CN109136220A - 一种壳斗科植物样品dna提取和纯化方法 - Google Patents

一种壳斗科植物样品dna提取和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于壳斗科植物鲜样和标本的提取和纯化方法，本发明的提取方法在细胞核裂解之前，加入含有抗坏血酸、Triton‑X 100等的专用漂洗液，不仅能有效去除多糖多酚等杂质，使得到的DNA不再粘稠，还能有效去除色素污染，使所提取的DNA纯度高、产率大，相比核裂解之后再进行除杂的步骤顺序效果更优，适于后期分子实验的应用；本发明纯化方法采用硅胶粉自制硅胶吸附液，可有效纯化并获得高纯度DNA，能满足下游PCR及酶切实验。本发明方法克服了传统CTAB法和试剂盒在壳斗科植物提取中的困难，可用于提取壳斗科新鲜叶片、硅胶干燥样及保存年代较长的干燥植物标本样品的DNA，用于高通量测序。

Description

一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法
技术领域
本发明涉及一种植物DNA的提取和纯化方法，尤其涉及一种富含多糖多酚类的壳斗科植物样品特别是新鲜样品、硅胶干燥样品、标本样品中DNA的提取和纯化方法。
背景技术
高通量测序技术大多具有数据量大、通用性广和高分辨率等优势，已广泛运用于种质鉴定(Lai，Li et al.2010)、遗传多样性分析(Xia，Guo et al.2009)、遗传图谱构建(Huang，Feng et al.2009)等，成为林木遗传学和分子育种的重要研究工具和手段。
壳斗科(Fagaceae)植物是北半球温带和亚热带森林的重要组成，共有8属，约1047种(Govaerts and Frodin 1998)。我国有7属，约300多种，自然分布于南北各省区，资源丰富，其树皮和壳斗都富含鞣质，坚果(子叶)含大量淀粉，是重要的木材、坚果、栲胶的资源植物(刘茂松，洪必恭1998)，具有重要的经济价值和生态功能。开展壳斗科植物的遗传多样性分析，对壳斗科植物资源的可持续利用和保护有重要意义。
但是，壳斗科植物富含等次生代谢物质，并且这些多糖、多酚会与核酸形成复合物，严重影响了DNA的提取质量，成为高通量测序方法在这一类群上运用的瓶颈。
目前对植物总DNA主要采用SDS法(Edwards，Johnstone et al.1991)，CTAB法(Murray and Thompson 1980)。但是，这些通用提取方法用于提取多糖多酚类物质含量较多的植物时，往往不能获得高纯度的基因组DNA。所获得的总DNA呈棕褐色，被胶冻状多糖物质所包裹，琼脂糖电泳显示DNA有拖尾现象，加样孔发亮，蛋白、多糖和多酚污染严重，难以开展下游实验分析，用市售试剂盒价格昂贵，且提取的DNA产量不高，性价比差。
此外，植物标本由于保存年代较长，DNA化学性质不稳定，容易通过水解或氧化作用自发降解，因而年份越久远的标本，DNA提取的难度越大。并且标本在制作和储藏过程中受到高温、杀虫除菌剂等物理化学因素的干扰，导致标本所含的DNA大量降解、含量低，提取过程中容易因氧化而产生严重的褐化，色素污染严重，再加上得率低，所需样品比一般材料要多，然而有些标本材料又十分有限珍贵，要从这些宝贵的材料中有效提取高纯度基因组DNA用于二代测序等分子生物学实验显得尤为迫切。
当前从动物标本提取DNA有不少报道，也有不少专利，但从植物标本提取DNA难度较大，尚无成熟的通用方法。
发明内容
本发明提供一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法，能够解决从壳斗科植物样品提取高质量DNA的两大难题：第一，有效去除壳斗科植物富含的多糖多酚杂质并提取出高质量DNA；第二，有效纯化壳斗科植物DNA，同时，本发明还解决了从植物标本提取DNA的难题。
本发明的技术方案如下：
一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，包括以下步骤：
第一、取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉，使用快速研磨方式能够避免样品在空气中暴露时间过长导致降解；
第二、加入专用漂洗液，震荡离心后弃上清，重复此步，直至上清无色且上清和沉淀物有明显的分界线；所述专用漂洗液主要包括如下有效组分：2％～4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1％～2％L-Ascorbic Acid(L-抗坏血酸)、2％～4％Triton-X 100(聚乙二醇辛基苯基醚)、4％～5％β-mercaptoeyhanol(β-巯基乙醇)；在某些实施方式中，专用漂洗液的加入量可以为1～2ml；
第三、加入预热的CTAB提取液，60℃～65℃水浴40～60分钟，每5～10分钟颠倒混匀一次；
第四、室温放置冷却2～3分钟后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液，震荡，离心；
第五、取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，离心；
第六、取上清，加入1/10～1/5体积的3M～4M醋酸钠、双倍体积以上的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30～50min，4℃离心；
第七、去上清得到沉淀，用预冷的75％～80％酒精洗涤沉淀，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于TE缓冲液，即得植物基因组DNA；
第八、取植物基因组DNA，通过硅胶粉吸附方法纯化，即得纯化后的植物总DNA。
优选地，所述植物样品为新鲜样、干燥样(如硅胶干燥样)和/或标本叶片、种子(胚乳)、树皮(韧皮部)等。
优选地，所述的硅胶粉吸附纯化方法步骤如下：
(1)称取硅胶(silica)粉，加入超纯水震荡混匀，静置，离心除去上清液，此步重复若干次；离心时间可以为30s-1min；
(2)在洗过的硅胶粉中加入超纯水，配成硅胶悬浊液(liquid silica stock；LSK)，混匀LSK，分装至各管；
(3)取1管硅胶悬浊液，加入1ml～2ml超纯水，震荡混匀，离心20s～30s，弃上清；
(4)往LSK中加入5M～6M碘化钾(KI)，使溶液中的KI最终浓度为4mol/L，配成硅胶吸附液，震荡混匀，加入DNA，室温混匀10～15min，离心3～5min；
(5)弃上清，加入硅胶漂洗缓冲液，震荡混匀，离心3～5min，重复此步骤3次；优选地，所述硅胶漂洗缓冲液包括如下组分：每100ml漂洗液包含1ml5M NaCl+99ml 95％酒精；
(6)沉淀用无水乙醇漂洗，将沉淀晾干，加入TE缓冲液，37℃温育10～15min后离心3～5min，将上清转移至新的离心管中；
(7)在离心管中加入3M～4M乙酸钠、多倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃静置后，4℃离心；
(8)去上清，得到的沉淀用-20℃预冷的75％～80％酒精清洗3～5次，最后用无水乙醇加速脱水，晾干，加入TE缓冲液进行溶解，即得到纯化后的总DNA。
在本发明中，所述专用漂洗液在裂解细胞核之前加入，并使用该专用漂洗液反复清洗，利用了多糖多酚等次生代谢物主要存在于细胞质中并与DNA相互隔离这一性质，通过离心，将细胞质中的大多数多糖多酚与细胞核分离开。
优选地，所述的CTAB提取液包括如下组分：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2M NaCl，100mM～120mM Tris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，10％～15％(w/v)N-Lauroylsarcosine Sodium salt，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，10mg/μl RNase A；
所述的CTAB提取液现配现用；所述的CTAB提取液具体配制方法如下：
配置CTAB母液，所述CTAB母液包括：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2M NaCl，100mM～120mM Tris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；
配置裂解液(lysis buffer)，所述裂解液包括：10％～15％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐(N-Lauroylsarcosine Sodium salt)，100mM～120mM Tris-HCl pH 8.0，20mM～30mMEDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；
配置所述CTAB提取液，所述CTAB提取液包括：CTAB母液∶裂解液＝10∶1，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，5μl～8μl 10mg/μl RNase A。
CTAB不易溶解，需要高温灭菌才能充分溶解，配置母液可以节省每次样品称量、溶解的时间，同时也节省了每次都要高压灭菌的时间。
CTAB提取液需现配现用，RNase A在细胞核裂解时加入可节省另外消化RNA的时间，且去除RNA的效果也较理想。
在优选的实施方式中，所述交联聚乙烯基吡咯烷酮poly-vinylpolypyrrolidone(pvpp)和/或维生素C加入的量为每1g样品加入0.6g。研磨时加入pvpp或者维生素C，可有效避免粉末暴露在空气中过久而氧化。
优选为，所述提取过程的离心力为10000rpm～12000rpm。
优选为，所述硅胶悬浊液与加入DNA量为2∶1～2.5∶1，DNA得率约为100～150ng/μl。若加入硅胶悬浊液过少，则DNA吸附不完全，若加入硅胶悬浊液过多，则影响后面的漂洗，造成盐离子污染。
优选为，所述纯化过程的离心力为13200rpm。
优选为，所述纯化过程的乙酸钠溶液浓度为3mol/L，pH值为5.2。
与现有技术相比，本发明的突出优点如下：
1.本发明使用了用于壳斗科植物DNA提取的专用漂洗液，并且该专用漂洗液需在裂解细胞核之前加入，并反复清洗，从而利用多糖多酚等次生代谢物主要存在于细胞质中与DNA相互隔离这一性质，通过离心，将细胞质中的大多数多糖多酚与细胞核分离开；
2.本发明提供了一种专用漂洗液，该专用漂洗液具有以下优点：
第一、加入的Triton-X 100能有效去除因叶片老化、发黄导致的色素污染，使DNA无色，且能去除细胞中的蛋白；
第二、加大了pvp与β-mercatoeyhanol的浓度，且加入了抗氧化剂L-AscorbicAcid，防止多酚污染、DNA褐化，从而得到高质量的DNA；
3.利用本发明的提取和纯化方法从壳斗科植物新鲜叶片或硅胶干燥叶片或标本中获得的DNA的纯度及产率都明显高于普通方法获得的DNA，符合下游实验的要求；
4.本发明的用于壳斗科植物样品中提取的DNA的硅胶吸附纯化方法，利用硅胶粉在高盐环境下能特异性吸附DNA的性质，自制了硅胶吸附液，操作简单、成本低，而且可有效去除多糖多酚等杂质，并且去除色素污染十分有效，回收的产率也适中，能满足下游PCR及酶切实验；
5.本发明还可以用于从保存年代较久、数量有限的植物标本样品中高效提取高纯度DNA。由于标本压制是一个缓慢失水的过程，DNA大量降解，含量低，提取过程中DNA易断裂，褐化。本发明的专用漂洗液中加入的抗氧化剂、表面活性剂特别适合缓解提取植物标本时因氧化而产生的严重褐化以及色素污染，搭配后续的硅胶吸附纯化法，更能解决多糖多酚污染；并且在核酸裂解前进行杂质漂洗，可以除去因杀虫、除菌剂等带来的化学干扰，防止这些物质与核酸反应，降解DNA；本发明提取DNA所需的样品量较少，得率可观，提取一次足以用于后续的分子实验，特别适合于标本数量有限的特点。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1-3中不同方法提取的壳斗科植物叶片的DNA电泳结果；
图中从左到右依次为：Os-F：刺叶栎鲜样，Qa-F：麻栎鲜样，Cg-F：青冈鲜样，Td-F：三棱栎鲜样，Lt-F：木姜叶柯鲜样，Cs-F：苦槠鲜样，M(Marker)：λ-HindIIIdigestmarker，来自Takara，Os-D：刺叶栎硅胶干燥样，Qa-D：麻栎硅胶干燥样，Cg-D：青冈硅胶干燥样，Td-D：三棱栎硅胶干燥样，Lt-D：木姜叶柯硅胶干燥样，Cs-D：苦槠硅胶干燥样；
图中从上到下依次为：A：常规CTAB法，B：本发明改良的CTAB法，C：Kumar等(2012)法，D：Rezadoost等(2016)法；
图2为本发明实施例2中不同保存年份提取的壳斗科植物标本的DNA电泳结果；
图中从左到右依次为：Ca-0.5：保存半年麻栎标本，Qa-0.5：保存半年青冈标本，Ca-2：保存2年麻栎标本，Qa-2：保存2年青冈标本，Ca-5：保存5年麻栎标本，Qa-5：保存5年青冈标本；M(Marker)：λ-HindIII digest marker，来自Takara；
图3为本发明实施例1和对比例1-3中不同方法提取的总DNA的PCR扩增结果；
其中，F：苦槠新鲜叶片提取的DNA；D：苦槠硅胶干燥叶片提取的DNA；R：Rezaoodst等(2017)法；O：常规CTAB法；K：Kumar等(2012)法；C：本发明改良的CTAB法；M：DL1000；
图4为本发明实施例2中不同保存年份提取的植物标本总DNA的PCR扩增结果；
其中，Ca-0.5：保存半年麻栎标本，Qa-0.5：保存半年青冈标本，Ca-2：保存2年麻栎标本，Qa-2：保存2年青冈标本，Ca-5：保存5年麻栎标本，Qa-5：保存5年青冈标本；M：DL1000；
图5为本发明实施例1和对比例1-3中不同方法提取的总DNA的酶切效果图；
其中a排均为苦槠硅胶干燥叶片提取的DNA，b排均为苦槠鲜样叶片提取的DNA，R：Rezaoost等(2016)法；O：常规CTAB法；K：Kumar等(2012)法；C：本发明改良的CTAB法；M：Lambda-HindIII marker；
图6为本发明实施例2中不同保存年份提取的植物标本总DNA的酶切效果图；
其中，Ca-0.5：保存半年麻栎标本，Qa-0.5：保存半年青冈标本，Ca-2：保存2年麻栎标本，Qa-2：保存2年青冈标本，Ca-5：保存5年麻栎标本，Qa-5：保存5年青冈标本；M：DL1000；
图7、图8为本发明实施例3中硅胶吸附纯化后的DNA电泳检测图；
其中，F：苦槠新鲜叶片提取的DNA；D：苦槠硅胶干燥叶片提取的DNA；R：Rezadoostet al.(2016)法；O：常规CTAB法(Murray and Thompson 1980)；K：Kumar et al.(2012)；C：本发明改良的CTAB法；M：Lambda-HindIII marker，Takara；Ca-0.5：保存半年麻栎标本，Qa-0.5：保存半年青冈标本，Ca-2：保存2年麻栎标本，Qa-2：保存2年青冈标本，Ca-5：保存5年麻栎标本，Qa-5：保存5年青冈标本；M：Lambda-HindIII marker，Takara；
图9为本发明测试3的纯化后的总DNA的酶切效果图；
其中，F：苦槠新鲜叶片提取样，D：苦槠硅胶干燥叶片提取样，R：Rezaoost等(2016)法，O：常规CTAB法，K：Kumar等(2012)法，C：本发明改良的CTAB法，M：Lambda-HindIIImarker。
具体实施方式
本发明提供一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法。
目前，由于壳斗科植物叶片富含多糖多酚类物质，提取可用于二代测序的高质量DNA十分困难，而从保存年代较长的干燥植物标本叶片提取DNA更无相关报道。
本发明公开了一种用于壳斗科植物标本叶片DNA的提取和纯化方法，本发明所述的用于植物DNA提取的专用漂洗液效果较好，在细胞核裂解之前，加入含有抗坏血酸、Triton-X 100等的专用漂洗液，不仅能有效去除多糖多酚等杂质，使得到的DNA不再粘稠，还能有效去除色素污染，所提取的DNA纯度高、产率大，相比核裂解之后进行除杂的效果更优，适于后期分子实验的应用。进一步采用硅胶粉自制硅胶吸附液可有效纯化并获得高纯度DNA，能满足下游PCR及酶切实验。本方法克服了传统CTAB法和试剂盒在壳斗科植物提取中的困难，可用于提取壳斗科新鲜叶片、硅胶干燥样及保存年代较长的干燥植物标本叶片的DNA，用于高通量测序。
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供的刺叶栎、麻栎、青冈、木姜叶柯、苦槠、三棱栎的硅胶干燥叶片和新鲜叶片的DNA提取过程如下：
(1)新鲜叶片和硅胶干燥叶片均剪取2×2cm方块，在液氮中研磨成粉末，用于DNA提取；
(2)在研磨好的粉末中加入1ml专用漂洗液(2％PVP，1％L-Ascorbic Acid，3％Triton-X 100，4％β-mercatoeyhanol)，震荡，10000rpm离心1min，弃上清(如上清液粘稠，则重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线)；
(3)加入800μL、60℃预热的2％CTAB提取液(2％CTAB(m/v)，1.4M NaCl，100mMTris-HCl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，10％(w/v)N-Lauroylsarcosine Sodium salt，1.4％β-mercatoeyhanol，50mg RNase A)，置于60℃水浴40min，每5min上下翻转轻轻混匀；
(4)稍冷却后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，12000rpm离心10min；
(5)取上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)混匀后，12000rpm离心10min；
(6)取上清液于新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)、双倍体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30min，13000rpm离心15min，4℃离心；
(7)去上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于50μL1x TE，即得样品DNA。
实施例2
本实施例提供的麻栎，青冈的保存半年的标本，保存2年的标本以及保存5年的标本的DNA提取过程如下：
(1)新鲜叶片和硅胶干燥叶片均剪取3x 3cm方块，在液氮中研磨成粉末，用于DNA提取；
(2)在研磨好的粉末中加入1ml专用漂洗液(4％PVP，2％L-Ascorbic Acid，4％Triton-X 100，5％β-mercatoeyhanol)，震荡，10000rpm离心1min，弃上清(如上清液粘稠，则重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线)；
(3)加入1ml、60℃预热的4％CTAB提取液(4％CTAB(m/v)，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，10％(w/v)N-Lauroylsarcosine Sodium salt，3％β-mercatoeyhanol，50mg RNase A)，置于60℃水浴1h，每5min上下翻转轻轻混匀；
(4)稍冷却后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，12000rpm离心15min；
(5)取上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)混匀后，12000rpm离心10min；
(6)取上清液于新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)、双倍体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30min，13000rpm离心15min，4℃离心；
(7)去上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于50μL1x TE，即得样品DNA。
对比例1
采用传统CTAB法提取刺叶栎、麻栎、青冈、木姜叶柯、苦槠、三棱栎的硅胶干燥叶片和新鲜叶片的DNA，采用的样本与实施例1相同。具体提取过程如下：
(1)新鲜叶片和硅胶干燥叶片均剪取2x 2cm方块，在液氮中研磨成粉末，用于DNA提取；
(2)在研磨好的粉末中加入800μL已预热至60℃的CTAB裂解液(100Mm Tris-HCIpH 8.0，3％CTAB，25mM EDTA pH 8.0，3％PVP，2％β-mercatoeyhanol)，于60℃保温40min，其间每5min轻轻混匀；
(3)稍冷却后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，12000rpm离心10min；
(4)取上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)混匀后，12000rpm离心10min；
(5)取上清液于新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，双倍体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30min，13000rpm离心15min，4℃离心；
(6)去上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于50μL1x TE，而后加入2μL RNase轻轻混匀后置于37℃温育1h，即得样品DNA。
对比例2
采用Kumar等(Kumar，S.S.，T.Muthusamy and K.Kandasamy(2012).DNAExtraction Protocol for Plants with High Levels of Secondary Metabolites andPolysaccharides without Using Liquid Nitrogen and Phenol.Ism MolecularBiology 2012(4).doi：10.5402/2012/205049)中提供的方法提取刺叶栎、麻栎、青冈、木姜叶柯、苦槠、三棱栎的硅胶干燥叶片和新鲜叶片的DNA，采用的样本与实施例1相同。具体提取过程如下：
(1)将研磨的叶片粉末转移到2ml离心管中并加入2倍体积的提取混合液(50mMEDTA pH 8.0，120mM Tris-HCl pH 8.0，1M NaCl，0.5M Sucrose，2％Triton-X 100，4％β-mercatoeyhanol)，混匀；
(2)60℃水浴40min，期间不断颠倒轻轻混匀，室温10000rpm离心15min；
(3)将上清转移到新的离心管中，加入1.5ml CTAB提取液(20mM EDTA pH 8.0，100mM Tris-HCl pH 8.0，1.5M NaCl，2％CTAB，2％β-mercatoeyhanol)，60℃水浴50min，期间不断颠倒轻轻混匀，室温12000rpm离心15min，小心转移上清至新的2ml离心管；
(4)稍冷却后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，12000rpm离心10min；
(5)取上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)混匀后，12000rpm离心10min；
(6)取上清液于新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，双倍体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30min，13000rpm离心15min，4℃离心；
(7)去上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于50μL1x TE，而后加入2μL RNase轻轻混匀后置于37℃温育1h，即得样品DNA。
对比例3
采用Rezadoost(Rezadoost，M.H.，M.Kordrostami and H.H.Kumleh(2016).Anefficient protocol for isolation of inhibitor-free nucleic acids even fromrecalcitrant plants.Biotech 6(1)：61.doi：10.1007/s13205-016-0375-0)提供的方法提取刺叶栎、麻栎、青冈、木姜叶柯、苦槠、三棱栎的硅胶干燥叶片和新鲜叶片的DNA，采用的样本与实施例1相同。具体提取过程如下：
(1)在研磨后的粉末中加入800μL提取液I(200mM Tris-HCI pH 8.0，1.4M NaCl，0.5％Triton X-100，3％CTAB，1％PVP，2％β-mercatoeyhanol)，震荡，置于60℃水浴40min；
(2)加入800μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈震荡2min，10000rpm，常温离心15min；
(3)取上清于新的离心管，加入1/2体积提取液II(50mM Tris-HCl pH 8.0，2Mguanidinethiocyanate，2％β-mercatoeyhanol，0.2mg/ml Proteinase K)，置于40℃水浴15min；
(4)加入等体积的氯仿异戊醇(24∶1)，震荡2min，10000rpm离心15min；
(5)取上清，加入1/2体积的4M NaCl，混匀并放置冰上静置5min；加入2倍体积的预冷异丙醇，-20℃放置30min，11000rpm离心15min，4℃离心；
(6)去上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇加速脱水，晾干后溶于50μL1x TE，而后加入2μL RNase轻轻混匀后置于37℃温育1h，再次采用醋酸钠沉淀后，溶于50μL1x TE中待检。
测试1
上述实施例1，实施例2和对比例1-3提取的植物DNA的琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测量DNA质量比较详见下。
DNA核酸电泳检测：取5μL总DNA，采用0.8％的琼脂糖凝胶(溴化乙锭)电泳，在紫外光下检测DNA质量。
总DNA的纯度检测：取1μL总DNA样品于Nanodrop 2000分光光度计进行紫外分光光度计检测，测定DNA在波长260与280nm处的吸光度值，根据OD260/OD280的比值计算DNA的纯度。
总DNA浓度定量检测：取1μL总DNA样品加入100μL含Hoechst 33258荧光染料的分析液，经小牛DNA标准样校准后，采用Promega QuantiFluorTM Handheld FluorometersE6090荧光分光光度计定量检测核酸浓度。
以上测试的结果见图1，图2，表1，表2。表1为实施例1和对比例1-3中方法提取的DNA的产率和纯度。表2为实施例2中方法提取的标本DNA的产率和纯度。
从图1和表1中可以看出，传统CTAB法和Rezadoost法不能从上述所有样品中成功提取出DNA，且紫外分光光度计检测结果表明提取的DNA纯度较差，有明显的色素污染，DNA粘稠，有明显的多糖污染。而Kumar法虽然能成功提取出DNA，且DNA的纯度也较好，但是产量较低，耗时长，操作复杂。相对地，本发明的提取和纯化方法能够从上述所有样品中成功提取出DNA，且DNA的纯度和产量都较好，而且产量高、耗时低、操作简单。从图2和表2中可以看出，利用本发明的提取和纯化方法可以从植物标本中提取出DNA，保存不同年份的标本虽有少许降解，但都能得到DNA条带，且除糖除酚效果较好，随着标本的存放时间越久，DNA降解越多，且DNA含量越少，通过本方明提取保存5年的标本仍然可以得到DNA条带，虽然含量较低，但足以用于后面的实验。
表1
表2
测试2
上述实施例1，实施例2和对比例1-3的方法提取的植物DNA的PCR扩增检测和限制性内切酶检测。
以上述实施例1，实施例2和对比例1-3中不同提取方法提取的苦槠新鲜叶片和硅胶样品的总DNA作为模板，采用psbA-trnH(Shaw，Lickey et al.2005)以及ITS1-ITS2(Bellarosa，Simeone et al.2005)进行PCR扩增，对DNA质量进行评估。
PCR扩增反应均采用20μL反应体系来进行，psbA-trnH扩增体系包括模版DNA(10ng/μL)2μL、引物(10ng/μL)0.2μL、dNTP(25mM)1μL、10x buffer(含15mM MgCl2)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、加超纯水至20μL。
ITS反应体系包括模板DNA(10ng/μL)2μL、引物(10ng/μL)0.3μL、dNTP(25mM)1μL、10x buffer(含15mM MgCl2)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、加超纯水至20μL。
PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。
扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色检测。
以上述实施例1，实施例2和对比例1-3中不同提取方法，提取苦槠新鲜叶片和硅胶样品的总DNA作为模板，然后用3种酶EcoR I(Takara，青岛)、HindIII(Takara，青岛)、Taq I(生工，上海)进行酶切。
EcoR I的酶切反应总体积为20μL(10x H buffer 2μL，EcoR I 1μL，DNA 200ng，加超纯水至20μL)，于37℃酶切消化2h；
HindIII的酶切反应总体积为20μL(10x M buffer 2μL，HindIII 1μL，DNA 200ng，加超纯水至20μL)，于37℃酶切消化2h；
Taq I酶切反应总体积为20μL(10x BS-buffer Y 2μL，Taq I 1μL，BSA 1μL，DNA200ng，加超纯水至20μL)，于65℃酶切消化2h。
酶切产物采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
以上实验结果如图3～图6所示。
图3、图4的PCR结果证明本方法提取的样品均能获得丰富清晰的扩增条带，虽然提取的标本样品获得的扩增条带较弱，但都成功获得扩增条带。而传统CTAB法和Rezadoost法提取的总DNA中仍含有较多的杂质，影响下游扩增结果。图5、图6的酶切实验结果证明本发明的提取和纯化方法提取的壳斗科植物基因组DNA3种酶酶切后条带呈均匀的弥散状，酶切效果良好。表明本方法提取的壳斗科植物基因组DNA符合下游实验的要求。
实施例3
上述实施例1和对比例1-3的方法提取的植物总DNA挑选硅胶样与鲜样各1个，以及实施例2的植物标本总DNA，通过硅胶吸附核酸方法进行纯化，具体步骤如下：
(1)称取硅胶(silica)粉0.8g，加入超纯水震荡混匀，静置15min，13200rpm离心30s后除去上清液(重复上述步骤3次)；在洗过3次的硅胶粉中加入超纯水约2.5ml，配成了硅胶悬浊液(liquid silica stock；LSK)，混匀LSK，分装100μL至各管；
(2)取1管LSK，加入1ml超纯水，震荡混匀，13200rpm离心20s，弃上清；
(3)往LSK中加入700μL 6M碘化钾(KI)，震荡混匀，加入50μLDNA(DNA约100ng/μL)，置于小型摇床上室温混匀15min，13200rpm离心3min；
(4)弃上清，加入500μL硅胶漂洗缓冲液(wash buffer for silica：1ml 5M NaCl+99ml 95％酒精)，震荡混匀，13200pm，常温下离心3min，复重此步骤3次；
(5)沉淀用无水乙醇漂洗，而后弃无水乙醇，将沉淀晾干，加入1x TE，37℃温育10min后于13200rpm离心3min，将上清转移至新的离心管中；
(6)在离心管中加入3M NaAc，双倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃静置30min，4℃，11000rpm离心15min；
(7)去上清，得到的沉淀用-20℃预冷的75％酒精清洗3次，最后用无水乙醇加速脱水，晾干，加入1x TE进行溶解，即得到纯化后的总DNA。
DNA的琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测量方法同测试1，结果见图7、图8和表3。表3是硅胶粉吸附纯化后的DNA产率和纯度。
可以看出4种方法提取的DNA经硅胶粉吸附纯化后，所获DNA条带清晰、完整性较好、OD260/OD280也显示在1.77-1.83之间，基本无多糖多酚蛋白污染，纯度高。通过此方法纯化后的DNA均能有效去除色素污染。
但本发明的提取纯化方法和常规CTAB法所得DNA产率较大，故纯化后的产率相较于另外两种方法产率也大。由于标本提取的DNA产量没有鲜样，硅胶样的产量大，故纯化后的样品产量也较小。
表3
测试3
经过实施例3的硅胶粉吸附纯化步骤后不同配方的DNA的酶切检测方法同测试2，结果见图9。
图9中可以看出，经过硅胶粉吸附纯化后不同配方的DNA在酶切时效率有明显改善。除Rezadoost方法从新鲜叶片中提取的DNA在酶切后仍有微弱的主带，酶切不完全之外，其他方法经过硅胶粉吸附纯化后，DNA酶切均成弥散状，适用于后续的分子生物学研究。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims (10)

1.一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉；
(2)加入专用漂洗液，震荡离心后弃上清，重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线；所述专用漂洗液主要包括如下有效组分：2％～4％PVP，1％～2％L-AscorbicAcid，2％～4％Triton-X 100，4％～5％β-mercatoeyhanol；
(3)加入预热的CTAB提取液，60℃～65℃水浴40～60分钟，每5～10分钟颠倒混匀一次；
(4)室温放置冷却2～3分钟后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，离心；
(5)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，离心；
(6)取上清，加入1/10～1/5体积的3M～4M醋酸钠、双倍以上体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30～50min，4℃离心；
(7)去上清，用预冷的75％～80％酒精洗涤沉淀，无水乙醇加速脱水，管口倒置后，晾干，加入TE缓冲液溶解，即得植物基因组DNA；
(8)取植物基因组DNA，通过硅胶粉吸附方法纯化，即得纯化后的植物总DNA。
2.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述硅胶粉吸附方法纯化的步骤如下：
(1)称取硅胶粉，加入超纯水震荡混匀，静置，离心30s～1min后除去上清液，重复此步骤多次；
(2)在洗过多次的硅胶粉中加入超纯水，配成硅胶悬浊液并混匀，分装至各管；
(3)取1管硅胶悬浊液，加入1ml～2ml超纯水，震荡混匀，离心20s～30s，弃上清；
(4)往硅胶悬浊液中加入5M～6M碘化钾，使溶液中的碘化钾最终浓度为4mol/L，配成硅胶吸附液，震荡混匀，加入DNA，室温置于小型摇床上混匀10～15min，离心3～5min；
(5)弃上清，加入硅胶漂洗缓冲液，震荡混匀，离心3～5min，重复此步骤3次；
(6)沉淀用无水乙醇漂洗，将沉淀晾干，加入TE缓冲液，37℃温育10～15min后离心3～5min，将上清转移至新的离心管中；
(7)在离心管中加入3M～4M乙酸钠，多倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃静置后，4℃离心；
(8)去上清，得到的沉淀用-20℃预冷的75％～80％酒精清洗3～5次，最后用无水乙醇加速脱水，晾干，加入TE缓冲液进行溶解，即得到纯化后的总DNA。
3.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述专用漂洗液在裂解细胞核之前加入，并反复清洗。
4.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述的CTAB提取液包括如下组分：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2M NaCl，100mM～120mM Tris-HClpH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，10％～15％(w/v)N-Lauroylsarcosine Sodium salt，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，10mg/μl RNase A；
所述的CTAB提取液现配现用；所述的CTAB提取液具体配制方法如下：
配置CTAB母液，所述CTAB母液包括：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2MNaCl，100mM～120mMTris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；
配置裂解液，所述裂解液包括：10％～15％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐，100mM～120mMTris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；
配置所述CTAB提取液，所述CTAB提取液包括：CTAB母液∶裂解液＝10∶1，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，5～8μl 10mg/μl RNase A。
5.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C加入的量为每1g样品加入0.6g。
6.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述提取过程中的离心力为10000rpm～12000rpm。
7.根据权利要求2所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述硅胶悬浊液与加入DNA量为2∶1～2.5∶1，DNA得率为100～150ng/μl。
8.根据权利要求2所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述硅胶漂洗缓冲液包括如下组分：每100ml漂洗液包含1ml 5MNaCl+99ml 95％酒精。
9.根据权利要求2所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述纯化过程中的离心力为13200rpm。
10.根据权利要求2所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述纯化过程的乙酸钠溶液浓度为3mol/L，pH值为5.2。
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