NL1003239C2 - Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. - Google Patents
Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. Download PDFInfo
- Publication number
- NL1003239C2 NL1003239C2 NL1003239A NL1003239A NL1003239C2 NL 1003239 C2 NL1003239 C2 NL 1003239C2 NL 1003239 A NL1003239 A NL 1003239A NL 1003239 A NL1003239 A NL 1003239A NL 1003239 C2 NL1003239 C2 NL 1003239C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- oleracea
- plant
- var
- convar
- alef
- Prior art date
Links
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 title claims abstract description 48
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims abstract description 10
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 6
- 241001249699 Capitata Species 0.000 claims description 8
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 claims description 7
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000017163 Acephala Species 0.000 claims description 4
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims description 4
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 claims description 4
- VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N monobenzone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000281940 Brassica oleracea var. costata Species 0.000 claims description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000000133 Brassica oleracea var costata Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 claims description 2
- 244000304217 Brassica oleracea var. gongylodes Species 0.000 claims description 2
- 241001332183 Brassica oleracea var. sabauda Species 0.000 claims description 2
- 235000004214 Brassica oleracea var. sabauda Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 4
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019093 NaOCl Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 1
- 235000019057 Raphanus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000011380 Raphanus sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000035601 cold sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 230000007103 stamina Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i
CYTOPLASMATISCH MANNELIJK STERIELE BRASSICA OLERACEA PLANT, ALSMEDE WERKWIJZE VOOR HET VERKRIJGEN VAN EEN DERGELIJKE PLANT
5 De uitvinding heeft betrekking op een cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant overeenkomstig de hoofdconclusie, dat wil zeggen op de ontwikkeling van nieuwe ouderlijnen van een dergelijke plant. De uitvinding heeft voorts betrekking op een werkwijze om de eerderge-10 noemde cytoplasmatisch mannelijk steriele plant te verkrijgen, alsmede op hybride zaad verkregen uit de nieuwe ouderlijnen.
Brassica gewassen worden al enkele eeuwen gebruikt als 15 voedselgewassen , terwijl de zaadinhoud daarvan als basis fungeert van diverse voedselprodukten (spijsolie, mosterd etcetera).
Sinds 1970 worden verschillende Brassica groentesoorten in 20 de vorm van hybride zaden verkocht. Dergelijke zaden leiden tot hybride Brassica planten die als kruisingsprodukt van twee sterk ingeteelde ouderlijnen de erfelijke eigenschappen daarvan in zich verenigen. Indien één of beide ouderlijn(en) (gedeeltelijk) zelfbestuivend is/zijn, dienen 25 maatregelen te worden genomen om zeifbestuiving tegen te gaan, teneinde zuiver hybride Brassica planten te verkrijgen. Eén anti-zelfbestuivingsmaatregel maakt gebruik van zogenaamde zelf-incompatibiliteit van één of beide ouderlijnen. Daarbij wordt voorkomen dat fertiele stuif-30 meelkorrels in staat zijn te groeien in de stempel van specifieke planten, waaronder de stempel van de stuifmeel-korrels producerende Brassica plant zelf. Een bezwaar van deze methodiek is dat in sommige gevallen toch zelfbestui-ving optreedt. Dit resulteert in zaadpartijen met een te 35 hoog percentage inteelt. Een andere maatregel om zelfbe- 1003239 2 stuiving van één van beide ouderlijnen te voorkomen, gaat uit van het gebruik van cytoplasmatisch mannelijke steriliteit (CMS). In radijs (Raphanus sativus) is namelijk een cytoplasma gevonden dat mannelijke steriliteit 5 verleent, welk cytoplasma ook wel bekend staat als Ogura CMS cytoplasma. Via protoplasten fusie worden mitochondriën van het Ogura CMS cytoplasma geïntroduceerd in Brassica oleracea planten, waarbij de kern afkomstig is van normaal vruchtbare B. oleracea planten. Aldus worden CMS 10 oleracea planten verkregen. De in het Ogura CMS cytoplasma aanwezige chloroplasten met DNA verantwoordelijk voor koudegevoeligheid van planten met dit cytoplasma zijn door middel van de uitgevoerde fusies verwijderd.
15 Het is het doel van de uitvinding een cytoplasmatisch mannelijk steriele B. oleracea plant te verkrijgen, waarbij de eerdergenoemde bezwaren volgens de stand van de techniek worden ondervangen en waarbij een alternatief wordt geboden voor het Ogura CMS cytoplasma, en daartoe is het cytoplasma 20 van deze plant middels protoplasten fusie voorzien van mitochondriën met DNA dat althans gedeeltelijk afkomstig is van een Brassica napus plant en dat is gekoppeld aan (de eigenschap van) cytoplasmatisch mannelijke steriliteit, dat wil zeggen verantwoordelijk is voor cytoplasmatisch 25 mannelijke steriliteit bij de B. oleracea plant. Uit uitvoerig onderzoek is verrassenderwijs gebleken dat, ondanks het feit dat B. napus planten normaal fertiel zijn, middels protoplasten fusie op efficiënte wijze cytoplasmatisch mannelijke steriliteit in een B. oleracea plant kan 30 worden gecreëerd door gebruik te maken van geschikt mitochondriaal DNA van een B. napus plant. De eerdergenoemde protoplasten fusie wordt bij voorkeur uitgevoerd met enerzijds bladprotoplasten van de B. napus plant (donor) en anderzijds hypocotyl protoplasten van de B. oleracea plant 35 (acceptor).
1003239 3
In een voorkeursuitvoeringsvorm overeenkomstig de uitvinding is het cytoplasms van de B. oleracea plant voorts voorzien van voor deze plant normaal, soorteigen kernge-5 noom. Hierdoor is sprake van een 100% raszuiver produkt.
In een volgende voorkeursuitvoeringsvorm volgens de uitvinding zijn de cellen voorzien van voor B. napus normaal, soorteigen mitochondriën.
10
In een volgende voorkeursuitvoeringsvorm overeenkomstig de uitvinding zijn de soorteigen mitochondriën geïntroduceerd middels somatische hybridisatie. Bij celfusie blijft de kern gecodeerde genetische samenstelling van een plant 15 welke het cytoplasma ontvangt (bij voorkeur in zijn geheel) onaangetast. Een terugkruisingsprogramma is derhalve niet nodig, daar het cytoplasma in één keer van het gewenste type is. In de praktijk blijken uit protoplasten fusie ontstane B. oleracea planten veelal tetraploid of aneuploïd 20 te zijn. Ploïdie niveaus kunnen hierbij oplopen tot meer dan 10 maal C, waarbij C voor haploid genoom staat. Planten met een niet diploid genoom worden gekarakteriseerd door een afwijkende groei en door een mannelijke en vrouwelijke steriliteit. Gebruik makend van flowcytometrie worden alle 25 niet zuiver diploïde planten uit een populatie via fusie gegenereerde B. oleracea planten verwijderd. De resulterende diploide planten worden onderworpen aan een moleculaire analyse; door middel van deze analyse wordt vastgesteld welke van de planten mitochondriaal DNA (of een fragment 30 daarvan) bezitten waarvan bekend is dat dit genetisch nauw gekoppeld is aan CMS.
In een volgende voorkeursuitvoeringsvorm volgens de uitvinding is de B. oleracea plant gekozen uit de groep 35 1003239 4 bloemkool (B. oleracea L. convar. botrvtis (L.) Alef. var. botrytis L.), broccoli fB. oleracea L. convar. botrvtis (L.) Alef. var. cymosa Duch.), 5 - Romanesco (B. oleracea L. convar. botrvtis (L.) Alef.
var. botrytis L.), spruitkool (B. oleracea L. convar. oleracea var. gemnifera DC.), witte kool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. 10 var. alba DC.), spitskool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var . alba DC.), rode kool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. rubra DC.), 15 - savooie kool lB. oleracea L. convar. capitata (L.)
Alef. var. sabauda L.), koolrabi (B. oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. aonayloides), boerenkool (B. oleracea L. convar. acephala (DC.) 20 Alef. var. sabellica L.),
Portugese kool fB. oleracea var. tronchuda syn. costata).
De uitvinding heeft tevens betrekking op zaden of plantede-25 len afkomstig van de plant volgens de uitvinding.
Voorts heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze als beschreven in de hieronder staande voorbeelden.
30 Zaden van zowel een B. napus (donor) als een B. oleracea plant (acceptor) worden gesteriliseerd en gekiemd op MS30 of een soortgelijk medium; voor de donor gebeurt dit in licht, planten worden aangehouden door topjes af te snijden en op vers medium te plaatsen. Zaden van de acceptor kiemen 35 in donker; van de ontstane geëtioleerde plantjes wordt het 1003239 5 hypocotyl gebruikt. Protoplasten worden geïsoleerd door blad- respectievelijk hypocotylmateriaal na preplasmolyse te behandelen met celwandoplossende enzymen als pectinase en cellulase; dit gebeurt in een plasmolyserende oplossing.
5 Na filtratie en centrifugatie worden de protoplasten van de donor bestraald met gamma straling. De protoplasten van de acceptor worden behandeld met IOA waarna beide soorten protoplasten worden gefuseerd. Bij deze fusie dient PEG als agens om agglutinatie te bevorderen; een hoge pH tijdens 10 fusie is essentieel. Tijdens de fusie worden de protoplasten niet beroerd om het versmeltingsproces niet te verstoren. Na de fusie wordt de PEG oplossing weggewassen en vervangen door regeneratiemedium. Regeneratie van de protoplasten vindt plaats in dit medium, waarin de 15 aanwezigheid van suikers als sucrose en hormonen als 2,4D, BA en NAA en dergelijke doorslaggevend zijn. Gedurende de regeneratie wordt de osmotische waarde van het regeneratiemedium stapsgewijs verlaagd door medium toe te voegen met een afnemende concentratie sucrose. Ontstane microcalli 20 worden overgebracht op vast regeneratiemedium. Iedere twee weken worden de calli op vers regeneratiemedium gebracht. Ontstane scheutjes worden geplaatst op bewortelingsmedium, waarin wortelvorming wordt bevorderd door een phytohormoon als IAA. Geregenereerde planten worden onderzocht op hun 25 ploïdieniveau door een bladmonster te nemen en met een flowcytometer de relatieve DNA inhoud van de kernen vast te stellen. Planten welke het zuiver diploide genoom bevatten worden aangehouden, de overige planten worden vernietigd.
De overgebleven planten worden verder geanalyseerd met 30 behulp van moleculaire technieken. Gebruikmakend van DNA geïsoleerd uit blad wordt met behulp van een probe specifiek voor het mitochondriaal DNA onderzocht of de juiste mitochondriën in de planten aanwezig zijn. Planten met het cytoplasma van de acceptor (te beschouwen als 35 ontsnappers) worden vernietigd. De overgebleven planten 1003239 6 worden door middel van kruising vermeerderd en onder kasen veldcondities onderzocht op hun bruikbaarheid. Hierbij wordt onder andere gelet op steriliteit, zaadzetting en kwaliteit van de plant.
5
De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van hier onder besproken voorbeelden, die alle voorkeursvarian-ten volgens de uitvinding vormen.
10 Voorbeeld 1. Oppervlakte sterilisatie van zaad.
Zaden van kool (B. oleraceai worden in een filtreerpapier gevouwen en dit wordt 10 seconden ondergedompeld in een mengsel bestaande uit 70 % ethanol/30 % water; daarna volgt 15 een onderdompeling in steriel water van 55°C gedurende 5 minuten. Na deze behandeling volgt een behandeling met 0,3 % (w/v) NaOCl + Tween80 gedurende 20 minuten; deze behandeling vindt plaats in een laminair flowkast.
20 Na deze behandeling wordt het zaadpakketje 3 maal gespoeld met steriel water, gedurende respectievelijk 5, 5 en 10 minuten.
Voorbeeld 2. Uitzaaien van het uitgangsmateriaal voor 25 hypocotyl protoplasten.
Na een laatste spoeling wordt het zaadpakketje geopend en worden op ^MS15 medium in een container geplaatst. De containers worden bij 25 °C in het donker weggezet. Na ± 7 30 dagen zijn de hypocotylen bruikbaar voor protoplastisola-tie.
Voorbeeld 3. Uitzaaien van het uitgangsmateriaal voor blad protoplasten.
1003239 7
De gesteriliseerde zaden worden uitgezaaid als in voorbeeld 2. De containers worden bij 25°C in het licht weggezet. Na 14 tot 28 dagen zijn de plantblaadjes bruikbaar voor protoplastisolatie; topjes van de plantjes worden op vers 5 BB geplaatst; de containers worden bij 25°C in het licht weggezet. Het volgroeide blad wordt voor protoplastisola-ties gebruikt.
Voorbeeld 4. Protoplast isolatie.
10
Het blad- en hypocotylmateriaal wordt in glazen petrischalen (e 11 cm) of petrischalen van TC-kwaliteit (e 9 cm) met daarin een bodempje (12 ml) plasmolyse-oplossing fijn gesneden. Na het snijden wordt hieraan 12 ml plasmolyse-15 oplossing toegevoegd.
De petrischalen worden in aluminiumfolie ingepakt en blijven gedurende minstens één uur in een iaminair flowkast staan.
20
Na dit uur wordt de plasmolyse oplossing vervangen door ± 24 ml verse enzymoplossing.
Het geheel wordt in aluminiumfolie overnacht weggezet bij 25 25°C; het enzymmengsel voor het verkrijgen van de hypocotylprotoplasten op een schudder, maar die voor de bladprotoplasten niet! Deze schudder wordt ingesteld op 30 rpm., de amplitude van de schudbeweging is 15 mm.
30 Na de incubatie wordt de suspensies gefiltreerd over een teflon filterhouder met twee nylon filters van respectievelijk 110 pm en 53 pm. De filters worden nagespoeld met 1/3 volume CPW16 (± 8 ml).
1003239 8
De suspensies worden gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 110 x g) .
De ontstane bandjes, met daarin de protoplasten, worden 5 opgezogen met een steriele Pasteurpipet en overgebracht in een nieuwe centrifugebuis. Hierna worden de protoplastensuspensies, na voorzichtig met ± 9 ml W5 aangevuld te zijn, gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 75 x g.
10 De bladprotoplasten worden als volgt verder behandeld: het supernatant van de verschillende centrifugebuizen wordt afgegoten en de pellets worden voorzichtig geresuspendeerd in 1-2 ml W5. De inhoud van de verschillende centrifugebui-zen wordt samengevoegd en tot 10 ml aangevuld met W5.
15
Het centrifugebuisje met de protoplasten (donor) wordt afgesloten met Parafilm, omwikkeld met aluminiumfolie en overgebracht op ijs tot bestraling plaatsvindt met 50 kRad.
20 De hypocotylprotoplasten worden op de volgende manier verder behandeld: het supernatant van de verschillende centrifugebuizen wordt afgegoten en de pellets worden voorzichtig geresuspendeerd in 1-2 ml W5 + 2 mM IOA (40C) . De inhoud van de verschillende centrifugebuizen wordt 25 samengevoegd, tot 10 ml aangevuld met W5 + 2 mM IOA en gedurende 10 minuten in de koelkast bij 4°C geincubeerd.
Hierna wordt de suspensie 5 minuten gecentrifugeerd bij 75 x g (de totale incubatietijd in de IOA is dus 15 minuten) . 30
Het pellet wordt geresuspendeerd in 1-2 ml W5 en de suspensie wordt, aangevuld met W5 tot 10 ml, overgebracht in een steriel flesje van 50 ml. Dit flesje wordt, in aluminiumfolie gehuld, gedurende de tijd dat de protoplas-35 ten bestraald worden op een schudder (± 30 r.p.m./ 1003239 9 amplitude 15 mm) bij 25 °C geincubeerd. Hierna wordt de inhoud van het flesje overgebracht naar een centrifugebuis.
Beide buizen met zowel de blad- als hypocotylprotoplasten 5 worden 5 minuten gecentrifugeerd bij 75 x g, waarna het pellet wordt geresuspendeerd in 1-3 ml W5.
Met behulp van de haemocytometer wordt de dichtheid van beide protoplastensuspensies bepaald.
10
Voorbeeld 5. Protoplastfusie.
Van beide suspensies worden de protoplasten in een dichtheid van 9.10 protoplasten/ml samengevoegd voor de 15 fusie.
Met behulp van een microliterpipet worden 40 pl druppels in een petrischaal geplaatst: 20 11 druppels van 40 μΐ in een petrischaal van c 6 cm of 25 druppels van 40 μΐ in een petrischaal van 0 9 cm
Het deksel wordt op het petrischaaltje geplaatst, waarna het licht wordt uitgeschakeld en de laminair flowkast 25 gedurende 15 minuten uitgezet, zodat de protoplasten zich kunnen vasthechten aan de petrischaalbodem.
De laminair flowkast wordt weer aangezet en aan elke druppel met protoplasten wordt voorzichtig 60 μΐ PEG-30 oplossing toegevoegd.
Na 3-5 minuten wordt aan de petrischalen SV I toegevoegd: 4 ml in een petrischaal van 0 6 cm 1003239 10 9 ml in een petrischaal van 0 9 cm
Na 3-5 minuten wordt de oplossing afgezogen en SV II toegevoegd : 4 ml in een petrischaal van 0 6 cm 5 9 ml in een petrischaal van 0 9 cm
Na 3-5 minuten wordt de oplossing afgezogen en voorzichtig 8p toegevoegd: 4 ml in een petrischaal van 0 6 cm 10 9 ml in een petrischaal van 0 9 cm
Het is belangrijk dat het 8p medium voorzichtig wordt toegevoegd, omdat de protoplasten anders te vroeg van de bodem van het petrischaaltje los komen.
15 Na 3-5 minuten wordt het 8p medium afgezogen en nieuw 8p medium toegevoegd. Nu mogen de protoplasten van de petri-schaalbodem los komen: 4 ml in een petrischaal van 0 6 cm 9 ml in een petrischaal van 0 9 cm 20 De petrischalen worden met Parafilm afgesloten en bij een lichtintensiteit van ± 500 lux weggezet.
Voorbeeld 6. Regeneratie 25 Op de achtste dag na fusie wordt aan de petrischalen 8pA toegevoegd tot 3x het oorspronkelijke volume, dat wil zeggen: 8 ml aan een petrischaal van 0 6 cm 18 ml aan een petrischaal van 0 9 cm 30 De petrischalen worden in het licht geplaatst.
Op de vijftiende dag na de fusie worden de microcalli die in de fusieschalen aan de bodem zijn vastgehecht met de vlakke kant van een gesteriliseerde spatel voorzichtig afgeschraapt. De inhoud van de petrischaal wordt met behulp 1003239 11 van een 10 ml pipet verdeeld over vier centrifugebuizen en gedurende 5 minuten bij 75 x 3 gecentrifugeerd. In de vier nieuwe petrischalen wordt ondertussen 6 ml K-.PPS-V medium gepipetteerd. Na het centrifugeren wordt het supernatant 5 afgegoten en wordt aan het pellet 6 ml K3PPS-V toegevoegd. Het pellet bestaat uit delende cellen en microcalli en is zeer eenvoudig te resuspenderen in het K;,PPS-V medium. Met behulp van een 10 ml pipet wordt het medium en het pellet opgezogen en in de gereedstaande petrischalen gepipetteerd. 10 Vanaf dag 21 na fusie worden de gevormde microcalli vanuit het K;,PPS-V medium overgeënt op K-.PPS-R medium.
De groeiende (micro) calli worden elke 2 weken op vers K-.PPS-R medium overgezet.
15 Zodra de calli scheutvorming vertonen, worden ze overgezet in containers met K3PPS-R medium. Zodra de scheuten groot genoeg zijn, worden deze geoogst en op bewortelingsmedium (BB medium) overgezet.
20 Voorbeeld 7. Flowcytometrische bepalingen
Van een te analyseren plant wordt een bladmonster van ongeveer 1 cirr genomen en overgebracht in 2 ml DAPI oplossing. Met een scherp scheermes wordt dit blad fijngesneden 25 en gefiltreerd door een 15 pm filter. Het monster wordt gemeten met een Partec CA-II cell analyzer volgens de methode van De Laat £t al. De relatieve DNA-inhoud van de planten is bepaald door de piek-posities van de fusieplan-ten te vergelijken met die van diploide planten.
30
Voorbeeld 8. Moleculaire bepalingen B. oleracea planten met cytoplasmatisch mannelijke steriliteit verkregen door middel van somatische hybridisatie, 1003239 12 worden onderscheiden van B. oleracea planten met ander cytoplasms (andere koolsoorten inclusief die met ogura cytoplasma) met behulp van een DNA probe. Deze probe bestaat uit een mitochondriaal B. napus DNA fragment geiso-5 leerd uit B. oleracea planten met het steriele fenotype en na digestie met EcoRI gekloneerd in Escherichia coli. De band wordt gekenmerkt door het feit dat zij weer uit het E. coli plasmide DNA te knippen is met EcoRI en op een kenmerkende manier hybridiseert met mitochondriaal DNA van EL_ 10 oleracea (zie figuur).
Van te analyseren planten wordt 200 milligram blad verzameld in een reageerbuisje en met vloeibare stikstof bevroren. Hieraan wordt 750 μΐ extractiebuffer toegevoegd en met 15 een Potterstaaf gehomogeniseerd. Het monster wordt 10 minuten bij 13000 x g gecentrifugeerd en het supernatant inclusief het groene materiaal voorzichtig afgegoten. Aan het pellet wordt 125 μΐ extractiebuffer toegevoegd, na resuspenderen wordt 135 μΐ lysisbuffer en 60 μΐ laurylsar-20 cosine oplossing toegevoegd. Na kort mengen wordt het mengsel wordt gedurende 20 minuten tot 65°C verwarmd. Voeg 375 μΐ chloroform/isoamylalcohol toe en schud de reactie-vaatjes minimaal 40 maal. Centrifugeer 10 minuten bij 13000 x g; breng de bovenfractie over naar een nieuw reactievaat-25 je, en herhaal de CHC13/IAA stap zonodig een keer. Voeg tenslotte 500 μΐ isopropanol toe en schud de reactievaatjes enkele malen. Centrifugatie volgt gedurende 5 minuten bij 13000 x g. Het pellet wordt geresuspendeerd in 500 μΐ TE buffer.
30
Digestie van DNA met restrictie-endonucleasen wordt als volgt uitgevoerd: voor RFLP analyse is ongeveer 4 pg DNA nodig. Het uiteindelijke mengsel waarin restrictie plaatsvindt bestaat uit 0,1 volume universele knip-buffer als 35 One-Phor-All Buffer PLUS (Pharmacia), 4 pg DNA, 4mM spermi- 1003239 13 dine en 2 units restrictieenzym. Incubatie vindt plaats bij 37°C gedurende minimaal 3 uur.
De reactie wordt gestopt door vanuit een stock-oplossing de 5 EDTA concentratie op 10 mM te brengen. Het DNA wordt geprecipiteerd door 0,1 volume 3 M NaAc en 2,5 volume ethanol van -20°C toe te voegen. Het mengsel wordt 2 uur op -20°C gehouden; na centrifugatie gedurende 10 minuten bij 10000 x g. wordt het pellet gewassen met ijskoude 70 % 10 ethanol/water, gedroogd en in TE buffer opgelost.
Agarose gel electroforese van de te scheiden DNA fragmenten vindt op de volgende manier plaats: 2 gram agarose wordt afgewogen en opgekookt in 250 ml TAE buffer. Na afkoelen 15 tot handwarm wordt ethidiumbromide toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5 mg/1. De gei wordt gegoten en afgekoeld tot ze gestold is. De monsters worden in loading-buffer opgebracht en DNA fragmenten worden gescheiden. De elektroforese wordt beëindigd wanneer de frontmarker BFB 20 het einde van de gel tot op ongeveer een centimeter is genaderd.
Ter voorbereiding op blotting wordt de gel als volgt behandeld: 25 5 minuten in 0,25 M HC1 2 maal 15 minuten in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl 2 maal 10 minuten 1 M NH4Ac/20 mM NaOH.
Een Hybond N membraan (Amersham) wordt op dezelfde grootte als de gel gesneden en bevochtigd door deze enkel seconden 30 in 2xSSC te leggen en daarna in 1 M NH4Ac/20 mM NaOH. Verder worden 3 stukken Whatman 3MM filtreerpapier op deze grootte gesneden. Er wordt een opstelling gemaakt waarin gedurende minstens 4 uur door middel van vloeistoftransport het DNA vanuit de gel wordt overgedragen op het membraan. De trans-35 fer vindt plaats in 1 M NH4Ac/20 mM NaOH. Na droging van het 1003239 14 membraan wordt het DNA gebonden door bestraling met UV licht gedurende 1 minuut aan elke zijde van het membraan.
De benodigde DNA probe wordt als volgt gelabeld: de overge-5 brachte DNA wordt gedenatureerd door verhitting gedurende 10 minuten tot 95°C en snelle afkoeling op ijs. In een reactievaatje worden bijeengebracht:
10 ng - 3 pg DNA
2 μΐ hexanucleotidemix 10 2 μΐ dNTP's (met digoxigenine - dUTP) 1 μΐ Klenow polymerase
Na menging volgt overnacht incubatie bij 37°C. DNA wordt geprecipiteerd door toevoegen van 2 μΐ 3 M NaAc en 44 μΐ 15 ethanol (96 %). Plaats het geheel gedurende 30 minuten bij - 20°C. Centrifugeer 15 minuten bij 10000 x g , was het pellet met 70 % ethanol in water (v/v) en los het gedroogde pellet op in 50 μΐ TE.
20 Hybridisatie van de gelabelde fragmenten aan de membraan: de membraan wordt enkele seconden in 2xSSC gelegd. Het membraan wordt hierna in een zakje met 20 ml prehybridisa-tiemix geseald. Gedurende minstens 1 uur wordt het membraan gelncubeerd bij een temperatuur van 60 - 65°C. De prehybri-25 disatiemix wordt verwijderd en vervangen door 4 ml hybridi-satiemix en overnacht gerncubeerd. Na incubatie wordt de membraan gewassen: 4x2 minuten in wasoplossing 1; 4x2 minuten in wasoplossing 2 en 2 x 15 minuten in wasoplossing 3 (bij 60 - 65°C) .
30
Detectie van de gelabelde banden gebeurt bij kamertemperatuur: de blot wordt in spoelbuffer 1 gespoeld en daarna met 10 ml spoelbuffer 2 per 100 cm: membraan geseald. Na 30 minuten incubatie op een schudapparaat wordt spoelbuffer 2 35 vervangen door 15 ml anti-dig oplossing per 100 cm' mem- 1003239 15 braan. Na incubatie gedurende 30 minuten op een schudappa-raat wordt de membraan gewassen: 2 a 3 x 10 minuten in spoelbuffer 2; 3 a 4 x 10 minuten in spoelbuffer 1 en 1 maal in spoelbuffer 3. Het membraan wordt met 10 ml AMPPD 5 oplossing per 100 cm- membraan geincubeerd gedurende 20 minuten. Het membraan wordt in een cassette gelegd met een Polaroid film erop; de film wordt na voldoende belichting verwijderd en ontwikkeld.
10 Voorbeeld 9. Beschrijving bloemfenotype cytoplasmatisch mannelijk steriele B. oleracea met mitochondriën afkomstig van Brassica napus
Bloeiwijze: hoofdas van de tros naar de top toe soms ver-15 kort of tot bundels vergroeid; vaak vertakt. Schutblaadjes zelden aanwezig, soms draaiend en opgerold. Bloemsteeltjes soms verkort of tot bundels vergroeid.
Bloemknop: vaak gesloten, soms open, waarbij de randen van 20 de kelkbladen elkaar niet raken en ingevouwen zijn. Het oppervlak is glad tot gebobbeld; de top is meestal ingerold, soms spits. De stamper groeit vaak boven de top uit.
25 Bloem: kelkbladen 1-4 mm breed, 4-12 mm lang, rechtopstaand, vaak zwak draaiend, randen soms ingebogen, top gebogen naar de binnenzijde. Honingklieren aanwezig. Kroon-bladen 4, soms tot een veelvoud hiervan, tot wel 40; 4-7 mm breed, 11-19 mm lang. Bij een veelvoud van 4 zijn de bin-30 nenste kroonbladen vaak zeer veel korter. Nagel kan schijnbaar tot een buis vergroeid zijn. Plaat overwegend niet teruggebogen, vaak zijdelings sterk opgerold, soms sterk draaiend. Kleur bovenzijde wit of geel RHS 2A-3A-2C-3C-4A-5A-5B-6A, onderzijde wit of geel RHS 2A-2B-2C-3A-3C-4B-4C- 1003239 16 4A, rand van de top veelal gaaf, soms getand. Meeldraden 6, tot 2, en dan soms 2 aan 2 vergroeid, lengte tot halverwege het kelkblad, soms even lang als kelkblad. Helmhokjes klein en driehoekig. Stuifmeel ontbrekend. Stamper 1, soms tot 3 5 waarvan dan één langer dan de andere; overwegend recht, zonder bestuiving vaak uitgroeiend tot circa 30 mm. Snavel met stempel soms krom, soms iets opgezwollen. Vruchtbeginsel vaak draaiend en opgerold.
10 Bloem in de top van de tros soms vrijwel zonder kelk-, kroonbladen en meeldraden en met sterk draaiende en opgerolde vruchtbeginsels, of schijnbaar met elkaar vergroeide vruchtbeginsels; langs een vergroeiingsnaad opengespleten; op blad op schutblad lijkend, met parallelle nervatuur.
1003239
^ S © © 21 . <v-> ,©©©©£} X — 3 Ό ^ O 'C
CO ~ rj ιτί o· ; ! rs : ! — — — O O 'v — . ιλι ^y r**i © 0 Ξ ® ö — <n 1 ’ — ’ööö'n — ^ e ^ ö n o t 2^9228 ; : jq : ; £ 2 2 g 3 9 :: ? 2 3 2 g 2 ® ^ Ó — <N ‘ — 1 ’ ó O O Ό ^ Ö^ÖfNÓTt •Π _ “Qf^O^O, , ίΛ . ,©©©©£; <> — ΑΌ^ΟΟ
9 _j — r- u*> ; ! o ! 1---00^. — 'rw^^mO
^ α — ö ö — 'ö' ' 000^--¾ c^orsioTf <S®'0'^eo <n , , £ί © £ «'•j c£ vC OO^rsj r-°°*y — CSO^J- ! r-j | ? . — . ^ O — v-iao'® — oc * r- c — TT ‘ - ' 1 °g © $ ^' — d d C Tt' ^ oc .So'O'^oc v-, K © £ r-4 £2 ^ — >c Ό C'
® * h Ó - ‘ — ' ’ © £ ττ - d d O TT ^ OC
0£ «P^osg , ,2E«o£g3S - , « * S 2 ££r-;d-^ · 1 ' - - °p © £ d - d d 'orrSoc > I LÓ £ r~, © — © , , , 2 z: £ © — Ξ £ — , 'O £ 2 ^ r-1 o. . — — o © ! 1 : © © *v — . © © o· — Iwioc'r —
ιλ {Γ· r. © — © cr~r^c^©r-,^ _ c ΐ 5 (N
0«^. — — ©δ ! I ! C © ^! — ί © © ~ iwnoc^ — — ri''1- — §©5;d->e ©'©Tf^od (/) υ a; >.
._i C I > 5 © ; ; ', 1 ; ; ; 1 ; ; 1 j j ; > * CO % O ® CM_______________________
1—H
a> s u f ^ ' ' i ! 2 I ! ! i ! ί i i ! ! ! I I j ; ; ; O ? O D.
>_______________________ C ,,,.,, CU * ‘ · = 2 = ·........ :::::: O'_______________________
C
Ή 10 (/) J0!!90|;<^!;!2;Ei:; !!!!]; (Λ £ “ ' ' “ ' ' ° ' ' ' 6 ' 0........
O
rH “ " cx 0 § ~ f 1 „£f 1 ! I ! ! ΐ 1 ! 1 £ § t i * f j £ H ö· ΐ f °· s;| I I I é = i
1 lil is 1 S I I 3 i3i I I 3 i ! I 1 I I
QJ iCZU-SUiiZiCZtluS^ZN U Μ E ö -S 'c
cq L 1 I I 1 I I I
Ln o in o un
Η Η ΓΊ CN
1003239 fS _ 05 ' * I * ' 1 ’!!!!!! ! ' r-|,r^°
® ! .............£ w-i 1 ' Ö NO
o fN
ΓΟ11ι,,,.,.1..ιι00·.·.ιιιιΓ'00 !!! · !!!!!!!!!! r-; !!!!!!!! o ^ 2 ^ 00 ·<·>>.. (— 00 j ! ! ! ! ! ! ί ! ! ! ! 1 ' ! ί ! ! ί 1 ! (^ V».
ï = SS3^SS£R5iPRP;gP!cS! : : : ί i i* °® — ^ r>| »Λ •Λ f""t — — — - ‘ ‘ ‘ 1 0£ £ : ί : ! ........ ! : c £ ; ; Ί : £ S : 9 a. ..........1 · <-j 1 o rs 1 c ^ P^> * CD >
Cl...............- — 1 d ^ 6 ’ ' 0 ’ ^ r^i * £.|l!!:!!::!!i!g£:5',:=!!!!* 6 ..............^ - ' 0 ^ 0 1 ‘ «
illllliilliiSjiiijjiijlIlJ
E * * · * 1 ί ’ * - ’ <~n » t < - · 4 » ί » » ί · s^, J2
Q
1» ΙΛ j* 0 ...........!r- "5 u a £1::::^::::::::::::::::::10 *.....« 1 · · ...............
Ό C
ϊ ί j : { ! ! ! ί ! ί ί i i E § ! ί ! ! ! ! ί ! t Ί & * 1 "w ê 1 ί 5 1 h ! Η ί ί ^ Μ ί 1 u ; u m ! I I 1 I 8 1 * ! i 1 i ! 1 g ϊ I D I ί ^ .1 s £ ! 9ο«3ουοο = £^Λβ^·τθ5ι^,3<5Ϊ3ί3 «9 g § 8 .3 grS g £ ü O g « 3>’®^:ίί< s Sfix z '3 «»3 a aid" Ex 5 S E 0 W K^ifSCOZ — n «I « a
LD O LD O LD
H H CN <N
1003239 ' 19
Overige oplossingen voor celbiologie: enzymoplossing:
5 1% (w/v) cellulase R-10 in K3PPS-I
0,1% (w/v) pectinase in K3PPS-I
pH = 5,6 PEG oplossing:
10 PEG1500 266.7 mM
glucose 300 mM CaCl;. 2H:0 50 mM pH = 7,0 15 SV I: 50 ml PEG oplossing + 100 ml Pre-plasmolyse oplossing SV II: 20 ml PEG oplossing + 100 ml Pre-plasmolyse oplossing 20 IOA (iodacetamide) 2 mM IOA in W:; pH=5,6 1% agarose oplossing in MilliQ water.
25
Oplossingen voor moleculaire biologie: extractiebuffer: 30 350 mM sorbitol
100 mM Tris-base 5 mM EDTA
vers toevoegen: 20 mM Na-bisulfiet lysisbuffer: 1003239 20
20 mM Tris-base 50 mM EDTA 2 M NaCl 2 % (w/v) CTAB
5 N-laurylsarcosine, Na zout: 10 % (w/v) chloroform/isoamylalcohol: 24:1 (v:v) isopropanol
TE: 10 mM Tris-HCl; pH 8,0 1 mM EDTA
10 4mM spermidine EDTA stockoplossing: 1 M 3 M NaAc ethanol 96 % 70 % ethanol/water v/v 15 ethidiumbromide oplossing: 10 mg/ml H20 TAE buffer: 4.84 gram Tris base / 1 1,14 ml ijsazijn 10 mM EDTA; pH 8,0 20 loadingbuffer:
24 % Ficoll 400 0,1 % SDS
0,1 % xylenecyanole 0,1 % broomfenolblauw 25 0,25 M HC1 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl 1M NH„Ac/20 mM NaOH 2xSSC: 30 mM Na-citraat.2H20; pH 7.2 30 300 mM NaCl
0,2 SSC: 10 x verdunde 2xSSC
0,lxSSC: 20 x verdunde 2xSSC
hexanucleotidemix: 10 x geconcentreerde hexanucleotidemix van Boehringer Mannheim 35 1003239 21 dNTP :
0,1 mM dATP 0,1 mM dCTP 0,1 mM dGTP 5 0,65 mM dTTP
0,35 mM digoxygenine-dUTP (Boehringer) blocking reagens: Boehringer Mannheim; art.nr 1175041 prehybridisatiemix: 75 mM Na-citraat 10 750 mM NaCl 0,5 % blocking reagens 0,1 % N-lauroylsarcosine (w/v) 0,2 % SDS hybridisatiemix: 15 75 mM Na-citraat 750 mM NaCl
0,5 % blocking reagens 0,1 % N-lauroylsarcosine 0,2 % SDS
20 40 - 50 ng digoxygenine-dUTP gelabelde probe/ml
wasoplossing 1: 2xSSC + 0,1 % (w/v) SDS
wasoplossing 2: 0,2xSSC + 0,1 % (w/v) SDS wasoplossing 3: 0,lxSSC + 0,1 % (w/v) SDS spoelbuf fer 1: 25 100 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl spoelbuffer 2: spoelbuffer 1 0,5 % blocking agens (vers maken) 30 spoelbuffer 3: spoelbuffer 1 50 mM MgCl:.
anti-dig-AP conjugaat: Boehringer Mannheim; art.nr 1175041 AMPPD oplossing: 10 μΐ AMPPD per ml spoelbuffer 3 (0.26 μΜ) 35 1003239 22
Gebruikte afkortingen: 2,4D: 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur AMPPD: disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2 ' - 5 tricyclo-[3.3.1.1'’ ]decan}-4-yl)phyenyl phosphate AP: zure fosfatase BA: 6-benzylaminopurine CMS: cytoplasmatische mannelijke steriliteit DIG: digoxygenine 10 dATP: desoxyadenosinetrifosfaat dCTP: desoxycytosinetrifosfaat dGTP: desoxyguaninetrifosfaat DNTP: desoxynucleotidetrifosfaat dTTP: desoxythyminetrifosfaat 15 DUTP: desoxyuracyltrifosfaat EDTA: ethyleendiaminetetraazij nzuur g_: versnelling van de zwaartekracht (9,8 m.sec":-) IOA: iodacetamide kRad: 1000 Rad, eenheid van ioniserende straling 20 pg : microgram μΐ: microliter mM: millimolair μΜ: micromolair M: molair 25 MS: Murashige & Skoog NAA: naftaleenazijnzuur PEG: polyethyleenglycol pH: maat voor zuurgraad rpm: toeren per minuut 30 SSC: saline sodium citrate SDS: sodiumdodecylsulphate TC: tissue culture UV: ultraviolet v/v: volume/volume 35 w/v: gewicht/volume 1003239 23
Bij vrijwel alle behandelingen is aan te geven binnen welke grenzen een pH, een concentratie e.d. moet zijn en wat de waarde is waarmee de experimenten in de praktijk gedaan worden. De drie waarden voor deze oplossingen/behandelingen 5 zijn hieronder gegeven: weefselkweekmedia: S15, MS30 en BB: suiker bijvoorbeeld sucrose; concentratie 0.5 - 600 mM, 10 normaal is 200 - 400 mM.
pH 5 - 10; normaal 5.5 - 6.0.
temperatuur opkweek: 22 - 27°C, normaal 25 cC. bestraling: 0-60 kRad; normaal 50 kRad.
15 fusietemperatuur: 20 - 25 °C; gebruikelijk 22cC
concentraties van plantenhormonen: 0-10 μΜ; normaal 0-3 μΜ.
1003239
Claims (7)
1. B. oleracea plant waarvan het cytoplasma middels protoplasten fusie is voorzien van mitochondriën met
2. B. oleracea plant volgens conclusie 1, waarvan cellen zijn voorzien van voor deze plant normaal, soorteigen kerngenoom. 15
3. B. oleracea plant volgens conclusie 1 of 2, waarvan cellen zijn voorzien van voor B. napus normaal, soorteigen mitochondriën.
4. B. oleracea plant volgens conclusie 3, waarbij de 20 soorteigen mitochondriën zijn geïntroduceerd middels somatische hybridisatie.
5 Alef. var. rubra DC.), savooie kool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. sabauda L.), koolrabi fB. oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. aonayloides). 10. boerenkool (B. oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. sabellica L.), Portugese kool (B. oleracea var. tronchuda syn. costata) .
5. B. oleracea plant volgens een der voorgaande conclusies 1 tot en met 4, gekozen uit de groep bestaande 25 uit: bloemkool (B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. botrytis L.), broccoli (B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.),
30. Romanesco (B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. botrytis L.), spruitkool (B. oleracea L. convar. oleracea var. aemnifera DC.), witte kool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) 1003239 Alef. var. alba DC.), spitskool (B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC.), rode kool fB. oleracea L. convar. capitata (L.)
5 DNA dat althans gedeeltelijk afkomstig is van een B. napus plant, en dat is gekoppeld aan (de eigenschap van) cytoplasmatisch mannelijke steriliteit (CMS)(i.e. verantwoordelijk is voor cytoplasmatisch mannelijke steriliteit bij de B. oleracea plant). 10
6. Zaden of plantedelen afkomstig van een B. oleracea plant volgens een der voorgaande conclusies 1 tot en met 5 .
7. Werkwijze als beschreven in de beschrijving en/of 20 voorbeelden. 1003239
Priority Applications (21)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1003239A NL1003239C2 (nl) | 1996-05-31 | 1996-05-31 | Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. |
| NZ314888A NZ314888A (en) | 1996-05-31 | 1997-05-23 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant and production thereof |
| HU9700948A HUP9700948A3 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-26 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant, and method for obtaining such plant |
| UA97052448A UA72420C2 (uk) | 1996-05-31 | 1997-05-27 | Рослина виду brassica oleracea з чоловічою стерильністю і спосіб її отримання |
| PL32021297A PL187820B1 (pl) | 1996-05-31 | 1997-05-27 | Komórka Brassica oleracea i sposób otrzymywania komórki Brassica oleracea |
| HR1003239A HRP970297A2 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-28 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant and method for obtaining such plant |
| CZ971639A CZ163997A3 (cs) | 1996-05-31 | 1997-05-28 | Rostlina B. oleracea a způsob její produkce |
| KR1019970021689A KR970073319A (ko) | 1996-05-31 | 1997-05-29 | 세포질 웅성 불임인 Brassica oleracea 식물 및 그것의 제조방법 |
| RU97108778A RU2142013C1 (ru) | 1996-05-31 | 1997-05-29 | Способ получения растения brassica oleracea |
| CNB971124175A CN1188027C (zh) | 1996-05-31 | 1997-05-29 | 细胞质雄性不育甘蓝植株和获得这种植株的方法 |
| MXPA/A/1997/004020A MXPA97004020A (en) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Plant brassica oleracea citoplasmica, male, sterile and method to obtain such pla |
| AU23715/97A AU717441B2 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Cytoplasmic male sterile Brassica Oleracea plant, and method for obtaining such plant |
| CA002206625A CA2206625A1 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant, and method for obtaining such plant |
| JP9142420A JPH1052185A (ja) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | 細胞原形質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法 |
| ES97201644T ES2231842T3 (es) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Planta brassica oleracea con esterilidad masculina citoplasmatica y. |
| EP97201644A EP0810284B1 (en) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plant and method for obtaining such plant |
| DE69732266T DE69732266T2 (de) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Brassica Oleracea Pflanze mit cytoplasmatischer männlicher Sterilität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| ZA9704824A ZA974824B (en) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant, and method for obtaining such plant. |
| US08/867,440 US5917128A (en) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant, and method for obtaining such plant |
| AT97201644T ATE287450T1 (de) | 1996-05-31 | 1997-06-02 | Brassica oleracea pflanze mit cytoplasmatischer männlicher sterilität und verfahren zu ihrer herstellung |
| TW086108056A TW404817B (en) | 1996-05-31 | 1997-06-11 | Method for obtaining cytoplasmic male sterile brassica oleracea plant |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1003239A NL1003239C2 (nl) | 1996-05-31 | 1996-05-31 | Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. |
| NL1003239 | 1996-05-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL1003239C2 true NL1003239C2 (nl) | 1997-12-03 |
Family
ID=19762946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1003239A NL1003239C2 (nl) | 1996-05-31 | 1996-05-31 | Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5917128A (nl) |
| EP (1) | EP0810284B1 (nl) |
| JP (1) | JPH1052185A (nl) |
| KR (1) | KR970073319A (nl) |
| CN (1) | CN1188027C (nl) |
| AT (1) | ATE287450T1 (nl) |
| AU (1) | AU717441B2 (nl) |
| CA (1) | CA2206625A1 (nl) |
| CZ (1) | CZ163997A3 (nl) |
| DE (1) | DE69732266T2 (nl) |
| ES (1) | ES2231842T3 (nl) |
| HR (1) | HRP970297A2 (nl) |
| HU (1) | HUP9700948A3 (nl) |
| NL (1) | NL1003239C2 (nl) |
| NZ (1) | NZ314888A (nl) |
| PL (1) | PL187820B1 (nl) |
| RU (1) | RU2142013C1 (nl) |
| TW (1) | TW404817B (nl) |
| UA (1) | UA72420C2 (nl) |
| ZA (1) | ZA974824B (nl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1096231C (zh) * | 1999-10-19 | 2002-12-18 | 武汉大学 | 水稻无花粉细胞质雄性不育系的选育方法 |
| EP1763991A1 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-21 | Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. | Red lettuce |
| KR101106932B1 (ko) | 2005-10-26 | 2012-01-25 | 가부시키가이샤 사카타노타네 | 세포질 잡종（ｃｙｂｒｉｄ） 왕고들빼기속 식물 및 그생산 방법 |
| CN101017152B (zh) * | 2007-02-09 | 2010-07-07 | 南京农业大学 | 一种甘蓝种子遗传纯度的快速鉴定方法 |
| WO2008123714A1 (en) * | 2007-04-06 | 2008-10-16 | Dongbu Hitek Co., Ltd. | A method for producing a hybrid seed using plant of novel cytoplasmic-genic male sterility raphanus sativus line and dna markers for selecting the plant of said raphanus sativus line |
| EP2060168A1 (en) | 2007-11-16 | 2009-05-20 | Syngenta Participations AG | Method for the production of pink colored cabbage |
| CN103734016B (zh) * | 2014-01-21 | 2016-06-08 | 南京农业大学 | 一种离体诱导同源四倍体青花菜的育种方法 |
| CN104160946B (zh) * | 2014-07-30 | 2017-01-11 | 镇江瑞繁农艺有限公司 | 一种松花菜胞质雄性不育系和保持系的育种方法 |
| MX2018004265A (es) * | 2015-10-06 | 2018-11-09 | Inst Basic Science | Metodo para producir plantas de genoma modificado a partir de protoplastos de planta a alta eficiencia. |
| CN106047860B (zh) * | 2016-06-03 | 2019-01-01 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种植物基因组dna提取方法 |
| CN108719062A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-11-02 | 广州禾立田生物科技有限公司 | 一种抱子甘蓝的组织培养快速繁殖方法 |
| CN113229148A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-08-10 | 南京新创蔬菜分子育种研究院有限公司 | 一种培养羽衣甘蓝游离小孢子获得再生植株的方法 |
| CN117363558A (zh) * | 2023-12-07 | 2024-01-09 | 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 | 一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255355A2 (en) * | 1986-07-30 | 1988-02-03 | Allelix Inc. | Haploid protoplast fusion |
| GB2211205A (en) * | 1987-12-17 | 1989-06-28 | Zaadunie Bv | Method for producing Brassica oleracea by protoplast fusion |
| JPH01218530A (ja) * | 1988-02-26 | 1989-08-31 | Mitsubishi Kasei Corp | 細胞質雑種植物の製造方法 |
| WO1992005251A1 (fr) * | 1990-09-21 | 1992-04-02 | Institut National De La Recherche Agronomique | Sequence d'adn conferant une sterilite male cytoplasmique, genome mitochondrial, genome nucleaire, mitochondrie et plante contenant cette sequence, et procede de preparation d'hybrides |
| NL9400518A (nl) * | 1993-07-14 | 1995-02-01 | Sakata Seed Corp | Werkwijzen voor het kweken en het zich doen voortplanten van mannelijke steriele planten. |
-
1996
- 1996-05-31 NL NL1003239A patent/NL1003239C2/nl not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-23 NZ NZ314888A patent/NZ314888A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-05-26 HU HU9700948A patent/HUP9700948A3/hu unknown
- 1997-05-27 PL PL32021297A patent/PL187820B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-05-27 UA UA97052448A patent/UA72420C2/uk unknown
- 1997-05-28 HR HR1003239A patent/HRP970297A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1997-05-28 CZ CZ971639A patent/CZ163997A3/cs unknown
- 1997-05-29 CN CNB971124175A patent/CN1188027C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-29 RU RU97108778A patent/RU2142013C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-05-29 KR KR1019970021689A patent/KR970073319A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-05-30 JP JP9142420A patent/JPH1052185A/ja active Pending
- 1997-05-30 AU AU23715/97A patent/AU717441B2/en not_active Ceased
- 1997-05-30 CA CA002206625A patent/CA2206625A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-02 AT AT97201644T patent/ATE287450T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-06-02 ES ES97201644T patent/ES2231842T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-02 US US08/867,440 patent/US5917128A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-02 ZA ZA9704824A patent/ZA974824B/xx unknown
- 1997-06-02 EP EP97201644A patent/EP0810284B1/en not_active Revoked
- 1997-06-02 DE DE69732266T patent/DE69732266T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 TW TW086108056A patent/TW404817B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255355A2 (en) * | 1986-07-30 | 1988-02-03 | Allelix Inc. | Haploid protoplast fusion |
| GB2211205A (en) * | 1987-12-17 | 1989-06-28 | Zaadunie Bv | Method for producing Brassica oleracea by protoplast fusion |
| JPH01218530A (ja) * | 1988-02-26 | 1989-08-31 | Mitsubishi Kasei Corp | 細胞質雑種植物の製造方法 |
| WO1992005251A1 (fr) * | 1990-09-21 | 1992-04-02 | Institut National De La Recherche Agronomique | Sequence d'adn conferant une sterilite male cytoplasmique, genome mitochondrial, genome nucleaire, mitochondrie et plante contenant cette sequence, et procede de preparation d'hybrides |
| NL9400518A (nl) * | 1993-07-14 | 1995-02-01 | Sakata Seed Corp | Werkwijzen voor het kweken en het zich doen voortplanten van mannelijke steriele planten. |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BARSBY T L ET AL: "THE TRANSFER OF CYTOPLASMIC MALE STERILITY TO WINTER-TYPE OILSEED RAPE (BRASSICA NAPUS L.) BY PROTOPLAST FUSION", PLANT SCIENCE, vol. 53, no. 3, 1 January 1987 (1987-01-01), pages 243 - 248, XP000564234 * |
| DATABASE WPI Section Ch Week 8941, Derwent World Patents Index; Class A97, AN 89-296558, XP002028244 * |
| EARLE E.D. ET AL: "Organelle assortment and mitochondrial DNA rearrangements in Brassica somatic hybrids and cybrids", PHYSIOLOGIA PLANTARUM, vol. 85, 1992, pages 325 - 333, XP002028271 * |
| KAO, H.M. ET AL: "Synthesis of Brassica oleracea / Brassica napus somatic hybrid plants with novel organelle DNA compositions", TAG, THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, no. 83, 1992, pages 313 - 320, XP002028243 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2231842T3 (es) | 2005-05-16 |
| AU717441B2 (en) | 2000-03-23 |
| HUP9700948A2 (hu) | 1998-03-02 |
| MX9704020A (es) | 1998-06-30 |
| DE69732266D1 (de) | 2005-02-24 |
| DE69732266T2 (de) | 2006-01-12 |
| KR970073319A (ko) | 1997-12-10 |
| TW404817B (en) | 2000-09-11 |
| US5917128A (en) | 1999-06-29 |
| EP0810284A1 (en) | 1997-12-03 |
| CA2206625A1 (en) | 1997-11-30 |
| ATE287450T1 (de) | 2005-02-15 |
| JPH1052185A (ja) | 1998-02-24 |
| UA72420C2 (uk) | 2005-03-15 |
| CZ163997A3 (cs) | 1998-06-17 |
| HU9700948D0 (en) | 1997-07-28 |
| CN1172579A (zh) | 1998-02-11 |
| ZA974824B (en) | 1998-02-19 |
| PL320212A1 (en) | 1997-12-08 |
| AU2371597A (en) | 1997-12-04 |
| EP0810284B1 (en) | 2005-01-19 |
| RU2142013C1 (ru) | 1999-11-27 |
| HRP970297A2 (en) | 1998-10-31 |
| NZ314888A (en) | 1999-03-29 |
| HUP9700948A3 (en) | 2001-02-28 |
| CN1188027C (zh) | 2005-02-09 |
| PL187820B1 (pl) | 2004-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL1003239C2 (nl) | Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant. | |
| Lotfi et al. | Production of haploid and doubled haploid plants of melon (Cucumis melo L.) for use in breeding for multiple virus resistance | |
| Van Damme et al. | Gynodioecy in Plantago lanceolata L I. Polymorphism for plasmon type | |
| US8044267B2 (en) | Rucola plants with cytoplasmic male sterility (CMS) | |
| Ssebuliba et al. | Reproductive efficiency and breeding potential of East African highland (Musa AAA-EA) bananas | |
| Reed | Haploid cultures | |
| Akutsu et al. | Production of 2 n pollen of Asiatic hybrid lilies by nitrous oxide treatment | |
| Gazit | Pollination and fruit set of avocado | |
| Ordoñez et al. | Technical manual potato reproductive and cytological biology. | |
| Sugihara et al. | Haploid plants carrying a sodium azide-induced mutation (fdr1) produce fertile pollen grains due to first division restitution (FDR) in maize (Zea mays L.) | |
| Hansen et al. | Novel flowering and fatty acid characters in rapid cycling Brassica napus L. resynthesized by protoplast fusion | |
| EP0771523B1 (en) | A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant | |
| RU2650764C2 (ru) | Кукурузные продукты и способы их получения | |
| NL8803089A (nl) | Cms-brassica oleracea planten en methoden om ze te verkrijgen. | |
| De Maine | Potato haploid technologies | |
| Norris et al. | Monitoring large scale releases of genetically modified crops (EPG 1/5/84): Incorporating report on project EPG 1/5/30–monitoring releases of genetically modified crop plants | |
| Alan et al. | Doubled Haploid Broccoli (Brassica olearacea var. italica) Plants from Anther Culture | |
| WO2010034961A1 (en) | Methods of obtaining hevea bras iliensis plants | |
| MXPA97004020A (en) | Plant brassica oleracea citoplasmica, male, sterile and method to obtain such pla | |
| Greaves | Impacts of hybridization on native crabapple (Malus coronaria) by domestic apple (Malus domestica) in southern Ontario | |
| Ahokas | Hermaphroditism in Fragaria moschata, a Cultivated Strawberry Species Preceding the Evolution and Growing of F. ananassa in Europe | |
| Ni et al. | Extensive chromosome rearrangements induced by γ-rays irradiation in lily mutant ‘Menglina Leddy’ | |
| RAHMAN et al. | HYBRIDIZATION IN SATKARA | |
| Malueg | The reproductive biology of Cornus florida L.(Cornaceae) | |
| Yamada et al. | Sexual polyploidization of Japanese persimmon by utilizing unreduced egg |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD2B | A search report has been drawn up | ||
| V1 | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 20121201 |