CN106047860B - 一种植物基因组dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种植物基因组DNA提取方法，包括：破碎植物样本得到植物粉末；所述植物粉末依次经分离液、裂解液和活性剂溶液、CTAB提取缓冲液、氯仿‑异戊醇溶液处理后，得到含有DNA的提取液，除去该提取液中的杂质既得基因组DNA。所述的DNA提取方法可有效地去除纤维素、多糖或蜡质、酚类等杂质，且省时、操作容易、成本低，尤其适合于龙胆科植物的干枯革质叶片的DNA提取。

Description

一种植物基因组DNA提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种植物基因组DNA提取方法。
背景技术
植物分子生物学研究很多时候是从基因组DNA分离提取开始的。为获得高质量DNA，研究人员通常情况下选用幼苗嫩叶、各种幼嫩的器官组织、新鲜的成熟叶片或培养的植物愈伤组织、细胞等材料，通过CTAB法或SDS碱裂解法、或基于碱裂解法原理的各种植物基因组DNA提取试剂盒，可以获得高质量的DNA产物。
但是，在某些研究课题我们也要用老龄叶片、干枯叶片，或者富含多糖、酚类化合物的革质叶片等材料提取基因组DNA，这些材料用上述方法进行提取不能获得令人满意的结果。DNA产物即便经过纯化，也经常有纤维素、多糖或蜡质、酚类化合物残留，对后续的各种PCR反应、限制性内切酶反应、核酸分子杂交以及以基因组DNA为起始材料的实验产生不良影响，有时甚至不能得到PCR扩增产物、酶切产物或分子杂交结果。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物基因组DNA提取方法，所述的DNA提取方法可有效地去除纤维素、多糖或蜡质、酚类等杂质，且省时、操作容易、成本低。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种植物基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
1)、破碎植物样本得到植物粉末；
2)、取所述植物粉末加入到分离液中，混匀后离心，弃上清得到第一沉淀；
3)、向所述第一沉淀中加入裂解液并混匀后加入所述活性剂溶液得到混合液1，将混合液1静置8min～15min；
4)、加入CTAB提取缓冲液得到混合液2，将所述混合液2于63℃～67℃孵育50min～70min；
5)、加入与所述混合液2等量的氯仿-异戊醇溶液并搅拌、离心，将离心后所得上层水相称为提取液1，除去所述提取液1中的杂质，得到基因组DNA；
所述分离液含有浓度为140g/L～160g/L的PEG4000、0.3M～0.4M山梨醇、浓度为2g/L～8g/L的亚精胺、浓度为2g/L～8g/L的精胺、体积百分数为0.4％～0.6％的β-巯基乙醇，所述分离液的溶剂为0.09M～0.11M pH＝7.8～8.2的Tris-HCl溶液；
所述裂解液含有0.3M～0.4M山梨醇、浓度为2g/L～8g/L的亚精胺、浓度为2g/L～8g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述裂解液的溶剂为0.09M～0.11M pH＝7.8～8.2的Tris-HCl溶液；
所述活性剂溶液为质量百分数为5％～10％的L-肌氨酸。
本发明提取DNA的方法基于CTAB法，CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(≥0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇或异丙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇或异丙醇随之被除去。
在本发明中，所用的CTAB提取缓冲液为常规配方：pH＝9.5的0.1M Tris-HCl、pH＝8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、2g/100mL的CTAB、40mMβ-巯基乙醇。
其中，所述分离液和所述裂解液中均添加了亚精胺和精胺。这二者是一类小分子阳离子，在本发明中，可与DNA结合后导致DNA溶解性下降，可重复沉淀DNA，利于后续DNA的纯化；
活性剂溶液的主要成分为L-肌氨酸，它是一种氨基酸表面活性剂，可以改变膜蛋白结构，破坏细胞膜，利于充分释放DNA分子；
氯仿可加速有机相与液相分层，而异戊醇则可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
氯仿-异戊醇溶液也可替换为苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，其体积比为25:24:1，但在本发明的反应体系中，氯仿-异戊醇溶液提取得到的DNA纯度更高。
在本发明中，若无特别强调，各试剂所用溶剂均为水。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法：
在步骤2)中，所述分离液的体积为所述植物粉末体积的8～15倍；
在步骤3)中，所述裂解液的加入量为所述分离液体积的1/2，所述活性剂溶液的体积为所述裂解液体积的1/10；
在步骤4)中，所述CTAB提取缓冲液的加入量与所述混合液1等体积；
在步骤5)中，所述氯仿-异戊醇溶液的加入量与与所述混合液2等体积；所述氯仿-异戊醇溶液为体积比为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法，所述植物样本为干枯革质叶片。
进一步优选的，所述植物样本为龙胆科植物的干枯革质叶片。
更优选的，所述龙胆科植物包括龙胆草、三花龙胆、东北龙胆中的一种。
干枯革质叶片中细胞的细胞壁很厚，多糖成分比重大，提取其中的DNA非常困难。本发明提供的植物基因组DNA提取方法可很好地克服上述问题，且尤其适用于龙胆科植物。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法，在步骤2)中，所述离心为14000rpm～16000rpm离心8min～12min；
在步骤5)中，所述离心为9000rpm～11000rpm离心8min～12min。
本发明中离心的速度经过优选，尤其适合龙胆科植物DNA的提取，且与本发明优选的分离液、裂解液及活性剂溶液相适应。
在步骤2)中，若离心速度过大，则杂质也会离心至所述第一沉淀中，若离心速度过小，则不利于DNA的沉淀。
同理，在步骤5)中，若离心速度过小，则分层效果不好，离心速度过大，则DNA可能部分下沉到中间层的蛋白相中造成DNA的损耗。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法，在步骤5)中，除去所述提取液1中的杂质的方法为：用异丙醇、TE饱和酚、酚-氯仿液、乙醇的水溶液中的多种洗涤所述沉淀；
所述酚-氯仿液按照1g固体苯酚：1ml氯仿的固液比配置而成。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法，所述除去所述提取液1中的杂质的操作具体包括以下步骤：
A)、将所述提取液1中加入等体积的异丙醇并混匀，弃去上清得到第二沉淀；
B)、用TE缓冲液溶解所述第二沉淀，加入与所述TE缓冲液等体积的TE饱和酚并混匀、离心；
C)、取上步离心后得到的上层水相并加入所示上层水相一半体积的酚-氯仿液，搅拌并离心；
D)、重复1次步骤C)；
E)、取上步离心后得到的上层水相并加入等体积的异丙醇，混匀后离心，弃去上清得到第三沉淀；
F)、用乙醇的水溶液清洗所述第三沉淀并离心，弃去上清得到第四沉淀；
G)、用乙醇的水溶液清洗所述第四沉淀并离心，弃去上清得到第五沉淀；
H)、待所述第五沉淀干燥后，加入TE缓冲液溶解得到基因组DNA。
其中，在步骤B)中，因为酚与水有一定的互溶，苯酚用TE缓冲液饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8，是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5～7)，RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
在步骤A)、E)、F)中，乙醇溶液和异丙醇的作用都是沉淀DNA分子以利于清洗DNA，异戊醇还可增加分相后的各相的稳定性。
优选的，如上所述的植物基因组DNA提取方法，在步骤B)～步骤C)中，所述离心为7000rpm～9000rpm离心8min～12min；
在步骤E)～步骤G)中，所述离心为11000rpm～13000rpm离心4min～6min。
在本发明中，所用离心机有效半径长度为8.4cm。
优选的，所述TE饱和酚是以TE缓冲液为溶剂制成的饱和重蒸酚，且其中含有浓度为1g/L的8-羟基喹啉的混合液；
其中，所述TE缓冲液含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH＝8.0；
所述乙醇的水溶液为体积百分数为65％～75％的乙醇溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供的各溶液及基因组DNA提取方法各步骤，可以有效提取干枯革质叶片中基因组DNA，省时、高纯度、低成本。
2)、本发明提供的分离液、裂解液中所含的亚精胺、精胺广泛分布于生物体内，无毒，二者与DNA分子相互作用，可以使DNA分子凝聚并沉淀，并且精胺还能增加DNA分子的稳定性。
3)、本发明提供的活性剂溶液L-肌氨酸是一种氨基酸表面活性剂，可以改变膜蛋白结构，破坏细胞膜，释放DNA分子。
4)、本发明提供的各溶液及植物干枯革质叶片基因组DNA提取方法步骤，可以有效去除革质叶片中所含纤维素、多糖、多酚类物质及蜡质，获得高质量的基因组DNA。
5)、本发明提供的各溶液及植物干枯革质叶片基因组DNA提取方法步骤，所获得的基因组DNA纯度高，有利于后续的各类PCR反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实验例中基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，1～3泳道是Plant DNAIsolation Reagent(TAKARA BIO INC.)提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA；4～6泳道是采用SDS碱裂解法提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA；7～9泳道是本发明实施例提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA；10～12是CTAB法提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA；M是DNA标准分子量λhindⅢ(TAKARA)；
图2为本发明实验例随机引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，1～3泳道是PlantDNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA为模板的随机引物PCR产物；4～6泳道是SDS碱裂解法提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA的随机引物PCR产物；7～9泳道是CTAB法提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA的随机引物PCR产物；10～12泳道是本发明实施例提取的龙胆草、三花龙胆、东北龙胆干枯叶片基因组DNA的随机引物PCR产物；M是DNA标准分子量DL2000(TAKARA BIO INC.)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例提供了一种龙胆草干枯革质叶片基因组DNA提取方法，包括：
一、溶液配置：
1)、160g/L的PEG4000、0.3M山梨醇、浓度为2g/L的亚精胺、浓度为8g/L的精胺、体积百分数为0.4％的β-巯基乙醇，所述分离液的溶剂为0.09M pH＝7.8的Tris-HCl溶液；
2)、裂解液：0.3M山梨醇、浓度为2g/L的亚精胺、浓度为2g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述裂解液的溶剂为0.11M pH＝8.2的Tris-HCl溶液；
3)、活性剂溶液：质量百分数为5％的L-肌氨酸；
4)、CTAB提取缓冲液：pH＝9.5的0.1M Tris-HCl、pH＝8.0的20mM EDTA、1.4MNaCl、20g/L的CTAB、40mMβ-巯基乙醇；
5)、TE缓冲液：pH＝8.0的10mM Tris-HCl、pH＝8.0的1mM EDTA；
6)、TE饱和酚：以pH＝8.0的TE缓冲液为溶剂的饱和重蒸酚、所述饱和重蒸酚中还加入了1g/L的8-羟基喹啉；
7)、氯仿-异戊醇液：体积比为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液；
8)、酚-氯仿液：取于-20C°保存的固体苯酚1g，加1ml氯仿充分混匀；
上述1)～8)中各溶液按组成成分和溶液浓度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取出。
二、DNA的提取
1)、取龙胆草干枯叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中，加入样品量8～15倍体积的冰浴预冷的分离液约400μL，在冰上轻轻搅拌，充分混匀后，在14000rpm、4℃、离心12min；离心后弃去上清；
2)、向沉淀中加200μL裂解液，充分搅拌、混匀，随后加入20μL活性剂溶液，室温放置15min；
3)、加入等量的CTAB提取缓冲液，63℃孵育70min；再加入等量的氯仿-异戊醇液，缓慢搅匀约20min，在室温下9000rpm，离心12min；
三、DNA的纯化
4)、取上层水相，加等体积异丙醇，充分颠倒混匀，使DNA分子沉淀；用细玻璃棒卷取回收沉淀；
5)、在离心管中加入30～50μL TE缓冲液溶解沉淀，然后加入与所述TE缓冲液等体积的TE饱和酚，混匀。于室温下7000rpm离心12min；
6)、取上层水相，加入1/2体积酚-氯仿液搅拌，室温下7000rpm离心12min；
7)、重复一次步骤6)；
8)、取上层水相，加等体积异丙醇沉淀DNA分子，4℃、11000rpm离心6min，去掉上清；
9)、加30～50μL体积百分数为65％的乙醇溶液，轻弹管壁3～4次，4℃、11000rpm离心6min，去掉上清；
10)、重复一次步骤9)；
11)、沉淀干燥后，加适量TE缓冲液溶解DNA沉淀。
实施例2
本发明实施例提供了一种东北龙胆干枯革质叶片基因组DNA提取方法，包括：
一、溶液配置：
1)、140g/L的PEG4000、0.4M山梨醇、浓度为8g/L的亚精胺、浓度为2g/L的精胺、体积百分数为0.6％的β-巯基乙醇，所述分离液的溶剂为0.11M pH＝8.2的Tris-HCl溶液；
2)、裂解液：0.4M山梨醇、浓度为8g/L的亚精胺、浓度为8g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述裂解液的溶剂为0.09M pH＝7.8的Tris-HCl溶液；
3)、活性剂溶液：质量百分数为5％的L-肌氨酸；
4)、CTAB提取缓冲液：pH＝9.5的0.1M Tris-HCl、pH＝8.0的20mM EDTA、1.4MNaCl、20g/L的CTAB、40mMβ-巯基乙醇；
5)、TE缓冲液：pH＝8.0的10mM Tris-HCl、pH＝8.0的1mM EDTA；
6)、TE饱和酚：以pH＝8.0的TE缓冲液为溶剂的饱和重蒸酚、所述饱和重蒸酚中还加入了1g/L的8-羟基喹啉；
7)、氯仿-异戊醇液：体积比为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液；
8)、酚-氯仿液：取于-20C°保存的固体苯酚1g，加1ml氯仿充分混匀；
上述1)～8)中各溶液按组成成分和溶液浓度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取出。
二、DNA的提取
1)、取东北龙胆干枯叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中，加入样品量8～15倍体积的冰浴预冷的分离液约400μL，在冰上轻轻搅拌，充分混匀后，在16000rpm、4℃、离心8min；离心后弃去上清；
2)、向沉淀中加200μL裂解液，充分搅拌、混匀，随后加入20μL活性剂溶液，室温放置8min；
3)、加入等量的CTAB提取缓冲液，67℃孵育50min；再加入等量的氯仿-异戊醇液，缓慢搅匀约20min，在室温下11000rpm，离心8min；
三、DNA的纯化
4)、取上层水相，加等体积异丙醇，充分颠倒混匀，使DNA分子沉淀；用细玻璃棒卷取回收沉淀；
5)、在离心管中加入30～50μL TE缓冲液溶解沉淀，然后加入与所述TE缓冲液等体积的TE饱和酚，混匀。于室温下9000rpm离心8min；
6)、取上层水相，加入1/2体积酚-氯仿液搅拌，室温下9000rpm离心8min；
7)、重复一次步骤6)；
8)、取上层水相，加等体积异丙醇沉淀DNA分子，4℃、13000rpm离心4min，去掉上清；
9)、加30～50μL体积百分数为75％的乙醇溶液，轻弹管壁3～4次，4℃、13000rpm离心4min，去掉上清；
10)、重复一次步骤9)；
11)、沉淀干燥后，加适量TE缓冲液溶解DNA沉淀。
实施例3
本发明实施例提供了一种三花龙胆干枯革质叶片基因组DNA提取方法，包括：
一、溶液配置：
1)、150g/L的PEG4000、0.35M山梨醇、浓度为6g/L的亚精胺、浓度为6g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述分离液的溶剂为0.10M pH＝8.0的Tris-HCl溶液；
2)、裂解液：0.35M山梨醇、浓度为6g/L的亚精胺、浓度为6g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述裂解液的溶剂为0.10M pH＝8.0的Tris-HCl溶液；
3)、活性剂溶液：质量百分数为5％的L-肌氨酸；
4)、CTAB提取缓冲液：pH＝9.5的0.1M Tris-HCl、pH＝8.0的20mM EDTA、1.4MNaCl、20g/L的CTAB、40mMβ-巯基乙醇；
5)、TE缓冲液：pH＝8.0的10mM Tris-HCl、pH＝8.0的1mM EDTA；
6)、TE饱和酚：以pH＝8.0的TE缓冲液为溶剂的饱和重蒸酚、所述饱和重蒸酚中还加入了1g/L的8-羟基喹啉；
7)、氯仿-异戊醇液：体积比为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液；
8)、酚-氯仿液：取于-20C°保存的固体苯酚1g，加1ml氯仿充分混匀；
上述1)～8)中各溶液按组成成分和溶液浓度配制后，保存于4C°冰箱，使用前取出。
二、DNA的提取
1)、取三花龙胆干枯叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中，加入样品量8～15倍体积的冰浴预冷的分离液约400μL，在冰上轻轻搅拌，充分混匀后，在15000rpm、4℃、离心10min。离心后弃去上清；
2)、向沉淀中加200μL裂解液，充分搅拌、混匀，随后加入20μL活性剂溶液，室温放置10min；
3)、加入等量的CTAB提取缓冲液，65℃孵育60min；再加入等量的氯仿-异戊醇液，缓慢搅匀约20min，在室温下10000rpm，离心10min；
三、DNA的纯化
4)、取上层水相，加等体积异丙醇，充分颠倒混匀，使DNA分子沉淀；用细玻璃棒卷取回收沉淀；
5)、在离心管中加入30～50μL TE缓冲液溶解沉淀，然后加入与所述TE缓冲液等体积的TE饱和酚，混匀。于室温下8000rpm离心10min；
6)、取上层水相，加入1/2体积酚-氯仿液搅拌，室温下8000rpm离心10min；
7)、重复一次步骤6)；
8)、取上层水相，加等体积异丙醇沉淀DNA分子，4℃、12000rpm离心5min，去掉上清；
9)、加30～50μL体积百分数为70％的乙醇溶液，轻弹管壁3～4次，4℃、12000rpm离心5min，去掉上清；
10)、重复一次步骤9)；
11)、沉淀干燥后，加适量TE缓冲液溶解DNA沉淀。
实验例
将本发明方法与Plant DNA Isolation Reagent(TAKARA BIO INC.)(对比例1)、SDS碱裂解法(对比例2)、CTAB法(对比例3)提取的龙胆草、东北龙胆、三花龙胆的干枯叶片基因组DNA进行DNA质量对比。
具体的，对比例1～3的设置方法为：
对比例1：分别取干枯的龙胆草、东北龙胆、三花龙胆叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中。按照Plant DNAIsolation Reagent(TAKARA BIO INC.)试剂盒说明书所述步骤提取基因组DNA。该DNA样品作为对比例1-1、1-2、1-3备用。
对比例2：分别取干枯的龙胆草、东北龙胆、三花龙胆叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中。按照SDS碱裂解法提取基因组DNA。该DNA样品作为对比例2-1、2-2、2-3样品备用。
对比例3：分别取干枯的龙胆草、东北龙胆、三花龙胆叶片40～50mg，在研钵中用液氮研磨成细粉末。将冰冻状态的粉末15～20mg，放入1.5ml离心管中。按照CTAB法提取基因组DNA。该DNA样品作为对比例3-1、3-2、3-3备用。
DNA质量检测
将对比例1～3及本发明提供的实施例1～3提取的基因组DNA溶液用核酸蛋白微量分析仪(ScanDrop250，analytikjena)做质量检测，检测结果如表1所示。
表1 DNA质量检测结果
表1中，DNA溶液浓度检测行数据显示，在样品量相同情况下，对照方法1提取的DNA溶液浓度，即对比例1-1～1-3列数据最小值为99.06ng/μL，最大值132.3ng/μL；对比例2提取的DNA溶液浓度，即对比例2-1～2-3列的最小值100.1ng/μL，最大值122.2ng/μL；对比例3提取的DNA溶液浓度，即对比例3-1～3-3列最小值65.4ng/μL，最大值92.06ng/μL。本发明方法提取的DNA溶液浓度，即实施例1～3列最小值84.13ng/μL，最大值245.5ng/μL。数据提示本法提取各种龙胆的干枯叶片基因组DNA的得率较高。
DNA得率行数据是DNA/RNA在260nm处的吸收值乘以10后得到的DNA溶液浓度。数据显示，实施例1～3列数值大于对比例1-1～1-3列和对比例2-1～2-3列、对比例3-1～3-3列数值，说明在样品量相同的情况下，本发明方法提取的基因组DNA得率高于前3种方法。
OD260/OD280是根据样品在260nm和280nm处的吸收值比值判断样品纯度。该比值为1.8～2.0范围内表明DNA样品较纯，大于2.0表明样品含有较多量的RNA，低于1.8表明样品中含有较多的蛋白质。表中数据显示，本发明方法提取的DNA样品，即实施例1～3列数值分别为2.0、2.0、2.02，提示样品中不含(或极少含有)RNA和蛋白质污染。对比例1-1～1-3列数值分别为2.16、2.16、2.25，对比例2-1～2-3列数值分别为2.18、2.11、2.19，对比例3-1～3-3列数值分别是2.16、2.03、2.1，提示含有较多的RNA污染。以上实验过程中均未加RNAase处理。显示本方法提取的DNA纯度较高。
OD230/OD260行数据提示DNA溶液中的盐分残留，其比值应在0.4～0.5之间，比值高于0.5则提示溶液有较多的盐分残留。表中对比例1-1～1-3列数据比值分别为1.34、1.27、1.31，对比例2-1～2-3列数据比值分别为0.86、0.82、0.83；对比例3-1～3-3列数据比值分别为1.36、1.29、1.46，提示DNA溶液中残留较多的盐分，对后续PCR反应体系会产生不良影响。表中实施例1～3列数据为本发明方法提取的DNA溶液，其比值分别为0.6、0.74、0.6，提示含有较少量盐分残留。
PCR实验检测
将对比例1～3和实施例1～3提取的基因组DNA溶液分为两份。一份直接进行DNA琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示；
从图1中可直观的看出，本发明实施例1～3提取的DNA质量最好。
另一份均稀释成20ng/μL，配制成50μL PCR反应体系进行DNA扩增。
PCR反应体系：20ng/μL DNA 5μL，10×PCR buffer 5μL，4mM dNTP3μL，20μMrandem primer1 0.75μL，20μM randem primer2 0.75μL，EX(5U/μL TAKARA)1μL，ddH2O 34.5μL。
PCR反应程序：
①94℃ 5min
②94℃ 50s
③37℃ 30s
④72℃ 1min30s
⑤重复②③④进行35个循环
⑥72℃ 7min
⑦4℃保存。
分别将各实施例和对比例提取的DNA作为模板，在完全相同的反应体系和反应条件下分别进行随机引物PCR反应，比较各方法所得的DNA质量对PCR反应的影响及PCR反应效果。
其中，所用引物为：
randem primer1序列：5，AGCGCCATTG 3；
randem primer2序列：5，CACCGTATCC 3。
PCR反应产物做1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。
从图2可见，本发明方法提取的基因组DNA为模板，PCR产物条带清晰，反应的重复性好，长片段在2000bp以上，说明反应体系稳定无杂质干扰、有利于片段延伸。短片段在300～400bp间，条带清晰。
对比例1和对比例2提取的DNA，PCR反应产物分别是1～3道和4～6道，6个PCR反应产物在2000bp以上都没有条带，说明反应体系中有多糖成分干扰，不利于延伸反应进行和长片段合成。在小片段区域，条带较多但同一模板的PCR产物重复性较差。对比例3提取的DNA，同一模板的PCR产物的重复性好于对比例1和对比例2，但与本发明方法相比仍不能令人满意。
因此，本法的有益之处在于对含糖类和酚类成分较多的革质叶片，本发明方法更为适用，能得到高质量的DNA溶液，并且对后续PCR反应体系没有不良影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种植物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、破碎植物样本得到植物粉末；所述植物样本为干枯革质叶片；
2)、取所述植物粉末加入到分离液中，混匀后离心，弃上清得到第一沉淀；
3)、向所述第一沉淀中加入裂解液并混匀后加入所述活性剂溶液得到混合液1，将混合液1静置8min～15min；
4)、加入CTAB提取缓冲液得到混合液2，将所述混合液2于63℃～67℃孵育50min～70min；
5)、加入与所述混合液2等量的氯仿-异戊醇溶液并搅拌、离心，将离心后所得上层水相称为提取液1，除去所述提取液1中的杂质，得到基因组DNA；
所述分离液含有浓度为140g/L～160g/L的PEG4000、0.3M～0.4M山梨醇、浓度为2g/L～8g/L的亚精胺、浓度为2g/L～8g/L的精胺、体积百分数为0.4％～0.6％的β-巯基乙醇，所述分离液的溶剂为0.09M～0.11M pH＝7.8～8.2的Tris-HCl溶液；
所述裂解液含有0.3M～0.4M山梨醇、浓度为2g/L～8g/L的亚精胺、浓度为2g/L～8g/L的精胺、体积百分数为0.5％的β-巯基乙醇，所述裂解液的溶剂为0.09M～0.11M pH＝7.8～8.2的Tris-HCl溶液；
所述活性剂溶液为质量百分数为5％～10％的L-肌氨酸。
2.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，在步骤2)中，所述分离液的体积为所述植物粉末体积的8～15倍；
在步骤3)中，所述裂解液的加入量为所述分离液体积的1/2，所述活性剂溶液的体积为所述裂解液体积的1/10；
在步骤4)中，所述CTAB提取缓冲液的加入量与所述混合液1等体积；
在步骤5)中，所述氯仿-异戊醇溶液的加入量与与所述混合液2等体积；所述氯仿-异戊醇溶液为体积比为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液。
3.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述植物样本为龙胆科植物的干枯革质叶片。
4.根据权利要求3所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述龙胆科植物包括龙胆草、三花龙胆、东北龙胆中的一种。
5.根据权利要求1、3、4任一项所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，在步骤2)中，所述离心为14000rpm～16000rpm离心8min～12min；
在步骤5)中，所述离心为9000rpm～11000rpm离心8min～12min。
6.根据权利要求5所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，在步骤5)中，除去所述提取液1中的杂质的方法为：用异丙醇、TE饱和酚、酚-氯仿液、乙醇的水溶液中的多种洗涤所述沉淀；
所述酚-氯仿液按照1g固体苯酚：1ml氯仿的固液比配置而成。
7.根据权利要求6所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，所述除去所述提取液1中的杂质的操作具体包括以下步骤：
A)、将所述提取液1中加入等体积的异丙醇并混匀，弃去上清得到第二沉淀；
B)、用TE缓冲液溶解所述第二沉淀，加入与所述TE缓冲液等体积的TE饱和酚并混匀、离心；
C)、取上步离心后得到的上层水相并加入所示上层水相一半体积的酚-氯仿液，搅拌并离心；
D)、重复1次步骤C)；
E)、取上步离心后得到的上层水相并加入等体积的异丙醇，混匀后离心，弃去上清得到第三沉淀；
F)、用乙醇的水溶液清洗所述第三沉淀并离心，弃去上清得到第四沉淀；
G)、用乙醇的水溶液清洗所述第四沉淀并离心，弃去上清得到第五沉淀；
H)、待所述第五沉淀干燥后，加入TE缓冲液溶解得到基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的植物基因组DNA提取方法，其特征在于，在步骤B)～步骤C)中，所述离心为7000rpm～9000rpm离心8min～12min；
在步骤E)～步骤G)中，所述离心为11000rpm～13000rpm离心4min～6min。
9.根据权利要求8所述的DNA提取方法，其特征在于，所述TE饱和酚是以TE缓冲液为溶剂制成的饱和重蒸酚，且其中含有浓度为1g/L的8-羟基喹啉的混合液；
其中，所述TE缓冲液含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH＝8.0；
所述乙醇的水溶液为体积百分数为65％～75％的乙醇溶液。
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