CN101522896B - 莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法 - Google Patents

莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101522896B
CN101522896B CN200680039986.7A CN200680039986A CN101522896B CN 101522896 B CN101522896 B CN 101522896B CN 200680039986 A CN200680039986 A CN 200680039986A CN 101522896 B CN101522896 B CN 101522896B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
lactuca
cytoplasm
seed
male sterility
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200680039986.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101522896A (zh
Inventor
堀内慎吾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sakata Seed Corp
Original Assignee
Sakata Seed Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sakata Seed Corp filed Critical Sakata Seed Corp
Publication of CN101522896A publication Critical patent/CN101522896A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101522896B publication Critical patent/CN101522896B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/021—Methods of breeding using interspecific crosses, i.e. interspecies crosses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated

Abstract

本发明的目的是提供可用于生产子一代种子的莴苣属胞质杂种植物和生产其的方法。本发明涉及莴苣属的胞质杂种植物、其后代或其部分，其在其细胞质中包含来自向日葵属植物的线粒体。所述胞质杂种植物优选是细胞质雄性不育的。本发明还涉及产生莴苣属胞质杂种植物的方法。

Description

莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法
技术领域
本发明涉及莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法。
背景技术
植物品种以前就有常规品种和杂交一代(下文中称作F1)之分。主要的农作物已经普遍使用F1品种。F1品种的主要优点包括高生长速率、高产量等等，这是由于杂种优势的高生长活力所致。此外，预期它们在对病害虫的抗性，对环境的适应性，如抗寒性和抗热性也得到提高。此外，F1品种的植物具有相同的基因型，尽管它们是杂合的，并且在它们的表现型显示出非常高的整齐度，增加了产品的市场化能力。此外，F1品种积累显性基因控制的有利性状的概率增加，使得可以快速育种。而且，F1品种还有一个很大的优势是，由于其性状分离的原因，从下一代开始，它们的后代质量的均匀性将下降，所以必须每年繁殖F1种子，进而保护了育种家的权利。
由于前述原因，F1品种已经成为主要作物的主流栽培品种。然而，对于出于商业目的大规模繁殖F1种子，需要不增加成本，容易去雄方法。对于一次杂交可以产生许多种子的植物，包括果菜类的番茄、甜瓜、黄瓜和南瓜，花卉植物的矮牵牛和洋桔梗等，可以通过人工去雄，杂交来经济地繁殖F1种子。然而，仍然有许多作物由于它们花器结构而非常难以有效去雄，或者一次杂交仅仅产生少量种子，很难通过人工杂交来大量繁殖杂交种子，使得F1种子的生产不经济。对于此类作物的种子生产，关键是开发使用雄性不育进行种子生产的方法，因为通过使用雄性不育植物作为种子亲本可以省略艰巨而昂贵的去雄过程，从而利用雄性不育的遗传特征。
已经在许多植物物种中发现了雄性不育。并且在许多有用的作物中已经建立了使用细胞融合技术产生雄性不育植物的方法(专利文件4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19)。雄性不育有多种机理，主要分成两大类：核遗传雄性不育和细胞质雄性不育。核遗传雄性不育由核基因引起。另一方面，细胞质雄性不育涉及细胞质遗 传因子和核基因之间的相互作用。
在世界上每个国家都出产莴苣。它是有很大市场的蔬菜，并且非常希望产生它的F1品种。非专利文件1和2记述了莴苣的杂种优势，并报道通过使用核遗传雄性不育繁殖出来的莴苣F1与常规种的对比调查，F1植物显示出出色的杂种优势。因此，非常需要开发出使用雄性不育来有效繁殖莴苣F1种子的种子生产技术，然而目前为止还没有这种技术。例如，非专利文件3揭示了莴苣中核遗传雄性不育的遗传方式，但是核遗传雄性不育的实际应用仍然存在问题，由于雄性不育的不稳定性，以及雌蕊也常出现缺陷(非专利文件7)。非专利文件3的作者也在非专利文件4和5中报道了相似的结果。事实，尽管使用核遗传雄性不育产生的F1品种已经上市，由于雄性不育不稳定性，至今不能取代传统的常规种(非专利文件6)。
最近，已经发现了新型的核遗传雄性不育的株系。例如，在病害抗性选育的后代中发现的专利文件1和非专利文件1中记述的株系″MS1024″，由于完全不产生花粉，并且采种量也非常高，明显优于非专利文件3等等中记述的核遗传雄性不育品种。
然而，利用核遗传雄性不育植物来商业性地生产F1种子，在生产成本上尚犹问题存在。目前为止发现的莴苣的核遗传雄性不育都是从隐性基因的纯合化中得到的(非专利文件7)。从隐性基因的纯合化中得到的核遗传雄性不育植物自身不能繁殖，所以为了保持和繁殖雄性不育株系，必须将它们与雄性不育基因杂合的个体杂交，并且从后代筛选对该雄性不育基因纯合的个体。因为该杂交将导致可育的植株和不育的植株1∶1的分离，杂种后代中只有约50％是雄性不育植株。因此，为了商业性的F1种子生产，必须以某种方式在制种田里区分出可育株，并将其拔除。对于莴苣，该去除过程特别麻烦，因为它的花器很小，得难区分不育株和可育株，并且它细长的花茎上有很多花。
此外，每个个体的花期是不同的，因此根据花的外观完全除去可育的个体是非常艰巨的，并且在去除过程中的错误可以降低F1种子的纯度，由此也带来种子质量降低的问题。
此外，核遗传雄性不育植物的育种方面、由于具有雄性不育基因的个体除开花时以外在视觉上不宜区分、育种的效率很低、需要很长的年限。为了方便区分可育植物和不育植物，必须开发选择仅仅雄性不育植 物的方法，可通过发现和利用与与种子或生长初期的形态连锁的基因，或者通过开发与雄性不育基因连锁的DNA标记进行选择。还没有为莴苣建立这种技术，尽管其研究仍在进行中。
尽管自从揭示了莴苣中核遗传雄性不育的遗传方式已经经历了很长时间，但是如上所述，使用核遗传雄性不育莴苣开发F1品种中的许多问题仍然没有解决，并且具有高市场能力的F1品种的生产仍然是困难的。
另一方面，使用细胞质雄性不育进行的F1种子生产已经长期以来实际用于向日葵、甜菜、马铃薯、稻、小麦、胡萝卜、洋葱和葱等等，并且已经建立了这些作物的商业生产体系。而且在蔬菜作物如甘蓝、绿花椰菜、萝卜和大白菜中(其中使用自交不亲和性进行F1种子生产已经被广泛应用)，由于对更高质量种子的需求，使用细胞质雄性不育进行F1种子生产已经在最近变得普遍。
通常，一旦产生了具有雄性不育性的细胞质雄性不育植物，就可以通过反复回交将细胞质雄性不育引入许多希望的株系中，并且F1品种的种子亲本的育种变得可能。因为细胞质雄性不育通过细胞质遗传传递，所有子代将都是雄性不育的。通过与具有相同核基因和正常细胞质的保持系杂交，容易地保持和增殖细胞质雄性不育系。因为不需要如上述使用核遗传雄性不育进行种子生产那样从制种田中的种子亲本除去可育个体，所以使用细胞质雄性不育进行种子生产是有效的，并且不存在由于去除过程中的错误导致F1种子纯度降低的问题。
基于这些事实，预期使用细胞质雄性不育植物进行F1种子生产的方法与使用核遗传雄性不育的那些方法相比在经济和商业意义上更有用。
尽管预期这种方法将如上述非常有用，但是还没有开发在莴苣中使用细胞质雄性不育植物生产F1种子的方法。这是因为对于莴苣，没有相同种或属的可杂交植物，其细胞质能够在导入莴苣的细胞质时引起细胞质雄性不育。
另一方面，对于菊科(Asteraceae)向日葵属(Helianthus)的向日葵栽培种(Helianthus annuus L.)，已经从种间杂交发现了许多细胞质雄性不育植物并且F1品种被实际应用。非专利文件9-13和其他文件已经对其进行了报导。作为菊科细胞质雄性不育蔬菜生产的实例，已 知通过向日葵和菊苣的细胞融合可以产生细胞质雄性不育菊苣。这种技术公开于例如专利文件2和3和非专利文件14到17中。
非专利文件14最先报导了产生细胞质雄性不育菊苣，并且揭示通过使用细胞融合技术向菊苣中引入向日葵的细胞质可以产生细胞质雄性不育菊苣。非专利文件14还报导菊苣和向日葵的线粒体基因组重组产生的细胞质雄性不育菊苣中的线粒体基因组。此外，非专利文件16和17报导了前述细胞质雄性不育菊苣后代中细胞质雄性不育的表达和线粒体DNA结构的分析结果。
专利文件2描述了菊科细胞质雄性不育植物和得到这种植物的方法。在专利文件2中表明实际产生的唯一的细胞质雄性不育植物是如非专利文件14中的细胞质雄性不育菊苣。尽管专利文件2涉及细胞质雄性不育莴苣，但是它仅仅以现在时态的句子陈述了培养和融合原生质体，并且没有描述胞质杂种莴苣或细胞质雄性不育莴苣的实际生产的方法或实验结果。在细胞融合技术中，一直到分离和融合原生质体步骤之前，该方法是相对容易的。例如，甚至可以将动物细胞和植物细胞的原生质体分离出来后融合。。然而，培养系统发育上远缘种之间融合细胞以让它们分裂，并进一步再生植物的步骤在技术上非常困难。这是由于融合过程中的胁迫可以抑制融合细胞的细胞分裂，以及异源的核和细胞质之间的遗传不亲和性增加了技术困难。为了克服再生植物的这些困难，必须开发不用伤害它们的细胞膜而培养细胞的方法以及允许具有新的基因组组合的融合细胞分裂和再生成植物的培养方法。因此，培养融合细胞和随后从融合细胞再生植物的技术是细胞融合技术的核心技术。此外，为了表达雄性不育，必须发生系统发育上适度远缘的种之间线粒体基因组的重组或重排。从而，即使可能从远缘种的产生胞质杂种植物，也不能预测是否将可能产生表达雄性不育的植物，并且因此，实际上产生胞质杂种植物并选择显示出雄性不育的个体是必需的。从而，在专利文件2中没有公开产生细胞质雄性不育莴苣的关键技术。因为这些原因，即使在专利文件2之后也没有报导成功地产生细胞质雄性不育莴苣，尽管长期以来需要开发产生细胞质雄性不育莴苣的方法。
专利文件3公开了通过不对称的细胞融合向菊苣属的植物中导入orf522而产生细胞质雄性不育菊苣的方法，orf522被认为是引起向日葵中细胞质雄性不育的基因。
非专利文件15描述了新的研究小组产生了细胞质雄性不育菊苣，该研究小组在近年来已经在该工作的延续中进行研究来产生适于实际使用的细胞质雄性不育菊苣。
如上述，有许多通过细胞融合导入部分向日葵线粒体DNA而产生细胞质雄性不育菊苣的报导。然而，还没有报导细胞质雄性不育莴苣的产生，尽管莴苣和菊苣都属于菊科。使用细胞质雄性不育向日葵产生细胞质雄性不育莴苣的难处可能是由于与菊苣核基因组和向日葵线粒体基因组之间的遗传相容性相比，莴苣核基因组和向日葵线粒体基因组之间的低遗传相容性。
此外，可以考虑通过将莴苣与细胞质雄性不育菊苣杂交来向莴苣中引入细胞质雄性不育，所述细胞质雄性不育菊苣通过向菊苣中导入向日葵细胞质雄性不育基因而产生。然而，莴苣和菊苣之间的有性杂交是困难的，因为它们为不同的属并且关系很远。还没有报导使用这种方法成功地产生细胞质雄性不育莴苣。
如上述，细胞质雄性不育莴苣的产生在技术上非常困难，并且还没有取得成功。然而，使用细胞质雄性不育产生F1品种的莴苣将是非常有益的。因此，非常需要产生细胞质雄性不育莴苣。
专利文件1日本专利公开号2005-110623
专利文件2欧洲专利号0771523
专利文件3国际公布号WO97/45548
专利文件4日本专利公开号62-232324
专利文件5日本专利公开号63-79548
专利文件6日本专利公开号02-303426
专利文件7日本专利公开号63-36776
专利文件8日本专利公开号64-20041
专利文件9日本专利公开号01-218530
专利文件10日本专利公开号10-052185
专利文件11美国专利号5254802
专利文件12日本专利公开号10-108676
专利文件13日本专利公开号10-108677
专利文件14日本专利公开号2001-145497
专利文件15日本专利公开号02-138927
专利文件16日本专利公开号01-206931
专利文件17国际公布号WO99/55143
专利文件18国际公布号WO95/09910
专利文件19国际公布号WO97/09873
专利文件20专利号3635036
非专利文件1 Takada，Katuya and Fujino，Masatake(1987)″Study on F1 seedproduction in Lettuce(1)：Heterosis of F1 plantsusing male sterile lines asseed parents(in Japanese)″1987Spring Conference of Japanese Society forHorticultural Science，Research Abstract 208-209.
非专利文件2 Takada，Katuya and Fujino，Masatake(1986)″Development oftechniques using male sterility in lettuce(1)：Expression of heterosis in F1hybrids(in Japanese)″NationalInstitute of Vegetable and Tea Science，MoriokaResearch Station，Annual Research Report No.1，87-93.
非专利文件3 Edwrd J.Ryder(1967)Arecessive malesterility gene inLettuce(Lactica sativaL.)Pro.Am.Soc.Hortic.Sci.91，366-368.
非专利文件4 Ryder，E，J Proceeding of the American societyforhorticultural Science 1963 Vol.83585-589 An epistaticallycontrolled pollensterile in Lettuce(Lactica sativa L).
非专利文件5 Ryder，E，J Science 1989 vol.114(1)129-133Studies of threenew genes，linkage，and epistasis in Lettuce.
非专利文件6 Variety Registration Application″Fine″(inJapanese)，KanekoSeeds，No.1745.
非专利文件7 Serizawa，Hiroaki，″Recessive male sterilegene in lettuce(in Japanese)″Journal of Japanese Society forHorticultural Science，vol.73，Supl.2，p.566.
非专利文件8 Matsumoto，E.，Plant cell reports 1991.vol.9(10)Interspecific somatic hybridization between lettuce(Lactica sativa)and wildspecies L.virosa
非专利文件9 L.H.Rieseberg，C.Van Fossen，D.Arias，and R.L.Carter，Thejournal of heredity1994：85(3)，233-238Cytoplasmic male sterility in Sunflower：origin，Inheritance，andFrequency in Natural Populations.
非专利文件10 R.Horn Theor Appl Genet(2002)104：562-570Moleculardiversity of male sterility inducing and male-fertilecytoplasms in the genusHelianthus.
非专利文件11 S.Sukno，J.Ruso，Euphytica(1999)106：69-78 Interspecifichybridization between sunflower and wildperennial Helianthus species viaembryo rescue.
非专利文件12 R.Horn，W.Friedt，Plant Breeding 116(1997)317-322Fertility restoration of new CMS sources in sunflower(Helianthus annuus L.)
非专利文件13 Horn，R.，Plant molecular biology；aninternational journalon fundamental research and geneticengineering July 1991 v17(1)，29-36 Amitochondrial 16 kDa proteinis associated with cytoplasmic male sterility insunflower.
非专利文件14 C.Rambaud，J.Dubois，J.Vasseur(1993)Male-sterile chicorycybrids obtained by intergeneric protoplastfusion，Theor Appl Genet 87：347-352
非专利文件15 S.Varotto，E.Nenz，M.Lucchin，P.Parrini(2001)Production ofasymmetric somatic hybrid plants betweenCichorium intybus L.and Helianthusannuus L.，Theor Appl Genet102：950-956.
非专利文件16 C.Rambaud，A.Bellamy，A.Dubreucq，J.-C.Bourquin andJ.Vasseur(1997)Molecular analysis of the fourthprogeny of plants derived froma cytoplasmic male sterile chicorycybrid，Plant Breeding 116：481-486
非专利文件17 A.Dubreucq，Theor Appl Genet(1999)：1094-1105 Analyses ofmitochondrial DNA structure and expressionin three cytoplasmic male-sterilechicories originating fromsomatic hyvridisation between fertile chicoly andCMS sunflowerprotoplasts.
非专利文件18 Mizutani，Takayuki(1989)″Plantregeneration and protoplastfusion using protoplasts of lettuceand related Japanese wild species(inJapanese)″Bull.Fac.Agr.，Saga Univ 67：109-118.
发明公开
考虑到常规领域中的上述问题，本发明的目的是提供可用于F1种子生产的莴苣属胞质杂种莴苣和其生产方法。
发明人已经努力研究以解决上述问题并且发现通过使用培养向日葵和莴苣之间的融合杂交细胞的方法和再生胞质杂种植物的方法可以产生稳定的细胞质雄性不育莴苣，并且通过使用该细胞质雄性不育莴苣可以有效地产生莴苣的F1种子，从而完成了本发明。
从而，本发明包括下面的发明：
(1)生产莴苣属胞质杂种植物的方法，其特征在于包括：融合来自向日葵属植物的原生质体和来自莴苣属植物的原生质体；培养一个或多个融合细胞；并从培养自一个或多个融合细胞的细胞再生植物。
(2)根据(1)的方法，其中来自向日葵属的植物的原生质体是向日葵(H.annuusL.)植物的原生质体或者向日葵的细胞质被来自H.petiolaris、H.argophyllus、H.debilis、H.decapetalus、H.giganteus、H.rigidus、H.salicifolius、H.anomalus、H.bolanderi、H.exilis、H.maximiliani、H.neglectus、H.praecox或H.tuberosus的细胞质替代的细胞质替代株系的原生质体。
(3)根据(1)或(2)的方法，其中来自莴苣属植物的原生质体是Lactuca sativaL.、L.serriola、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijanica、L.georgica、L.dregeana、L.altaica、L.saligna、L.virosa、L.tatarica、L.indica或L.debilis的原生质体或着其种间杂种植物。
(4)根据(1)到(3)中任一项的方法，其中向日葵属的植物是细胞质雄性不育的。
(5)根据(4)的方法，其中向日葵属的植物在其线粒体中具有雄性不育基因。
(6)根据(1)到(5)中任一项的方法，其中莴苣属的胞质杂种植 物是细胞质雄性不育的。
(7)通过根据(1)到(6)中任一项的方法产生的莴苣属的胞质杂种植物或者其后代或其部分。
(8)根据(7)的莴苣属的胞质杂种植物的部分或其后代，其中所述部分包括植物的细胞或细胞质。
(9)莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分，其在其细胞质中包含来自向日葵属植物线粒体的基因。
(10)根据(9)的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分，其中向日葵属植物是向日葵或向日葵的细胞质被来自H.petiolaris、H.argophyllus、H.debilis、H.decapetalus、H.giganteus、H.rigidus、H.salicifolius、H.anomalus、H.bolanderi、H.exilis、H.maximiliani、H.neglectus、H.praecox或H.tuberosus的细胞质替代的细胞质替代株系。
(11)根据(9)或(10)的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分，其中莴苣属胞质杂种植物来自Lactuca sativa L.、L.serriola、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijanica、L.georgica、L.dregeana、L.altaica、L.saligna、L.virosa、L.tatarica、L.indica或L.debilis或其种间杂种植物。
(12)根据(9)到(11)中任一项的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分，其中来自向日葵属植物线粒体的基因是雄性不育基因。
(13)根据(9)到(12)中任一项的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分，其是细胞质雄性不育的。
(14)根据(9)到(13)中任一项的莴苣属的胞质杂种植物或其后代的部分，其中所述部分包括植物的细胞或细胞质。
(15)已经以保藏号FERM BP-10421保藏的莴苣属的胞质杂种植物的种子、从所述种子生长的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分。
(16)根据(15)的莴苣属胞质杂种植物或其后代的部分，其中所述部分包括植物的细胞或细胞质。
(17)已经以保藏号FERM BP-10647保藏的莴苣属胞质杂种植物的种子、从所述种子生长的莴苣属的胞质杂种植物或其后代或其部分。
(18)根据(17)的莴苣属胞质杂种植物或其后代的部分，其中所述部分包括植物的细胞或细胞质。
(19)生产杂交第一代种子的方法，其包括：将作为种子亲本的通过根据(6)的方法产生的莴苣属胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以所述胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交，并在杂交后收获种子亲本产生的杂交第一代种子。
(20)生产杂交第一代种子的方法，其包括：将作为种子亲本的根据(13)的莴苣属胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以所述胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交，并在杂交后收获种子亲本产生的杂交第一代种子。
(21)生产杂交第一代种子的方法，其包括：将作为种子亲本的根据(15)的莴苣属胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以所述胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂交第一代种子。
(22)生产杂交第一代种子的方法，其包括：将作为种子亲本的根据(17)的莴苣属胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以与所述胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂交第一代种子。
(23)通过根据(19)到(22)中任一项的方法生产的杂交第一代种子或者从该种子生长的子一代杂种植物。
本说明书包括日本专利申请号2005-311598的说明书和/或附图的内容，该申请是本申请优先权的基础。
附图简述
图1是电泳照片，显示了使用向日葵线粒体基因orf522(顶部)和orf873(底部)特异性引物和从作为测试材料的细胞质雄性不育向日葵的2个株系、雄性不育向日葵的一个株系和13个栽培品种莴苣提取的DNA进行的PCR结果；
图2是电泳照片，显示了使用向日葵线粒体基因orf522和orf873特异性引物测试胞质杂种植物的示例性结果；
图3是电泳照片，显示了PCR-RFLP带型，其中DNA是从作为测试材料的细胞质雄性不育向日葵的2个株系、雄性不育向日葵的一个株系和13个栽培品种莴苣提取的，使用DNA模板和叶绿体基因rbcL特异引物进行PCR，并用TaqI切割扩增产物；
图4显示了栽培的莴苣品种″告诉我″(A：花序，B：花头状花序，C：花头状花序的核心(放大率×20)和D：雌蕊和花药筒(放大率×64))的花形态；
图5显示了细胞质雄性不育莴苣的花形态(A：花序，B：花头状花序，C：花头状花序的核心(放大率×20)和D：附着花粉的雌蕊和花药筒(放大率×64))；
图6显示了细胞质雄性不育莴苣染色体的观察；
图7表明细胞质雄性不育莴苣当与雄性不育莴苣的花粉杂交时可以产生后代种子；
图8是电泳照片，显示了用向日葵线粒体基因orf873特异性引物测试从BC3代的细胞质雄性不育莴苣的14个个体叶子提取的DNA的结果；
图9A是电泳照片，显示了使用线粒体基因atp6、cox II和cob特异性引物测试从BC3代细胞质雄性不育莴苣的14个个体的叶子提取的DNA的结果。对于线粒体基因atp6、coxII和cob，所示结果是PCR-RFLP的结果，其中将PCR扩增产物用限制酶进一步消化；
图9B是电泳照片，显示了用对线粒体基因rps3、trnN、trnY、trnS、和trnP特异性的引物测试从BC3代细胞质雄性不育莴苣的14个个体的叶子提取的DNA的结果；
图10是电泳照片，显示了PCR-RFLP带型，其中从BC3代细胞质雄性不育莴苣的14个个体提取DNA，使用DNA模板和对叶绿体基因rbcL特异性的引物进行PCR，并且用TaqI切割PCR扩增产物；
图11显示了细胞质雄性不育莴苣″12 16-2-T1″X″告诉我″的F1植物的花器官和雌蕊形态；
图12显示了细胞质雄性不育莴苣″12 16-2-T1″X″稳定的″的F1植物的花器官和雌蕊形态；
图13显示了细胞质雄性不育莴苣″12 16-2-T1″X″逻辑的″的F1植物的花器官和雌蕊形态；
图14显示了细胞质雄性不育莴苣″12 16-2-T1″X″米亚″的F1植物的花器官和雌蕊形态；和
图15显示了细胞质雄性不育莴苣″12 16-2-T1″X莴苣野生种L.serriola的F1植物的植物、花器官和雌蕊形态。
实施本发明的最佳方式
根据本发明的融合的杂交细胞和胞质杂种植物可以通过包括下面步骤的方法来生产：
(1)制备原生质体；
(2)原生质体的融合处理；
(3)培养融合的杂交细胞；
(4)从小愈伤组织再生植物；
(5)选择胞质杂种植物；
(6)选择有利的株系；
(7)使用细胞质雄性不育植物和产生F1种子。
每个步骤的细节如下。
(1)原生质体的制备
(i)从莴苣属植物分离原生质体
优选地，用于制备原生质体的莴苣属植物是Lactuca sativa L.、L.serriola、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijanica、L.georgica、L.dregeana、L.altaica、L.saligna、L.virosa、L.tatarica、L.indica或L.debilis或其种间杂种植物，尤其莴苣，其是莴苣的栽培种。莴苣被分成莴笋变种(包括莴苣笋、茎莴苣，等等)、长叶莴苣变种(包括直立莴苣、罗马莴苣等)、皱褶莴苣变种(包括叶莴苣，散叶莴苣，等等)、capinata变种(头莴苣、黄油头莴苣、结球莴苣、卷心菜等等)，这些都是同一物种中的所有变种，通过生态学差异区分。在本发明中，可以合适地使用莴苣的任何变种。尽管苣荬菜、菊苣等等具有与莴苣相似的特征，但是它们不被包括在莴苣中，因为它们不属于莴苣属(″VegetableHorticulture Encyclopedia 7：Lettuce and Celery(日文)″第一版，p.87，RuralCultureAssociation，1989年4月30日出版)。
用于得到原生质体的细胞组织希望是叶肉组织，其提供高产率并且在细胞分离中是高度活性的，但是也可以将其他组织如下胚轴、茎、和愈伤组织用作材料。
分离原生质体的方法不限于具体的方法，但是可以是常用的那些方法之一(非专利文件8到18)。首先，将莴苣的细胞组织切成小块，并 用酶处理以分离原生质体。在这里，使用用于原生质体分离的酶溶液。该溶液是无机盐缓冲液，其主要含有细胞壁消化酶和渗压剂。该细胞壁消化酶不限于具体酶，但是可以是用于消化植物细胞壁的任何酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等等。在本发明中，优选Meicelase和Maserozyme R-10的组合。渗透剂可以是通常的糖醇，例如，甘露醇、山梨醇、葡萄糖，等等，并且优选是甘露醇，更优选浓度为0.3到0.7M的甘露醇。而且，希望将无机盐加入酶溶液中以稳定原生质体的膜。例如，优选加入CPW盐溶液(Cocking和Peberdy，1974)，其组成在表1中显示。优选地，在静止条件下在25到30℃进行酶处理8到20小时。
表1
CPW盐溶液的组成
KH2PO4 27.2mg/l
KNO3 101.0mg/l
CaCl2·2H2O 1,480.0mg/l
MgSO4 246.0mg/l
KI 0.16mg/l
CuSO4·5H2O 0.025mg/l
甘露醇 0.6M
pH 5.8
将通过酶处理分离的原生质体通过孔径为30到100μm的尼龙网过滤，离心，收获以除去酶溶液。然后，将原生质体悬浮在洗涤溶液中，并洗涤。尽管洗涤溶液可以是加入通常作为渗透剂的糖醇的CPW盐溶液，但是在该实施例中，优选将溶液S(其组成在表2中显示)用作洗涤溶液，因为当原生质体与来自向日葵属植物的细胞融合(其以后分离)时，希望使用溶液S(参考文献见Lenee P，Chupeau Y(1986)Plant Sci.43：69-75)。
表2
溶液S的组成
CaCl2·2H2O 2,000mg/l
KCl 250,000mg/l
MES 700mg/l
pH 5.6
然后，希望进行失活处理以防止莴苣属植物的原生质体的细胞分裂。可以通过将原生质体悬浮在含有碘化合物如碘乙酸和碘乙酰胺的CPW盐溶液等等中进行失活处理。在本发明中，优选通过将原生质体悬浮在含有5到30mM浓度的碘乙酰胺的CPW溶液中并温育5到20分钟来进行失活处理。
然后，优选通过离心用溶液S洗涤原生质体1到3次。通过密度梯度离心等进一步纯化原生质体，因为导管和细胞碎片污染原生质体悬浮液。糖、合成胶体等等可以用作纯化中的试剂。在本发明中，优选使用蔗糖溶液，更优选使用15到20％的蔗糖溶液。纯化原生质体后，用血细胞计数器测量细胞密度，并用溶液S调节悬浮液体积以对于细胞融合具有合适的细胞密度。原生质体悬浮液的优选细胞密度为1×105到1×107个细胞/ml，优选用溶液S调节体积。
(ii)从向日葵属植物分离原生质体
向日葵属植物可以用作供体材料来提供本发明的细胞质。在向日葵属中，尤其优选向日葵，其是向日葵的栽培种或者向日葵的细胞质被H.petiolaris、H.argophyllus、H.debilis、H.decapetalus、H.giganteus、H.rigidus、H.salicifolius、H.anomalus、H.bolanderi、H.exilis、H.maximiliani、H.neglectus、H.praecox或H.tuberosus的细胞质替代的细胞质替代系。
用于本发明的向日葵属植物优选是细胞质雄性不育株系。常规地，已经用H.annuus L产生了许多细胞质雄性不育株系。已知它们来自天然突变或者栽培种中多种种间杂交的后代。具体地，来自H.annuus L的天然突变体的细胞质雄性不育株系或者H.annuus L的多种细胞质替代株系是已知的，并且已经使用分子生物学技术显示了它们的分歧(非专利文件10)。从而，已经得到了显示出细胞质雄性不育的许多细胞质替代株系。在本发明中，向日葵属的多种细胞质替代株系可以用作供体材料来提供细胞质。
为了得到本发明的具有细胞质雄性不育的莴苣属胞质杂种植物，优选但不排他地将具有细胞质雄性不育基因的向日葵属植物用作供体材料来提供细胞质。当来自向日葵属植物的原生质体与来自莴苣属植物的 细胞融合时，由于那些植物的线粒体基因组之间的重组或重排，可以得到表达细胞质雄性不育的株系。本发明也包括所得到的莴苣属杂种植物，其是细胞质雄性不育的。
通过对用于原生质体的向日葵属植物细胞进行辐照也可以进行核基因组的失活。由于向日葵属细胞核基因组的失活，发生向日葵属和莴苣属细胞融合后的再生，而对向日葵属植物核基因组没有任何影响，但是具有莴苣属核基因组的再分化能力，具有向日葵属植物的细胞质基因的莴苣属植物的再生变得可能。
在本发明中，可以选择向日葵属的多种材料植物作为供体细胞来通过细胞质，如上述，并且可能产生具有多种遗传背景的莴苣属的胞质杂种植物。
为了从向日葵属植物制备原生质体，首先将向日葵属植物的细胞组织切成小块，并浸泡在酶溶液中用于原生质体分离以分离原生质体。因为高产率和细胞膜的稳固性，待使用的细胞组织优选是下胚轴，但是可以将其他组织如叶和茎用作材料。细胞壁消化酶不限于具体的酶，而是可以是可用于消化植物细胞壁的任何酶；本发明中优选使用Driserase和Maserozyme R-10的组合。而且，优选在用无机盐如KCl和NaCl调节渗透压的溶液中使用细胞壁消化酶，因为从向日葵属植物下胚轴分离的原生质体具有低的比重。例如，溶液S优选被用于本发明中。优选地，在25到30℃下在静止下进行酶处理8到20小时。将通过酶处理分离的原生质体通过孔径为30到100μm的尼龙网过滤。因为不需要来自向日葵属植物的原生质体中的核基因，所以希望通过辐射失活分离的原生质体中的核基因。辐射不限于具体的类型，而是可以是失活核基因的任何类型，包括X射线、γ射线和紫外线，等等。优选地，辐射的量是足够失活细胞核的范围中最低的。例如，本发明中优选的辐射量为0.1到0.6Gy软X射线。
(2)原生质体的融合处理
然后，将接受如上述失活处理的两种类型的细胞融合。融合方法不限于具体方法，而是可以是一种公知的方法，包括电融合(Planta，151，26-32，1981)、PEG方法(Planta，120，215-227，1974)和葡聚糖方法(Jap.J.Genet.，50，235，1975)，等等。在本发明中，优选使用改进的PEG方法。
(3)融合的杂交细胞的培养
将接受融合处理的细胞优选培养在适于从莴苣属植物培养原生质体的培养基中。已知多种从莴苣属植物培养原生质体的方法，并且任一种方法可以足够用于本发明。具体地，在本发明中优选使用一种公知方法(Nishio，T.，等人，Japanese journal ofbreeding，38，165-171)的改进方法。Nishio等人的方法是从莴苣属植物有效培养原生质体的优秀方法。然而，Nishio等人的该方法在没有修改时不适用于本发明。Nishio等人报导从莴苣属的单个植物培养原生质体，并且那些原生质体不接受任何融合处理并且因此对它们的细胞膜没有任何伤害。这使得可能从开始培养时在含有吉兰糖胶的固体培养基上培养那些原生质体。在本发明中，由于处理的胁迫，融合处理后培养的细胞的细胞膜是脆弱的。因此，难以通过Nishio等人的方法有效地培养融合细胞，因为当与吉兰糖胶混合时那些细胞破裂。因此，融合处理后的细胞适于在不含有吉兰糖胶的液体培养中初级培养以方便细胞膜的恢复，然后培养3到7天后向培养基中加入吉兰糖胶。对Nishio等人的方法的这种改进可以有效地培养融合细胞。融合细胞适于在具有较低渗透压的新鲜培养基中传代，因为它们通过反复的细胞分裂形成小愈伤组织。
(4)从小愈伤组织再生植物
当小愈伤组织生长到几毫米大小时，将它们转移到再分化培养基中并允许再生。取决于莴苣属材料植物和小愈伤组织的状态，对再分化培养基的应答可以不同。例如，适当的是使用含有0.3或1.0mg/l BA的MS培养基(Murasige，T.& Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962))或相似的培养基。将再生的新梢转移到生根培养基，例如，1/2浓度的MS培养基中，允许再生成植物。将再生的植物适应后种植在温室中。
(5)胞质杂种植物的选择
从根据上述方法再生的植物叶子提取DNA，并将向日葵属和莴苣属植物用作材料植物。例如，引入来自向日葵的线粒体基因的胞质杂种植物可以通过使用PCR检测向日葵特异的作为标记的线粒体基因，如orf522、orf708或orf873来区分。首先，设计特异性扩增靶基因的引物来进行PCR。然后，进行电泳以证实带的预期大小。这样，可以选择导入向日葵属植物的线粒体DNA的莴苣属植物个体。此外，可以用 PCR-RFLP(Tsumura，Y.，Yoshimura，K.Tomaru，N.等人，Theor.Appl.Genet.91，1222-1236，1995)检测来自向日葵属植物的线粒体DNA，通过将其与来自莴苣属植物线粒体DNA相区分而进行所述检测。
还希望将PCR-RFLP用于证实通过PCR分析选择的胞质杂种植物的叶绿体来自莴苣属植物。可以用于PCR-RFLP的叶绿体基因不限于具体的基因，而是可以是可用于检测向日葵属和莴苣属植物之间多态性的任何基因，包括rbcL、matK等等。设计特异性地扩增目标叶绿体基因的引物来进行PCR。用限制酶处理PCR扩增产物，并且由于限制酶位点的不同，用RFLP检测以证实叶绿体来源。考虑到与核基因的相容性，希望选择具有来自莴苣属植物的叶绿体的个体。
当它们是愈伤组织时以及在植物适应后可以进行如上述的DNA证实。此外，希望通过流式细胞术或通过观察染色体评估倍性。
(6)有利株系的选择
对所得的胞质杂种植物筛选在其他器官中没有形态异常的雄性不育株系。特别重要的是选择具有较高雌性能育性的株系，因为当生殖器官中存在缺陷，如雄性不育时，雌性能育性，即种子产生，倾向于降低。通过PCR-RFLP分析等分析胞质杂种植物的线粒体基因组，并使用所述数据进行选择可以实现有效选择。例如，当将向日葵属植物的一些线粒体基因导入个体中，使得在个体中表达雄性不育时，尽管个体中的许多线粒体基因仍然与莴苣属植物相同，但是所述个体与莴苣属植物的细胞核具有较高相容性，并且因此除了雄性不育之外的性状是正常的概率较高。
此外，将所选的雄性不育个体与具有正常细胞质的莴苣的花粉杂交以证实雄性不育通过细胞质遗传传递给胞质杂种后代。而且，在多种环境下生长许多杂种后代以证实雄性不育是稳定的。
为了增强选择有利株系的可能性，增加莴苣属胞质杂种植物(其是用于选择的候选者)数目的技术是效的。此外，主要从相对小数目的作为候选者的莴苣属胞质杂种植物选择具有细胞质雄性不育的有利的植物株系，然后进一步改善所选的有利植物株系的细胞质的技术对于得到所希望的有利株系也是有效的。上述两种技术之一可以选择有利的株系。此外，可以使用两种技术的组合。进一步改善莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物细胞质的优选方法是例如，使用莴苣属细胞质雄性不育 胞质杂种植物作为供体材料以提供细胞质并进行与目的莴苣的不对称细胞融合。这种不对称细胞融合导致例如，线粒体基因组的组合或重排以增强选择这样的株系的可能性，所述株系保持细胞质雄性不育并且包括与莴苣的细胞核基因具有较高相容性的细胞质。
通过上述步骤产生和选择的莴苣属胞质杂种植物在其细胞质中包含来自细胞质，优选向日葵属植物的线粒体的基因。莴苣属的适当的胞质杂种植物包含莴苣属植物的核基因组，优选地还包含莴苣属植物的叶绿体基因组。本发明还设计莴苣属的适当的胞质杂种植物、其后代或其部分。在本发明中，“莴苣属胞质杂种植物的后代”指下一代和再下一代莴苣属胞质杂种植物，其通过细胞质遗传从所述适当的细胞质继承，并且通过来自莴苣属植物的花粉杂交得到，所述花粉可以与莴苣属胞质杂种植物杂交。在本发明中，“莴苣属胞质杂种植物或其后代的部分”包含有关植物的一个或多个细胞，或来自所述一个或多个细胞的细胞质，它尤其指器官或组织，如花、叶、茎和根；或者来自这些器官或组织的细胞(包括从细胞制备的原生质体)或细胞质；或者前述细胞或细胞质的集合。
(7)细胞质雄性不育植物的用途和F1种子的生产
通过有利的莴苣属植物与通过本发明方法生产的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物的连续回交可以得到具有细胞质雄性不育的有利的株系。所得的具有细胞质雄性不育的有利株系可以用作产生F1种子的种子亲本。
更优选地，通过使用本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物作为供体材料以提供细胞质，并且通过进行供体材料和目的莴苣之间的不对称细胞融合，可以短时间内产生具有细胞质雄性不育的种子亲本。这种不对称细胞融合导致例如线粒体基因组的重组或重排，并且可以选择保持细胞质雄性不育并且包括与莴苣的核基因具有较高相容性的细胞质的株系。
此外，还可以将本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物导入莴苣属的其他种。在莴苣属植物中已知大约100种野生型种，并且栽培的莴苣品种L.sativa可以与下列小组的莴苣中的9种野生型种杂交：L.serriola、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijanica、L.georgica、L.dregeana、L.altaica、L.saligna和L.virosa(专 利文件17)。
如果可以杂交，细胞质和细胞核的替代可以通过常规育种技术通过连续回交以产生细胞质和细胞核的新的组合(核替代)来容易地实现。从而，可以将表达细胞质雄性不育的细胞质容易地导入这些野生型种或种间杂种中，通过将它们与本发明生产的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物杂交可以实现所述导入。此外，通过胚和胚珠培养可以扩大应用范围。此外，在莴苣属中，为了引入野生型种的并且有用的性状的目的，已经通过细胞融合产生了许多与野生型种的体细胞杂种(例如，专利文件17；Plant cell reports 9：531-534(1991)；和非专利文件18)。此类野生型种包括例如，L.tatarica、L.virosa、L.indica、L.debilis等等，并且可以使用这些细胞融合技术将通过本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物的细胞质导入莴苣属的许多野生型种和它们的种间杂种中。通过将通过本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物的细胞核辐射和失活，并将它们用作细胞质供体细胞进行不对称细胞融合，可以更有效地进行细胞质的导入。从而，使用常规技术，如连续回交和细胞融合技术，可以将通过本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物的细胞质导入许多莴苣属植物中。常规地，还可以将细胞质雄性不育性导入已经导入了野生种的有用基因的莴苣属的种间杂种植物中。
因此，通过使用作为种子亲本的通过本发明产生的莴苣属细胞质雄性不育胞质杂种植物或者通过上述步骤从有关植物产生或生成的后代；将它们与作为花粉亲本的可杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂交第一代种子，可以实现莴苣属植物的有效的F1种子生产。杂交方法不限于任何具体方法，但是可以是允许花粉亲本株系的花粉对种子亲本的雌蕊授粉的任何常规方法，包括例如，风媒传粉、昆虫传粉(例如，专利文件20)和人工杂交，其中将来自花粉亲本系的花粉手工置于种子亲本的雌蕊上。有效的选择的方法是适于种子生产地区和设施的经济的方法。
根据上述步骤的莴苣F1品种生产使得可以快速育种具有有利性状的莴苣品种，并产生具有单一产品品质和对环境的优良的适应性等的适合市场销售的莴苣品质。
用下面的实施例详细描述本发明，但是本发明不局限于这些实施 例。
实施例1
(1)原生质体的制备
(i)莴苣原生质体的分离
该实施例描述了使用莴苣品种′告诉我′(Sakata Seed)的方法。将灭菌的种子平板接种在补充了10g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基上，并在20℃下以每天16小时光照培养1个月。摘取伸长的真叶约1g并切成约2mm大小的片。将它们浸泡在含有0.4％ Meicelase、0.08％Maserozyme R-10和甘露醇的10ml CPW盐溶液中，并在静止下在25℃温育16小时。
将原生质体悬浮液通过92微米尼龙网过滤，并以500rpm离心3分钟。除去上清液后，将沉淀物重悬浮在含有15mM碘乙酰胺的2ml溶液S中，并在25℃下静止温育5分钟。将碘乙酰胺处理的原生质体以300rpm离心3分钟，并除去上清液后重悬浮到10ml溶液S中，并用溶液S洗涤3次。以300rpm离心3分钟后，除去上清液并将沉淀重悬浮在含有20％蔗糖的CPW盐溶液中，终体积为9.5ml。将0.5ml溶液S在悬浮液上分层，并将其以1000rpm离心5分钟。
将移动到溶液S上层的纯化的原生质体用巴氏移液器收集到离心管中。将原生质体悬浮到2ml溶液S中并且取出少量悬浮液用于用血细胞计数器测定原生质体悬浮液的细胞密度。向悬浮液中加入溶液S至1×106个细胞/ml。
(ii)向日葵原生质体的分离
该实施例描述了使用用于切花的向日葵栽培品种″Nozomi″(SakataSeed)(其具有向日葵特异基因orf522和orf873)和用于切花的向日葵育种系″IB5″(其具有向日葵特异基因之一orf873，但是没有orf522)的步骤。将灭菌的种子平板接种在补充了10g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基上，并在25℃在黑暗中培养7天。当下胚轴生长到约50mm时，将它们切成1cm长度，并沿着下胚轴延伸的方向进一步分成两半。将来自约10个下胚轴的切块浸入含有0.5％纤维素酶Onozuka R-10和0.1％Maserozyme R-10的10ml溶液S中，并静止温育16小时。
通过92微米尼龙网过滤原生质体悬浮液。在离心管中，转移含有 17％蔗糖的2mlCPW盐溶液，并且原生质体悬浮液在其上分层。在1200rpm离心5分钟后，收集带中的纯化的原生质体，并小心除去带上的上层，避免原生质体误吸。通过加入含有17％蔗糖的CPW盐溶液，以9.5ml终体积悬浮原生质体。将0.5ml溶液S在悬浮液上分层，并将其以1200rpm离心5分钟。
用巴氏移液器收集移动到溶液S上层的原生质体，转移到塑料皿中，并暴露于0.5Gy的软X射线。将暴露于软X射线的原生质体悬浮液转移到离心管中，用含有17％蔗糖的CPW盐溶液补充到9.5ml。将0.5ml溶液S在悬浮液上分层并将其以1200rpm离心5分钟。将移动到溶液S层的原生质体转移到离心管中，并用10ml溶液S将悬浮液补充到10ml。取出少量悬浮液用于用血细胞计数器测定原生质体悬浮液的细胞密度。向悬浮液中加入溶液S至3 x106细胞/ml。
(2)原生质体的融合处理
将等体积的用碘乙酰胺处理的莴苣原生质体悬浮液和用软X射线辐射的向日葵原生质体悬浮液混合并在9cm皿底部中央滴入2ml该混合物。静止温育30分钟后，在原生质体混合物周围逐滴加入3ml PEG溶液(300g/l PEG3350、1,500mg/l CaCl2-2H2O、和100mg/lKH2PO4，pH5.5)。
1分钟后，在原生质体混合物周围逐滴加入3.5ml CPW盐溶液。再过2分钟后，再次在原生质体混合物周围滴加3.5ml CPW盐溶液。5分钟后、小心地通过从培养皿边侧吸取除去液体、并在培养皿边侧加入20ml的CPW盐溶液。将该CPW盐洗涤以5分钟间隔重复3次。
(3)融合的杂种细胞的培养
在除去洗涤溶液后，向原生质体加入10ml 1/2浓度的MS培养基(pH 5.8)，该培养基含有2.7g/l六水合琥珀酸钠、1.0g/l酪蛋白氨基酸、1.0mg/l NAA、0.3mg/l BA和0.3M蔗糖，NH4NO3浓度降低到200mg/l(下文中称作莴苣原生质体培养基)，将它们在黑暗中25℃培养。
开始培养后3天，混合5ml 4倍浓缩的莴苣原生质体培养基(具有0.3M蔗糖)和5ml含有0.6％吉兰糖胶的0.3M蔗糖溶液(pH 5.8)，并用该培养基混合物在半固态凝胶中继续培养。
开始培养后10天，将10ml含有融合的杂交细胞的培养物与凝胶一起转移到10ml莴苣原生质体培养基中，该培养基中蔗糖浓度被改变为 0.15M。开始培养后20天，此时小愈伤组织变得肉眼可见，将它们移植到含有1.0％蔗糖和0.3％吉兰糖胶的莴苣原生质体培养基上(固体培养基，pH 5.8)。
(4)从小愈伤组织再生植物
开始培养后30天，此时小愈伤组织约为2mm大小，将它们转移到含有0.1mg/l NAA、0.3mg/l BA、1.0％蔗糖和0.8％琼脂的MS培养基(pH 5.8)上。开始培养后40到60天，将从愈伤组织再分化的新梢转移到含有1.0％蔗糖和0.8％琼脂的1/2MS培养基(pH 5.8)上，并且它们生根和再生成胞质杂种植物。将胞质杂种植物转移到蛭石，使其适应并在温室生长。
(5)具有向日葵特异性线粒体基因的胞质杂种植物的选择
根据本领域已知的方法(Jhingan，A.K.(1992)Methods in molecular andcellular biology 3：15-22)从胞质杂种植物的叶子提取总DNA。为了通过PCR检测向日葵特异性DNA，基于本领域可公开得到的核酸序列信息设计orf 522和orf873基因特异性引物(表3)(Gene Bank检索号Z23137和X62592)。将引物orf522-F和orf522-R、引物orf873-F和orf873-R的组合用于PCR，使用提取的，总基因组DNA作为模板。用35个循环的：94℃变性1分钟、60℃退火2分钟和72℃延伸2分钟进行PCR。通过在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离PCR产物，浸泡在溴化乙锭溶液中，并在紫外线下拍照以确定是否存在具有209bp和798bp预期大小的带。
表3
用于本发明的引物和它们的核酸序列
为了检查靶DNA片段的特异性扩增，从表4中所列的2个株系的细胞质雄性不育向日葵、1个株系的雄性不育向日葵(育种株系″OS06″)和13个栽培品种的莴苣提取DNA，使用向日葵线粒体基因orf522和orf873特异性的引物进行PCR。结果显示在图1中。图1是电泳照片，显示了使用对向日葵线粒体基因orf522(顶部)和orf873(底部)特异性的引物和从2个株系的细胞质雄性不育向日葵(泳道1和2)、1个株系的雄性不育向日葵(泳道3)和13个栽培品种的莴苣(泳道4到16)提取DNA作为测试物质进行PCR的结果(图1中符号：M：分子量标准；1：Nozomi，2：IB5，3：OS06，4：告诉我，5：稳定的，6：逻辑的，7：米亚，8：V莴苣，9：Santanasu，10：Sirius，11：Asure，12：Brutus7，13：Spark，14：Santos 22，15：Dejero，16：Souther)。如图1中所示，在向日葵栽培种″Nozomi″中检测到orf522(209bp)和orf873(798bp)带，在向日葵育种株系″IB5″中检测到orf873(798bp)带。另一方面，在被检查的所有13个莴苣品种中都没有检测到任一带。该结果证实特异性DNA扩增在使用对orf522和对orf873特异的引物并使用莴苣DNA作为模板的PCR中没有发生。基于该结果，通过从不对称细胞融合产生的植物提取DNA，并进行PCR，可能选择具有向日葵特异性的线粒体基因的胞质杂种植物。
图2显示了测试该实施例得到的胞质杂种植物的示例性结果。图2是电泳照片，显示了使用对向日葵线粒体基因orf522和orf873特异性 的引物测试胞质杂种植物的示例性结果(图2中符号：M：分子量标准；1：Nozomi，2到7：使用″Nozomi″作为供体材料以提供细胞质产生的胞质杂种植物，8：IB5，9到14：使用″IB5″作为供体材料提供细胞质产生的胞质杂种植物)。将两个向日葵品种″Nozomi″和″IB5″用作细胞质供体，并且使用任一细胞质可能产生胞质杂种植物。
在图2的泳道3和5中检测不到orf873的带，尽管orf522被导入了这些个体中。这可能是在线粒体中重组的结果。
表4
用于测试引物特异性的可育的莴苣品种
序号 品种名称 雄性能育性 供应商
1 告诉我 可育 Sakata Seed Corporation
2 稳定的 可育 Tsuruta Seed Co.，Ltd.
3 逻辑的 可育 The Yokohama Nursery Co.， Ltd.
4 米亚 可育 Sumika Agrotech Co.，Ltd.
5 V莴苣 可育 Kaneko Seeds Co.，Ltd.
6 Santanasu 可育 Sakata Seed Corporation
7 Sirius 可育 Sakata Seed Corporation
8 Asure 可育 Sumika Agrotech Co.，Ltd.
9 Brutus 7 可育 The Yokohama Nursery Co.， Ltd.
10 Spark 可育 Watanabe Nouji Co.，Ltd.
11 Santos 2 可育 Fujii Seed Co.，Ltd.
12 Dejero 可育 Sumika Agrotech Co.，Ltd.
13 Souther 可育 TAKII & CO.，LTD.
为了通过PCR-RFLP确定叶绿体来源，基于本领域中可公开得到的核酸序列信息(Gene Bank检索号L13929)设计对向日葵叶绿体基因rbcL特异性的引物(表3)。使用提取的完整基因组DNA作为模板，用引物组合rbcL-F和rbcL-R进行PCR。用35个循环的：94℃1变性1分钟、60℃退火2分钟、72℃延伸2分钟进行PCR。用限制酶TaqI消化PCR产物，通过电泳在1.8％琼脂糖凝胶中分离，浸泡在溴化乙锭溶液中，并在紫外线下照相，以确定它们被消化的情况。引物向日葵和莴苣的 rbcL基因是高度同源的，并且产生相同大小的扩增产物，所以，必须用限制酶TaqI消化PCR产物。通过RFLP检测限制酶位点的不同可以确定叶绿体来源。图3是电泳照片，显示了PCR-RFLP带型，其中DNA是从2个株系的细胞质雄性不育向日葵(泳道1和2)、1个株系的雄性能育性向日葵(泳道3)和13个栽培品种的莴苣(泳道4到16)提取的，使用DNA模板和对叶绿体基因rbcL特异性的引物进行PCR，并将扩增产物用TaqI切割(图3中符号：M：分子量标准，1：Nozomi，2：IB5，3：OS06，4：告诉我，5：稳定的，6：逻辑的，7：米亚，8：V莴苣，9：Santanasu，10：Sirius，11：Asure，12：Brutus 7，13：Spark，14：Santos 22，15：Dejero，16：Souther)。如图3中所示，尽管从莴苣基因扩增的产物不含有限制酶TaqI位点，并且从而可以作为1096bp大小的一条带被检测到，但是来自向日葵的产物含有限制性TaqI位点，从而作为311bp和785bp大小的两条带被检测到。因此，容易区分叶绿体来源。该结果表明通过从不对称细胞融合得到的植物提取DNA并进行PCR-RFLP，可能选择具有莴苣叶绿体的胞质杂种植物。
(6)细胞质雄性不育植物的选择
由于来自莴苣的核基因和来自引入的向日葵的线粒体基因之间的不亲和性，此类胞质杂种植物的许多个体显示出形态异常。除去那些具有形态异常的个体。因为线粒体基因组在细胞融合时经历高频率的重组和重排，所以在再生植物的每个个体中都观察到形态变化。因为花器官对于不亲和性引起的形态异常尤其敏感，所以产生许多胞质杂种植物并筛选显示出雄性不育和其他方面正常形态的有利株系。通常，莴苣显示出雄性先熟并且当雌蕊仍然在花药管中延长时它就传粉了，因此，在开花时，大量的花粉附着到雌蕊，如图4中所示。为此，莴苣具有非常高的自花授粉率。在本发明中选择的细胞质雄性不育株系的最希望的候选者(下文中称作″1216-2″(来自″IB5″向日葵))中，根本没有花粉附着到雌蕊，甚至在花药管中也没有花粉，如图5中所示。此外，在花器官和其他器官的形态中没有观察到明显差异。此外，染色体数目的研究证实它是2n＝18，与生长莴苣相同(图6)。
当所选的细胞质雄性不育株系″1216-2″与具有正常细胞质的莴苣花粉杂交时，它结果并且正常产生种子，如图7中所示。这证实在该株系中保持了雌性可育性。
此外，当″1216-2″与雌性可育莴苣杂交时，所有后代植物显示出雄性不育。这证实雄性不育在细胞质中引起，并且通过细胞质遗传传递。
图8显示了使用向日葵基因orf873特异性引物进行PCR来测试″1216-2″与″告诉我″第二次回交后BC3代的14个个体的结果(图8中结果：M：分子量标准，S：IB5，L：告诉我，1到14：细胞质雄性不育莴苣的BC3代的14个个体(1216-2-T1-1到14))。所有个体都具有orf873。该结果表明向日葵线粒体基因被以稳定方式传递。
此外，基于本领域中可公开获得的向日葵和莴苣中的线粒体基因的核酸序列信息(Gene Bank检索号X82387、X62341、X98362、AF319170、X73425和X87209)设计表3中列出的引物，并且使用PCR和PCR-RFLP方法分析其他线粒体基因。通过区分来自不同大小的PCR扩增产物的基因型分析trnN和trnY之间的基因间区域(下文中称作trnN-trnY)和trnS和trnP之间的基因间区域(下文中称作trnS-trnP)，并且通过PCR-RFLP，即通过用限制酶消化PCR扩增产物，分析线粒体基因atp6、cox II和cob。即，通过限制酶消化PCR扩增产物并基于消化带型的差异。此外，通过PCR-RFLP分析叶绿体基因rbcL。图9是来自PCR和PCR-RFLP实验的电泳照片(图9中符号：M：分子量标准；S：IB5，L：告诉我，1到14：细胞质雄性不育莴苣的BC3代的14个个体(1216-2-T1-1到14))。结果也总结在表5中。
表5
通过PCR和PCR-RFLP方法分析细胞质雄性不育莴苣的BC3代后代中的细胞质
Sun：向日葵类型，Let：莴苣类型
该结果表明线粒体基因atp6出现在向日葵类型中，但是分析的其他线粒体基因出现在莴苣类型中。图10是电泳照片，显示了PCR-RFLP的结果，其中DNA是从细胞质雄性不育莴苣的BC3代的14个个体提取的，使用DNA模板和对叶绿体基因rbcL特异性的引物进行PCR，并用限制酶进一步消化PCR扩增产物(图10中的符号：M：分子量标准；S：IB5，L：告诉我，1到14：细胞质雄性不育莴苣的BC3代的14个个体(1216-2-T1-1到14))。图10中的PCR-RFLP结果表明叶绿体基因rbcL也出现在莴苣型的所有个体中。从而，发现在本发明中产生的细胞质雄性不育莴苣中仅仅掺入了一部分向日葵线粒体基因，并且叶绿体来自莴苣。此外，用于测试后代的所有14个个体出现在相同的带型中。这表明线粒体基因组在后代中是稳定的。然而，图9、10和表5中显示的结果仅仅是分析表达细胞质雄性不育的个体的示例性结果，并且细胞质雄性不育莴苣中的带型不一定在相同的带型中。
上面的结果表明通过不对称细胞融合引入一部分向日葵线粒体DNA可以产生细胞质雄性不育莴苣。基于迄今细胞质分析的结果，认为由于诱导负责雄性不育的线粒体基因的重组，或者线粒体基因组的重排而引 起了雄性不育。
从而，发现本发明生产的胞质杂种莴苣是细胞质雄性不育莴苣，其具有线粒体基因组的精致的重组，由于线粒体基因组的改变而具有细胞质雄性不育性状，同时，具有与莴苣的核基因组高度相容的线粒体基因组。
(7)细胞质雄性不育植物的用途和F1种子生产
将产生的细胞质雄性不育莴苣，例如″1216-2-T1″(其是″1216-2″与″告诉我″杂交的后代)与作为花粉亲本的5个可通过商业途径获得的纯种品种″告诉我″(Sakata SeedCorporation)，″稳定的″(TsurutaSeed)，″逻辑的″(The Yokohama Nursery Co.，Ltd.)，″米亚″(SumikaAgrotech Co.，Ltd.)，和″V莴苣″(Kaneko Seeds)杂交，并收获F1种子。
将F1种子播种在穴盘上并培养幼苗后，将它们种植在10号盆上并如温室中通常的生长，然后研究它们的性质。测试每种株系或品种的3个株。所有株系和品种都正常生长。用每个株的10朵花研究每个株系或品种的雄性不育。用立体显微镜进行详细观察。当它们开花时，一个接一个观察到花瓣颜色和花器官形状，并且还在开花后检查自花授粉种子的存在。检查的结果显示在表6中。所有个体F1株系，包括″1216-2-T1″和上面的5个纯种品种都显示出100％雄性不育。此外，如图11到14中所示，通过自花授粉使得花粉在雌蕊上的粘附根本没有被观察到，而且在与不同于″告诉我″的莴苣品种杂交的情况下也是如此，并且花药中没有花粉的迹象。此外，如图15中所示，在从与莴苣野生种L.serriola的花粉杂交开发的杂种后代中也没有观察到自花授粉引起的雌蕊上花粉的粘附，并且在花药上也没有花粉迹象。
该结果表明甚至当核基因改变成不同于″告诉我″的基因型时，也保持了雄性不育，而不产生任何花粉，并且证实它的雄性不育在细胞质中引起。从而，根据本发明产生的胞质杂种植物表明显示出稳定的细胞质雄性不育。
此外，通过与用于产生F1的相同品种的花粉杂交，研究了不产生花粉的细胞质雄性不育株系的雌性可育性。对一个株检测10朵花，并将能够每朵花产生10或更多粒种子的株系和品种在雌性可育性中打分为“是”。如表6中所示，不管基因型的不同，所有细胞质雄性不育株 系都具有雌性可育性。这证实根据本发明产生的细胞质雄性不育莴苣可以用于有效的F1种子生产。
表6
莴苣测试品种和BC3代″1216-2-T1″细胞质雄性不育莴苣之间F1植物的花器官中性质的分析
花粉产生率：产生花粉的花数目/检查的花的总数
将″1216-2″和″告诉我″之间杂交的后代″1216-2-T1″的种子于2005年9月29日保藏在国家工业科学和技术研究所(National Instituteof Advanced Industrial Scienceand Technology)(Chuo 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的国际专利生物保藏单位(保藏结构给予鉴定参考号SSC-LET-05-001和保藏号FERM BP-10421)。
实施例2
使用″1216-2-T 1″作为供体材料以提供细胞质并进行与″V莴苣″(Kaneko Seeds)的不对称原生质体融合来产生细胞质雄性不育胞质杂种植物″50125-3″。在″50125-3″的花中，没有观察到粘附到雌蕊的花粉粒，并且在花的花药中也没有观察到花粉粒。此外，与″V莴苣″相比，在花 器官的形状等方面没有观察到明显不同。当将所选的细胞质雄性不育株系″50125-3″与具有正常细胞质的莴苣的花粉杂交时，它正常结果和产生种子。这证实在该株系中保持了雌性可育性。此外，当将″50125-3″与雄性不育莴苣的花粉杂交时，所有后代植物都是雄性不育的。这证实雄性不育由细胞质引起并且是细胞质遗传的。
表7显示了10个个体″50125-3-V1-1-10″的线粒体基因的PCR和PCR-RFLP分析结果，″50125-3-V1-1-10″是通过″50125-3″与″V莴苣″杂交得到的后代。观察到例如，在″50125-3-V1-1-10″中保持了向日葵型和莴苣型a t p6基因，与用作供体材料以提供细胞质的″1216-2-T1″相比不同。
然而，图7中的结果是表达细胞质雄性不育的个体的分析的示例性结果，并且细胞质雄性不育莴苣中的带型不必是相同的图式。
将″50125-3″和″V莴苣″杂交的后代″50125-3-V1″的种子于2006年7月31日保藏在国家高等工业科学和技术研究所(National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(Chuo 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的国际专利生物保藏中心，该保藏单位给予鉴定参考号SSC-LET-06-001和保藏号FERM BP-10647)。
表7
提供PCR和PCR-RFLP方法分析细胞质雄性不育莴苣″50125-3-V1″的BC2代后代中的细胞质
+：存在，-：不存在
Sun：向日葵型，Let：莴苣型
工业实用型
本发明提供了具有来自向日葵细胞质的胞质杂种莴苣。当本发明的胞质杂种莴苣是细胞质雄性不育莴苣时，与使用核遗传雄性不育植物的商业F1种子生产相比，可以通过使用该莴苣作为种子亲本实现F1种子的有效和高纯度的生产。
将本文引用的所有出版物、专利和专利申请都引入本文作为参考。
<110>莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法
<120>Sakata seed corporation
<130>PH-2882-PCT
<150>JP 2005-311598
<151>2005-10-26
<160>18
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
cgtccttgcg tgagggtttg 20
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
tgagtaccgtt ctctcacga gttg 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
gctactcgga cgaaaactag gaac 24
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
cccaacttca cgcggaacag 20
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
tcaacctgga gttccgcctg aag 23
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
gtgccctaaa gttcctccac cgaa 24
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
gctaactctc agtttggtcc tac 23
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
ccagaccggt taatgcaaga 20
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
ctggcttacc ggtaatctcc aa 22
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
cttgcaagtt tccccgcaaa 20
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
tcttctccac actgaatcag ca 22
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
agaatgggcg ttatggcaaa g 21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>13
ggaaatccga tttcggtaag 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>14
agggtccttt taagtggatg 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>15
gagcggtcgg ctgttaactg 20
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>16
cagatttaca gtctgtcgct tttaacc 27
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>17
ggcattggtt tgctaaatcg acatac 26
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>18
acctatggcc ctctgtaccc 20

Claims (13)

1.莴苣属细胞质杂种植物的包含重组线粒体基因组的线粒体，所述莴苣属细胞质杂种植物的细胞质包含来自向日葵属植物的线粒体的基因，并且是细胞质雄性不育的。
2.根据权利要求1的线粒体，所述向日葵属植物是向日葵或是，向日葵的细胞质被来自H.petiolaris、H.argophyllus、H.debilis、H.decapetalus、H.giganteus、H.rigidus、H.salicifolius、H.anomalus、H.bolanderi、H.exilis、H.maximiliani、H.neglectus、H.praecox或H.tuberosus的细胞质所替代的向日葵细胞质替代株系。
3.根据权利要求1或2的线粒体，其中莴苣属细胞质杂种植物来自Lactuca sativa L.、L.serriola、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijan ica、L.georgica、L.dregeana、L.altaica、L.saligna、L.virosa、L.tatarica、L.indica或L.debilis或其种间杂种植物。
4.根据权利要求1或2的线粒体，其中来自向日葵属植物线粒体的基因是雄性不育的基因。
5.根据权利要求1或2的线粒体，其中所述莴苣属细胞质杂种植物通过一种特征在于包括：将该向日葵属植物来源的原生质体与该莴苣属植物来源的原生质体融合；培养一个或多个该融合细胞；并从自一个或多个该融合细胞培养的细胞再生莴苣属植物的方法来产生。
6.根据权利要求1到5中任一项的线粒体的重组线粒体基因组。
7.以保藏号FERM BP-10421保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代的包含重组线粒体基因组的线粒体。
8.以保藏号FERM BP-10421保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代的重组线粒体基因组。
9.以保藏号FERM BP-10647保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代的包含重组线粒体基因组的线粒体。
10.以保藏号FERM BP-10647保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代的重组线粒体基因组。
11.一种生产杂种第一代种子的方法，包括将作为种子亲本的在细胞质中包含来自向日葵属植物的线粒体的基因，并且是细胞质雄性不育的莴苣属细胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以与该细胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂种第一代种子。
12.一种生产杂种第一代种子的方法，包括将作为种子亲本的以保藏号FERM BP-10421保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以与该细胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂种第一代种子。
13.一种生产杂种第一代种子的方法，包括将作为种子亲本的以保藏号FERM BP-10647保藏的莴苣属细胞质杂种植物的种子生长的莴苣属细胞质杂种植物或其后代与作为花粉亲本的可以与该细胞质杂种植物杂交的莴苣属植物杂交；并在杂交后收获种子亲本产生的杂种第一代种子。
CN200680039986.7A 2005-10-26 2006-10-20 莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法 Active CN101522896B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP311598/2005 2005-10-26
JP2005311598 2005-10-26
PCT/JP2006/321456 WO2007049730A1 (ja) 2005-10-26 2006-10-20 細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101522896A CN101522896A (zh) 2009-09-02
CN101522896B true CN101522896B (zh) 2016-09-07

Family

ID=37967838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680039986.7A Active CN101522896B (zh) 2005-10-26 2006-10-20 莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8058505B2 (zh)
EP (2) EP1950290B1 (zh)
JP (1) JP4139429B2 (zh)
KR (1) KR101106932B1 (zh)
CN (1) CN101522896B (zh)
AU (1) AU2006307069C1 (zh)
BR (1) BRPI0618023A2 (zh)
EG (1) EG26029A (zh)
ES (1) ES2547068T3 (zh)
WO (1) WO2007049730A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433294A (zh) * 2011-11-23 2012-05-02 中国科学院新疆理化技术研究所 一种莴苣原生质体的提取方法
US9574237B2 (en) 2011-11-28 2017-02-21 Anglo Netherlands Grain B.V. Method for differentiating fertile and sterile plant lines by detection of polymorphic markers in chloroplast DNA
EA201491670A1 (ru) 2012-03-13 2015-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Генетическое снижение мужской репродуктивной функции у растений
EP2825550A2 (en) 2012-03-13 2015-01-21 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
EP2825656A1 (en) 2012-03-13 2015-01-21 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
AU2013398123B2 (en) * 2013-08-14 2019-07-18 Bejo Zaden B.V. Cytoplasmic male sterile cichorium plants
CN107828909A (zh) * 2017-11-15 2018-03-23 云南省农业科学院花卉研究所 一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法
WO2019111975A1 (ja) 2017-12-06 2019-06-13 株式会社サカタのタネ ハキリバチ属のハチを用いるＬａｃｔｕｃａ属植物種子の生産方法
WO2019160748A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Syngenta Participations Ag Powdery mildew resistant sunflower
WO2020213736A1 (ja) * 2019-04-17 2020-10-22 株式会社ＰＥＺＹ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ 情報処理装置、情報処理方法、プログラム、及び記憶媒体
TW202107981A (zh) * 2019-04-17 2021-03-01 日商莎卡達種子股份有限公司 低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣（Ｌａｃｔｕｃａ）屬植物
JPWO2022107839A1 (zh) * 2020-11-20 2022-05-27
CN116326473A (zh) * 2023-03-10 2023-06-27 贵州师范大学 白菜-甘蓝型油菜代换系品种油菜的选育方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0771523A1 (en) * 1995-11-02 1997-05-07 Enza Zaden, De Enkhuizer Zaadhandel B.V. A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0214601A3 (en) 1985-09-04 1988-08-31 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Creation of cytoplasmic male sterility maintainer line trough protoplast fusion
JPH0671398B2 (ja) 1986-04-02 1994-09-14 三菱商事株式会社 雑種植物の製造方法
JP2530620B2 (ja) 1986-07-31 1996-09-04 三菱商事株式会社 細胞質雑種細胞の製造方法
JPS6379548A (ja) 1986-09-22 1988-04-09 三菱商事株式会社 雑種植物の製造方法
JPS6420041A (en) 1987-07-13 1989-01-24 Mitsubishi Corp Production of unsymmetrical cell hybrid plant
US5254802A (en) 1987-12-17 1993-10-19 Sietske Hoekstra Male sterile brassica plants
JPH01196239A (ja) 1988-02-02 1989-08-08 Mitsui Toatsu Chem Inc イネのサイブリッド植物の作出方法
US5360725A (en) * 1988-02-02 1994-11-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Method of producing rice cybrid cells
JPH01206931A (ja) 1988-02-10 1989-08-21 Kyodo Shiryo Kk ニンジンにおける細胞質雄性不稔ラインの作製方法
JP2687396B2 (ja) 1988-02-26 1997-12-08 三菱化学株式会社 細胞質雑種植物の製造方法
JP2824841B2 (ja) 1988-10-08 1998-11-18 株式会社ニチレイ 雄性不稔トマト植物の簡易作出法
JP3149090B2 (ja) 1989-05-17 2001-03-26 三菱化学株式会社 細胞質雑種植物の作成方法
FR2667078B1 (fr) 1990-09-21 1994-09-16 Agronomique Inst Nat Rech Sequence d'adn conferant une sterilite male cytoplasmique, genome mitochondrial, mitochondrie et plante contenant cette sequence, et procede de preparation d'hybrides.
JPH0731307A (ja) 1993-07-14 1995-02-03 Sakata No Tane:Kk 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法
WO1995009910A1 (fr) 1993-10-01 1995-04-13 Mitsubishi Corporation Gene identifiant un cytoplasme vegetal sterile et procede pour preparer un vegetal hybride a l'aide de celui-ci
AU716124B2 (en) 1995-09-11 2000-02-17 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plants which contain the polima CMS cytoplasm and are male sterile at high and low temperatures
NL1003239C2 (nl) 1996-05-31 1997-12-03 Bejo Zaden Bv Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant.
FR2749321B1 (fr) 1996-05-31 1998-08-21 Florimond Desprez Veuve Et Fil Genome vegetal recombine, mitochondrie et cellule le contenant, et procede de selection d'une sterilite male cytoplasmique chez une plante du genre cichorium
JP3532707B2 (ja) 1996-10-07 2004-05-31 株式会社ニチレイ 細胞質雄性不稔を引き起こす機能を有するミトコンドリア遺伝子
JP3532708B2 (ja) 1996-10-07 2004-05-31 株式会社ニチレイ 葯欠損型の細胞質雄性不稔を引き起こす機能を有するミトコンドリア遺伝子
NL1009044C2 (nl) 1998-04-29 1999-11-01 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadha Strikte zelfbevruchters met een gemodificeerde bloemmorfologie.
JP3635036B2 (ja) 2001-02-26 2005-03-30 株式会社採種実用技術研究所 ケナガチビコハナバチを用いた作物の採種方法
JP3949637B2 (ja) 2003-10-10 2007-07-25 長野県 レタス雄性不稔性系統、およびレタスｆ１種子の生産方法
JP2005311598A (ja) 2004-04-20 2005-11-04 Elmo Co Ltd 資料提示装置
NL1035698C2 (nl) * 2008-07-14 2010-01-18 Bejo Zaden Bv Cytoplasmatisch mannelijk steriele plant met een van prei verkregen nicleairkerngenoom, werkwijze voor het verkrijgen hiervan, cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant en gebruik van een cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant voor het overbrengen van cytoplasmatische mannelijke steriliteit in een plant.
FR2942583A1 (fr) * 2009-03-02 2010-09-03 Clause Plantes du genre diplotaxis porteuses d'une sterilite male cytoplasmique

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0771523A1 (en) * 1995-11-02 1997-05-07 Enza Zaden, De Enkhuizer Zaadhandel B.V. A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nakano Masaru et al.Plant regeneration from protoplasts of Gentiana by embedding protoplasts in gellan gum.《Plant Cell,Tissue and Organ Culture》.1995,第41卷221-227. *
Nishio Takeshi et al.Simple and efficient protoplast culture procedure of lettuce，Lactuca sativa L.《Japan J Breed》.1998,第38卷165-171. *
Varotto S et al.Production of asymmetric somatic hybrid plants between cichorium intybus L and Helianthus annuus L.《Theor Appl Genet》.2001,第102卷(第6/7期),950-956. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101106932B1 (ko) 2012-01-25
CN101522896A (zh) 2009-09-02
JPWO2007049730A1 (ja) 2009-04-30
EP1950290A4 (en) 2010-03-03
US20100077499A1 (en) 2010-03-25
ES2547068T3 (es) 2015-10-01
US8058505B2 (en) 2011-11-15
JP4139429B2 (ja) 2008-08-27
AU2006307069A1 (en) 2007-05-03
BRPI0618023A2 (pt) 2011-08-16
EP2944692A1 (en) 2015-11-18
EP1950290B1 (en) 2015-07-22
WO2007049730A1 (ja) 2007-05-03
EP1950290A1 (en) 2008-07-30
AU2006307069C1 (en) 2011-04-07
EG26029A (en) 2012-12-12
AU2006307069B2 (en) 2010-11-18
KR20080063418A (ko) 2008-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101522896B (zh) 莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法
Plazas et al. Interspecific hybridization between eggplant and wild relatives from different genepools
Marasek-Ciolakowska et al. Breeding of lilies and tulips—Interspecific hybridization and genetic background—
Kouassi et al. Development of backcross generations and new interspecific hybrid combinations for introgression breeding in eggplant (Solanum melongena)
Zhao et al. Mapping quantitative trait loci for heat tolerance at anthesis in rice using chromosomal segment substitution lines
CN111432630A (zh) Tbrfv抗性番茄植物
Picó et al. Widening the genetic basis of virus resistance in tomato
CN111356361A (zh) 抗cgmmv西瓜属植物
Podwyszynska et al. Nuclear DNA content and ploidy level of apple cultivars including Polish ones in relation to some morphological traits
CN113993373B (zh) 生长性被改良的细胞质雄性不育芜菁植物
US6750376B1 (en) Methods for producing apomictic plants
Kumar Breeding of horticultural crops: principles and practices
KR100504172B1 (ko) 종간 교잡에 의한 잡종 고추의 육종 방법
Van der Valk et al. Pre-and post-fertilization barriers to backcrossing the interspecific hybrid between Allium fistulosum L. and A. cepa L. with A. cepa
CN109566399A (zh) 一种s单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和系的方法
CN106069721A (zh) 油菜双单倍体诱导系选育白菜型油菜品种及材料的方法
Sarma et al. In Vitro Techniques in Plant Breeding
Usman et al. Lime breeding: a way forward
WO2020213727A1 (ja) 低温生長性が改良された細胞質雄性不稔Ｌａｃｔｕｃａ属植物
US11672216B2 (en) Methods for promoting production of viable seeds from apomictic guayule plants
Jedidi et al. Efficient haploid production on ‘Wilking’mandarin by induced gynogenesis
Vaughan The impacts of conservation of rice genetic resources
CN116648134A (zh) 细胞质雄性不育碧冬茄属植物、其属间杂交植物、及其制造方法
Fukai Male sterile pentaploid Dendranthema yoshinaganthum'Lapin'

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant