CN105368818B

CN105368818B - 一种适于茄果类主要蔬菜的高效、快速dna提取方法

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Publication number: CN105368818B
Application number: CN201510916592.6A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 高莉洁; 任丽; 陈火英; 周腾夏; 李想; 陈杭
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: CN105368818A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适于茄果类主要蔬菜的高效、快速DNA提取方法。本发明首先提供了一种改良DNA提取缓冲液，每1000ml所述改良DNA提取缓冲液中含有焦亚硫酸钠10～30g。采用所述改良DNA提取缓冲液提取植物DNA时，DNA提取获得率是其他传统方法的二至三倍，并且仅需其他传统方法的三分之一到三分之二时长即可，获得的DNA质量完全能满足PCR的需求。

Description

一种适于茄果类主要蔬菜的高效、快速DNA提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改良DNA提取缓冲液及其制备与应用。

背景技术

DNA是储存遗传信息的载体。在生物学的研究中，获得高质量的DNA尤为重要。现在已经发表的植物基因组DNA提取方法已有多种。目前，研究者最常用的方法为CTAB法、试剂盒法和SDS法。但CTAB法、试剂盒法和SDS法在进行植物基因组DNA提取的过程中有步骤多、操作繁琐、耗时、使用高毒试剂等缺点。在需要获得大量DNA样品的实验中，DNA的提取就成了难题。

因此，一种高效、快捷、低成本、较无害的DNA提取方法对于需要大量提取植物DNA进行研究的研究者来说，就显得尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种改良DNA提取缓冲液及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种改良DNA提取缓冲液，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钠10～30g。

优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钠10～20g。更优选，20g。

进一步优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中还含有Tris-HCl 200mmol、NaCl250mmol、EDTA 25mmol、SDS 5g。

优选地，所述DNA提取缓冲液的溶剂为水。所述Tris-HCl的pH为7.5。

本发明的第二方面，提供了前述改良DNA提取缓冲液的制备方法，亦即将各组分按配比混合即可。

本发明的第三方面，提供了前述改良DNA提取缓冲液在植物DNA提取中的用途。

本发明的第四方面，提供一种植物DNA提取方法，所述方法采用前述改良DNA提取缓冲液来提取植物DNA。

优选地，所述方法，包括如下步骤：

(5)将新鲜的植物组织洗净、吸干，加入改良DNA提取缓冲液，研磨；

(6)将步骤(1)中研磨获得的样品水浴，加冰醋酸钾，震荡摇匀，离心，保留上清液；

(7)在步骤(2)获得的上清液中加入异丙醇，离心，取沉淀；

(8)在步骤(3)获得的沉淀中加入乙醇，放置足够时间，将乙醇倒出，加入适量TE或ddH₂O溶解，保存即可。

优选地，步骤(1)中，所述植物组织为植物的叶子。

优选地，步骤(1)中，所述植物选自茄果类。更优选地，所述植物选自番茄、黄瓜、茄子之任一。

优选地，步骤(1)中，每0.07-0.1g植物组织添加1ml的改良DNA提取缓冲液。

优选地，步骤(1)中，每1000ml所述改良DNA提取缓冲液中含有焦亚硫酸钠10～30g。

更优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钠20g。

优选地，所述Tris-HCl的pH为7.5。

优选地，步骤(4)中，采用70％乙醇。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

茄果类植物DNA提取中由于褐色多酚类化合物的存在易出现变色现象，为避免这种褐化影响后续的实验结果，本发明所采用的改良后的SDS法在提取缓冲液中加入1-3％(W/V)的焦亚硫酸钠，以助于除去多酚类杂质。同时，在提取DNA的过程中，本发明的改良法较传统SDS法省去了加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)这一步骤，仅留下加入等体积异丙醇这一步骤，以保证DNA析出。传统SDS法中加氯仿：异戊醇(24:1)，主要目的是提苯酚、快速分层、去气泡，但改良法在提取液内加入1-3％(W/V)的焦亚硫酸钠时就已经起到了去多酚杂质的作用。同时，改良法省去加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)这一步骤，不但避免了人体接触氯仿和异戊醇这种剧毒试剂，也节约了时间和耗材。经后续实验证明此改良法的DNA提取获得率是其他传统方法的二到三倍，并且仅需其他传统方法的三分之一到三分之二时长即可，获得的DNA质量完全能满足PCR的需求。

附图说明

图1：三种方法提取DNA所用时间比较(min)。

图2：不同提取方法获得的DNA在琼脂糖上的检测结果，其中，M：DL2000marker；1-5：CTAB法提取的DNA；6-10：试剂盒法提取的DNA；11-15：本发明改良SDS法提取的DNA。

图3：利用SSR标记进行番茄杂交种纯度检测的结果图。

图4：利用SSR标记进行茄子杂交种纯度检测的结果图。

图5：利用SSR标记进行黄瓜杂交种纯度检测的结果图。

图6：以番茄为模板，采用本发明改良SDS法，以1％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液以及3％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液提取DNA，每个方法有5组平行样品，得到的DNA溶液在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳所得结果分别如左列1-5和右列6-10两组所示，DNA条带清晰，DNA质量符合要求，M：DL2000marker。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如样品水浴、DNA用70％的乙醇洗涤、DNA用TE溶解并保存、琼脂糖电泳等过程。

实施例1

以番茄为模板，用CTAB法(方法一)、试剂盒法(方法二)和本发明改良SDS法(方法三)分别提取5份样本的DNA。

其中，CTAB提取方法(方法一)所用到的化学试剂包括：

氯仿：异戊醇(24：1)；异丙醇；75％乙醇；CTAB；NaCl；EDTA-Na₂·2H₂O；Tris；冰乙酸；硼酸；β-巯基乙醇；NaAc；氯仿(三氯甲烷)；异戊醇；无水乙醇；溴酚蓝；琼脂糖；蔗糖；溴化乙锭(EB)；RNase、NaOH；HCl(浓)；ddH₂O；提取缓冲液(0.35M Glucose、Tris.HCl、Na.EDTA、2％PVP、1％(V/V)β-Me、ddH2O)(冰浴)【用前加β-巯基乙醇】、裂解缓冲液65℃(水浴)(1.4M NaCl、0.1M Tris.HCl、20mM Na.EDTA、2％CTAB、2％PVP、1％(V/V)β-Me、ddH2O)。

具体实验方法包括如下步骤：

(1)取100mg鲜嫩的叶子，放入研钵中加入液氮进行研磨，直至粉碎；转移到2mL的离心管中；

(2)向PE管中加入800μL的提取缓冲液(使用前先冰浴10min并用震荡机混匀)；离心4℃，10000r，15min；

(3)弃上清液，加入800μL裂解缓冲液；牙签搅拌混匀；65℃水浴30-40min，同时每10min充分摇匀一次；

(4)加入等体积氯仿异戊醇(24：1)800uL；颠倒摇匀50次；离心4℃，10000r，15min；吸上清液转移至1.5mL的离心管中；加入异丙醇(600μL，至少30min)；沉淀析出，静置；离心4℃，10000r，10min；倒掉离心管中的溶液；

(5)加75％乙醇，洗涤3min；倒出乙醇；通风橱中风干；

(6)加入100μLTE溶解稀释。4℃保存。

其中，试剂盒提取方法(方法二)所用到的试剂包括：

Ezup柱式植物基因组DNA试剂盒(上海生物工程有限公司)：纯化套件(吸附柱+收集管)，Buffer PCB，Buffter BD，18mL的PW Solution(concentrate)用前加入12mL异丙醇，15mL的Wash Solution(concentrate)中加入45mL无水乙醇，TE Buffer(pH 8.0)。

具体实验方法包括如下步骤：

(1)将100mg的新鲜叶片在液氮中充分研磨成粉末，并转移至2mL的离心管中；

(2)加入600μL 65℃预热的Buffer PCB和12μLβ-巯基乙醇；震荡混匀，放入65℃水浴25min，当中需要每隔8min混匀一次；

(3)等到移出的样品冷却至室温之后，加入与样品等体积的氯仿(约600μL)，颠倒混匀；12000r，离心5min；吸取上清液转移至一个干净的1.5mL的离心管中；

(4)加入等体积的Buffer BD，颠倒混匀3-5次；再加入等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温下静置2min；1000r离心1min，倒掉收集管中的液体；将吸附柱放回收集管中，加入500μLPW solution，10000r离心1min，倒掉收集管中液体；将吸附柱放回收集管中，12000r，离心2min；

(5)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入200μLTE Buffer，静置3min，12000r，离心2min；

(6)将得到的DNA溶液放置于-20℃中保存。

其中，本发明改良SDS提取方法(方法三)，包括如下步骤：

(1)取70mg新鲜叶片放入2mL的离心管中，每个管中放入2粒3mm的钢珠，并加入1000μL用含2％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液(亦即，每1000ml所述SDS提取缓冲液中含焦亚硫酸钠20g、Tris-HCl(pH7.5)200mmol、NaCl 250mmol、EDTA 25mmol、SDS 5g)，研磨仪研磨2min(60Hz)；

(2)研磨后的样品放入65℃的水浴锅中，水浴30-40min；加冰的醋酸钾300μL，震荡摇匀；14000转离心15min；将离心后所得样品的上清液取700μL，转移到一个新的1.5mL的离心管内；

(3)在新的样品内加入等体积(700μL)的异丙醇溶液，静置1-2min，轻轻混匀；将样品放入离心机内离心5min(离心管底部出现白色透明沉淀)，同时离心管内的液体尽数倒出；

(4)在离心管内加入700μL的70％乙醇，放置3min；将PE管内的乙醇倒出；

(5)在通风橱内通风吹干，加200μL TE溶解，4℃保存。

首先，进行上述三种方法提取DNA的耗时比较：

如图1所示，方法一提取DNA为18个步骤，时长3小时左右；方法二提取DNA为14个步骤，时长在1.5小时左右；方法三提取DNA步骤为10个步骤，时长为1小时左右。由此可见，本发明的方法三提取DNA所需步骤最少，用时最短，仅需其他传统方法的三分之一到三分之二时长即可。

再次，采用琼脂糖凝胶电泳方法对上述三种方法提取DNA的质量进行检测：

以番茄为模板，用上述方法一、方法二和方法三分别提取5份样本的DNA，将用三种方法提取得到的DNA溶液在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳。由图2电泳结果可知，三种方法得到的DNA条带清晰，DNA质量符合要求。当采用1％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液(亦即，每1000ml所述SDS提取缓冲液中含焦亚硫酸钠10g、Tris-HCl(pH7.5)200mmol、NaCl250mmol、EDTA 25mmol、SDS 5g)以及3％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液(亦即，每1000ml所述SDS提取缓冲液中含焦亚硫酸钠30g、Tris-HCl(pH7.5)200mmol、NaCl 250mmol、EDTA 25mmol、SDS 5g)来作为改良SDS提取方法中的SDS提取缓冲液时，得到的DNA溶液在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳所得结果如图6所示，DNA条带清晰，DNA质量符合要求。

此外，还采用分光光度计法进行DNA质量检测：

以番茄为模板，用CTAB法(方法一)、试剂盒法(方法二)和改良SDS法(方法三)分别提取5份样本的DNA，提取得到的DNA溶液各取1μL在NanoDrop 2000超微量分光光度计上检测纯度和质量。由表1、表2、表3可知，方法一、二和三提取获得的DNA检测后A260/A280为1.92-2.07、1.98-2.12、1.83-2.11，说明三种方法得到的DNA除有轻微的RNA污染外均符合要求。同时，C(C＝获得的DNA的总质量/叶片的总质量)，计算平均值可知，C1＝100.3ng/mg；C2＝116.45ng/mg；C3＝267.05ng/mg，所以C3＞C2＞C1，说明用方法三提取DNA获得率最高，分别为方法一的2.66倍，为方法二的2.29倍。

表1方法一提取得到的番茄DNA质量检测结果

表2方法二提取得到的番茄DNA质量检测结果

表3方法三提取得到的番茄DNA质量检测结果

本实施例还采用茄子和黄瓜作为模板，分别采用上述三种方法，提取DNA，结果得到类似的结论。

此外，本发明还采用1％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液(亦即，每1000ml所述SDS提取缓冲液中含焦亚硫酸钠10g、Tris-HCl(pH7.5)200mmol、NaCl 250mmol、EDTA25mmol、SDS 5g)以及3％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液(亦即，每1000ml所述SDS提取缓冲液中含焦亚硫酸钠30g、Tris-HCl(pH7.5)200mmol、NaCl 250mmol、EDTA25mmol、SDS 5g)来作为改良SDS提取方法中的SDS提取缓冲液，均获得了类似于2％(W/V)焦亚硫酸钠的SDS提取缓冲液良好的提取效果。

实施例2

本实施例分别以番茄、茄子和黄瓜作为模板，采用同实施例1中的方法三DNA提取方法提取获得DNA并对所得DNA进行杂交种纯度检测。

对所获得的DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系及程序如下：扩增体系总体积20μL；前引物和后引物各约0.2μM，DNA模板约40ng，1U Taq DNA聚合酶，0.4mM dNTPs，5mMMgCl₂，1×Taq buffer，剩余部分用水补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，1个循环；16℃保存。

番茄所用SSR引物及其序列：

茄子所用SSR引物及其序列:

黄瓜所用SSR引物及其序列:

然后利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行SSR杂交种纯度检测，PCR结束后，Marker和扩增产物(加2μL 6×loading buffer变性染料在常温下变性30min后)，在8％聚丙烯酰胺变性胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，上样量为1.4μL。凝胶电泳在EC4000P电泳仪上进行,恒定功率150W，电泳3h左右。电泳结束后，将胶板用银染方法显影。

将用方法三改良法提取得到的番茄、茄子和黄瓜的DNA用相应的引物PCR扩增后进行聚丙烯凝胶电泳。如图3、图4和图5所示，P₁和P₂亲本扩增出的条带清晰可见，父母本间多态差异明显；F₁杂种均扩增出双亲带型，可进行杂种纯度鉴定。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种茄果类植物DNA提取方法，包括如下步骤：(1)将新鲜的植物组织洗净、吸干，加入改良DNA提取缓冲液，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钠10～30g、Tris-HCl 200mmol、NaCl 250mmol、EDTA 25mmol、SDS 5g，所述Tris-HCl的pH为7.5，研磨；(2)将步骤(1)中研磨获得的样品水浴，加冰醋酸钾，震荡摇匀，离心，保留上清液；(3)在步骤(2)获得的上清液中加入异丙醇，离心，取沉淀；(4)在步骤(3)获得的沉淀中加入乙醇，放置足够时间，将乙醇倒出，加入适量TE或ddH₂O溶解，保存即可。

2.根据权利要求1所述的茄果类植物DNA提取方法，其特征在于，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钠10～20g。

3.根据权利要求1所述的茄果类植物DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述茄果类植物选自番茄、黄瓜、茄子之任一。