。DNA具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法，标记详细序列、PCR扩增的反应体系和反应条件见“甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术(专利号：ZL201310366045.6)”。
分别以“S-1300”、“浙油50”和F1的DNA为模板，利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物进行PCR扩增。引物组合SRK1-1+SRK-1300在F1中产生1个标记SRK1-1+SRK-1300、引物组合SCR7-2+SRK-1300在F1产生2个标记SRK-1300，说明“浙油50”的S位点单倍型为BnS-7BnS-7。因而，双重PCR标记SCR7-2+SRK-1300用于分离群体植株的S位点单倍型鉴定。
3)、F2分离群体的获得及植株S单倍型的检测
2012年春天，F1植株套袋自交得到F2分离群体种子。2012年秋天，分单粒在穴盘中种植F2种子，得到F2植株。在3叶期，分单株取各植株的心叶，提取DNA、纯化DNA。利用双重PCR标记SCR7-2+SRK-1300检测F2群体各植株的S位点单倍型。在282个F2植株中，148株具有2个标记，70株只有标记SCR7-2，其余64株只有标记SRK-1300。将只有标记SRK-1300的64株移栽大田，成活59株。2013年春天，对这59植株套袋自交和剥蕾自交，统计结籽情况，按亲和指数＝籽粒数/花朵数的公式计算亲和指数；分单株收获F2各植株的种子，分析每一F2单株种子的芥酸和硫苷含量。淘汰亲和指数大于2的单株和(或)不符合双低品质的单株，保留亲和指数小于2、芥酸含量小于1％、硫苷含量小于30umol/g的43植株种子，即F3种子。2013年秋天，种植F3种子，得到43个F3家系，每家系2行，每行约10株。2014年春天，淘汰少数苗期长势弱的F3家系，在保留的F3家系中每家系选择5-8株套袋自交。全部植株自交结籽很少，为自交不亲和；每一家系考察了3株的结籽情况，计算亲和指数，见表3。
表3 S-1300×浙油50F3家系单株的自交亲和指数
4)、新自交不亲和系的获得
2014年秋天，继续播种F3家系植株的种子，得到F4家系，选择田间抗倒伏抗病性和其它性状较好的F4家系进行套袋自交和剥蕾自交，保留亲和指数小于2、芥酸含量小于1％、硫苷含量小于30umol/g的F4家系植株的种子；重复上述过程，在F7家系中，得到了农艺性状整齐、具有双低品质的甘蓝型油菜自交不亲和系17育98-10。
实施例3：
1)、自交系“华双5号”S单倍型的鉴定
2009年春天，在华中农业大学试验农场以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-1300”为母本，与常规品种“华双5号”为父本进行杂交，得到杂种一代(F1)种子。“华双5号”系华中农业大学利用中油821//华油3号/RS-1双低选系×华双3号/3/中双4号复合杂交选育而成的高产双低油菜品种，2004年通过全国农作物品种审定委员会审定，审定编号：国审油2004006。
2009年秋天将“S-1300”、“华双5号”和F1种子各种植2行，每行10株，株距为15cm、行距为30cm。在苗期，分别取“S-1300”、“华双5号”和F1各5植株的心叶，混合，提取和纯化DNA。分别以“S-1300”、“华双5号”和F1的DNA为模板，利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物进行PCR扩增。引物组合SCR7-2+SRK-1300在F1有2个标记，说明“华双5号”的S位点单倍型为BnS-7BnS-7。
2)、S-1300×华双5号BC1群体构建与标记筛选BC1植株
2010年春天，取“华双5号”花粉与F1植株进行回交，获得BC1分离群体种子；2010年秋天，分单粒播种BC1种子，在1-3叶期，利用双重PCR标记SCR7-2+SRK-1300鉴定20株BC1植株的S单倍型。在20株被测植株中，12株只有标记SCR7-2，8株既有标记SCR7-2，又有标记SRK-1300。将有标记SRK-1300的8株移栽大田。
3)、BC2～BC3群体的构建及目标S单倍型单株的筛选
2011年春天，在8株BC1植株中，选择长势较好、外形似“华双5号”的2株，与“华双5号”花粉杂交，获得BC2种子；2011年秋天，将BC2种子播种在穴盘，每孔1粒种子，共24粒；在1-3叶期，利用双重PCR标记SCR7-2+SRK-1300鉴定这24株BC2植株的S单倍型，其中，11株有标SRK-1300，将它们移栽大田。2012年春天，取“华双5号”花粉与BC2植株杂交，获得BC3分离群体种子。
4)、BC3F2群体的构建
2012年秋天，分单粒在穴盘播种BC3种子，共播种30粒；在1-3叶期，利用双重PCR标记SCR7-2+SRK-1300鉴定30株BC1植株的S单倍型，其中16株具有标记SCR7-2，移栽大田。2013年春天，对全部BC3植株进行套袋自交和剥蕾自交，统计结籽情况，计算亲和指数，这16株全部为自交不亲和；收获BC3植株的种子，得到BC3F2种子。
5)、BC3F2群体内具有目标S单倍型单株的筛选
2013年秋天，在大田播种BC3F2种子，10行，定苗至100株；6-8叶期，取植株幼嫩的心叶，分单株抽提DNA，利用双重PCR标记分析100单株的S单倍型，选择S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株，共30株；2014年春天，对中选植株套袋自交和人工剥蕾自交，得到BC3F3的种子。
6)、新自交不亲和系的获得
2014年秋天，在大田播种BC3F2植株的种子，得BC3F3家系，每个家系2行，约20株；2015年春天，对每个家系选择最整齐一致的3-5植株套袋自交和人工剥蕾自交，每家系考察了3株的结籽情况，计算亲和指数(见表4)。全部植株为自交不亲和。同时，家系间很相似，家系内植株形态整齐一致，得到了甘蓝型油菜自交不亲和系17育105-10。
表4S-1300×华双5号BC3F2家系植株的自交结籽情况
本发明实施例中，甘蓝型油菜自交不亲和系17育98-10和自交不亲和系17育138-10图中，自交结籽很少，剥蕾自交正常结籽。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttctgatca tgttttgcct ctg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgagatcttt gggaccatat ttc 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgaatcat gaaatctgct gt 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaaaaggat tctgcaaagt tct 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcggttca ctacgtaaaa ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgaggaata ataggagata cg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gactttgaca tctgttcaag gt 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attagtaaca ttcggtccg 19
Claims (4)
1.一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法，其特征在于，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法包括：
通过双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测自交不亲和系、自交系及其F1，得到自交系的S单倍型；
通过取F1植株幼蕾进行小孢子培养、对F1植株进行自交、F1植株与自交系回交，创建双单倍体群体、F2群体、回交群体；
利用双重PCR标记鉴别分离这些群体的植株及其后代植株S位点基因型，得到新的甘蓝型油菜自交不亲和系。
2.如权利要求1所述的S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法，其特征在于，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法具体步骤包括：
步骤一：自交系S单倍型检测：以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300和自交亲和系为亲本进行杂交，包括正交和/或反交，得到F1种子，将F1种子播种得到F1植株；利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、甘蓝型油菜自交系及其F1的S单倍型；标记SRK-1300、SRK1-1和SCR7-2检测的分别是自交不亲和系的S单倍型BnS-1300、恢复系的S单倍型BnS-1和保持系的S单倍型BnS-7，依据双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300在S-1300、自交亲和系和F1的情况判断自交系的S单倍型，若SRK1-1+SRK-1300在F1中只有1个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有2个标记，则自交系的S单倍型为BnS-7BnS-7；SRK1-1+SRK-1300在F1中只有2个标记或者SCR7-2+SRK-1300在F1中有1个标记，则自交系的S单倍型为BnS-1BnS-1；
步骤二：S单倍型分子标记结合小孢子培养技术选育油菜自交不亲和系：取F1植株的幼蕾进行小孢子培养，得到胚状体、并进一步培养成愈伤；利用在F1中有2个标记的双重PCR标记筛选S单倍型BnS-1300的愈伤；将愈伤培养成苗，得到加倍的双单倍体DH植株；对DH植株套袋自交，检测DH植株的自交结籽情况以验证为自交不亲和，对DH植株进行蕾期剥蕾授粉，得到自交不亲和DH系；
步骤三：S单倍型分子标记结合杂交技术选育油菜自交不亲和系：对F1植株套袋自交得到F2种子，分单粒播种F2种子得F2植株；在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定F2植株的S单倍型，保留S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株；在油菜开花期，对F2植株进行套袋自交以检测其自交不亲和性、进行剥蕾授粉以繁殖F3种子；播种F3的种子，选择F3家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到F4的种子；播种单株亲和指数均小于1的F3家系上收获的种子，选择F4家系，对中选株系所有单株套袋自交，每个株系选择3-5个单株人工剥蕾自交，选亲和指数均小于1的F4家系为甘蓝型油菜自交不亲和系；
步骤四：分子标记与回交技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲系：取F1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与F1进行回交，获得BC1分离群体种子；分单粒播种BC1种子，在1-3叶期，利用在F1中有2个标记的双重PCR标记鉴定BC1植株的S单倍型，保留具有2个标记的植株，即含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株；取BC1植株花粉与自交系进行回交，或者取自交系植株花粉与BC1植株进行回交，获得BC2分离群体种子；重复所述选育步骤，直至BCn(n＞4)世代，选择含有自交不亲和S单倍型BnS-1300的植株，套袋自交或剥蕾自交，得到BCnF2种子；播种BCnF2的种子，利用双重PCR标记选择S单倍型为BnS-1300BnS-1300的植株，对中选植株套袋自交，选择3-5个单株人工剥蕾自交，得到BCnF3的种子；播种单株亲和指数小于1的BCnF2植株上收获的种子，得到自交不亲和性稳定的甘蓝型油菜自交不亲和系。
3.如权利要求2所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法，其特征在于，所述步骤一中引物的序列包括：
SRK1-1
正向引物5'-CTTCTGATCATGTTTTGCCTCTG-3'，
反向引物5'-CGAGATCTTTGGGACCATATTTC-3'；
SCR1-1
正向引物5'-TCTGAATCATGAAATCTGCTGT-3'，
反向引物5'-TTAAAAGGATTCTGCAAAGTTCT-3'；
SRK-1300
正向引物5'-GTTCGGTTCACTACGTAAAAAC-3'，
反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3'；
SCR7-2
正向引物5'-GACTTTGACATCTGTTCAAGGT-3'，
反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'。
4.一种利用权利要求1所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法选育的S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系。
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|---|---|---|---|---|
| CN111705157A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-09-25 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 用于甘蓝自交不亲和系ⅰ类s单元型筛选的pcr标记及引物 |
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2018
- 2018-12-26 CN CN201811602696.XA patent/CN109566399A/zh active Pending
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