CN104531679A - 从干燥杏叶片中提取dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物DNA制备技术领域，涉及一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法。首先进行叶片中次生代谢物质的抽提，用预冷缓冲浸提液对碾磨好的干杏叶冰浴、离心、弃上清，反复浸提数次，可将杏叶中多糖、多酚、酯类等次生代谢物在DNA释放前将其除去，防止与DNA形成复合体；在液氮碾磨和缓冲浸提液处理时，加入适量PVP-40T，保护DNA免受氧化,促进了细胞裂解,使其释放更多的DNA；加入适量RNA酶的操作置于细胞裂解后，除去了RNA，同时将引入的蛋白酶除去；采用改良CTAB法，用适量苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，除去大量蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。与常用方法相比，本发明成本低廉。

Description

从干燥杏叶片中提取DNA的方法

技术领域

本发明属于植物总DNA制备技术领域，具体涉及一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法。

技术背景

在野外采集的植物叶片要经过长距离运输和保存，不论幼嫩的叶片或成熟的叶片通过硅胶干燥后，虽叶片迅速失水，但在植物叶片组织中还含有大量的多糖、多酚、蛋白和酯类等植物次生代谢产物及降解的DNA，这使得提取DNA的产率、质量和难易程度与用新鲜叶片材料提取有着很大的差异。

DNA是遗传信息的载体、是植物的基本遗传物质。高质量的DNA样品是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的物质基础。植物DNA的提取方法有很多，传统的方法有CTAB法(Doyle and Doyle,1987)、改良CTAB法(程运江等，2001)，SDS法(蔡朝辉等，2000)，改良的植物DNA提取方法(周世良等，2013)。这些方法都是在裂解植物细胞的基础上，多次利用有机溶剂抽提，使得蛋白质等溶解在有机溶剂里，而核酸保留在水相里，最终达到分离核酸的目的，这也是目前应用最为广泛的DNA提取方法。另外，国内外生物公司开发了多种商品化的植物DNA提取试剂盒，不同的DNA提取试剂盒分离DNA的原理也不同，由于植物DNA提取试剂盒具有快速、方便、无需苯酚、氯仿避免了有机溶剂污染等优点，在条件允许的情况下通常被采用，但使用试剂盒提取干燥杏叶片DNA效果并不好，难以满足PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析的后续研究。

我国是杏属植物的原生起源地，特别是新疆地区，有着悠久的栽培历史和丰富的遗传多样性。对杏资源进行资源调查和遗传多样性研究时，野外采集标本和样品的路途远、时间长，因此常常采用硅胶干燥的方法保存和运输植物组织。植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，有时同种植物器官或组织不同状态的次生代谢产物的种类和含量也不一样，针对某个物种优化的DNA提取方法不一定适用于其它物种，因此获取高质量杏叶片中的DNA有一定的困难。传统的CTAB法是目前应用最广泛的DNA提取方法，但是该方法在提取杏植物干燥叶片时，残留了大量的蛋白糖类物质，影响到后续的PCR扩增、遗传多态性分析研究。迄今，还未见针对干燥杏叶片中提取高质量DNA的研究报道。

发明内容

本发明的目的在克服现有技术的缺陷，提供一种从干燥杏叶中高质量提取DNA的方法。

本发明的技术方案是：首先进行叶片组织中的次生代谢物质的抽提，用预冷缓冲浸提液对碾磨好的干杏叶冰浴、离心、弃上清，反复浸提数次，有利于将杏叶中多糖、多酚、酯类等次生代谢物在DNA释放前将其除去，防止与DNA形成复合体；在液氮碾磨和缓冲浸提液处理时，加入适量的PVP-40T，保护了DNA免受氧化,促进了细胞裂解,使其释放更多的DNA；加入适量RNA酶的操作置于细胞裂解后，除去了RNA，同时将引入的蛋白酶除去；)采用改良CTAB法，用适量苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，除去大量蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。与常用方法相比，本发明成本低廉。

本发明的进一步的技术方案是：

(1)加入1mL预冷的缓冲浸提液对碾磨好的干燥叶片冰浴15分钟，7000g离心10分钟，弃上清，反复浸提1-2次；该步骤有利于将叶片中的多糖、多酚、酯类等植物次生代谢产物在DNA释放之前将其除去，同时防止它们与DNA形成复合体，促进DNA进一步释放。

(2)在进行液氮碾磨和缓冲浸提液时，分别加入0.001克的PVP-40T，不仅保护了DNA免受氧化,还促进了细胞裂解,释放出更多的DNA。

(3)加入0.01mL 100mg/L RNA酶的操作置于细胞裂解后进行，不仅除去了RNA，同时在能将引入的蛋白酶除去，节省了操作时间。

(4)由于杏植物干燥叶片含有大量的蛋白，仅仅用氯仿异戊醇溶液进行抽提，会残留大量的蛋白使得蛋白难以洗脱和分离，因此我们将CTAB法进行改进，先用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，4℃保存)进行抽提，除去了大量的蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。

本发明具有以下优点：

1.本发明提高了干燥杏植物叶片DNA提取纯度和产出率。

2.使用本发明提取干燥杏叶DNA每份约需试剂费0.6元，是现使用普通试剂盒提取费用的1/9，且提取DNA质量好，产出率高。

3.采用琼脂糖凝胶电泳检测，用本发明提取的DNA在纯度、产出率都比常用的CTAB法和试剂盒法好；利用分光光度计检测DNA结果表明：本发明改良的方法提取的DNA的OD_260/280的比值及其根据分光光度计测定的OD值计算DNA的产率比用常规的CTAB法好很多。

附图说明

图1：是DNA琼脂糖检测电泳图，附图标记说明：1-4，是用CTAB法提取的DNA，5-8是用本发明提取的DNA，3号孔中含有大量的蛋白，4号孔中的提取的DNA量少，但用本发明的方法提取DNA效果良好。

具体实施方式

实施例1

一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法，包括下列步骤：

(1)去除杏叶的叶柄，称取20mg叶片，加入0.001克的PVP-40T，加入液氮，将叶片研磨成细粉末状，将细粉末加到2.0mL离心管中；

(2)加入1mL预冷的缓冲浸提液，混匀后冰浴15分钟，冰浴过程中颠倒混匀2-3次；

(3)在7000g下离心10min，弃上清；

(4)重复步骤(2)和(3)，直至上清不黏稠；

(5)每管迅速加入0.8mL预热至沸腾的CTAB Buffer，混匀，65℃水浴0.5-1h，间隔15min摇匀一次；

(6)加入0.01mL 100mg/L RNase，37℃水浴30–60min；

(7)取出后冷却至室温，每管加入0.8mL的体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，4℃保存，轻轻颠倒充分混匀15分钟，室温下10000g离心10min；

(8)吸上清并置于新的2.0mL离心管中，加入0.7mL的氯仿：异戊醇按体积比为24：1的氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀15分钟，10000g离心10min，置于另一1.5mL离心管中；

(9)加入0.5mL-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后-20℃垂直放置30min；

(10)在10000g离心10min，弃上清，再短暂离心收集剩余液体，用移液枪吸除剩余液体；

(11)加入0.5mL 75％的乙醇溶液，轻轻弹起沉淀，在10000×g离心2min，弃上清；

(12)重复步骤(11)；

(13)风干乙醇，加入0.1mL TE溶解DNA；

(14)测定DNA的浓度和纯度，得到DNA样品；

相关试剂及配制方法如下：

(1)相关母液的配制：

1)pH8.0的，1.0mol/L的Tris-HCl，1000.0mL母液的配制：

称取Tris 121.10g，加入500.0mL双蒸水溶解，用1.0mol/L的HCl调pH至8.0，定容至1000mL，混匀，灭菌，4℃保存；

2)500.0mL，5.0mol/L的NaCl母液的配制：

取146.00g NaCl用双蒸水溶解、定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

3)500.0mL，0.5mol/L的EDTA母液的配制：

取93.05g Na₂EDTA·H₂O加350.0mL双蒸水溶解，用10.0mol/L调pH至8.0，定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

4)pH5.2-5.3的250.0mL，3.0mol/L的NaAc母液的配制：

取102.00g NaAc·3H₂O，先用少量双蒸水溶解，再用3.0mol/L的乙酸调pH至5.2，定容至250.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(2)相关试剂的配制：

1)100.0mL，2％浓度的CTAB Buffer的配制方法：

称取CTAB 2.00g，偏重亚硫酸钠0.10g，PVP 1.00g，加入1.0mol/L Tris-HCl 10.0mL，5.0mol/L NaCl 30.0mL，0.5mol/L EDTA 10.0mL，混匀后加双蒸水至100.0mL，煮沸，提取前趁热迅速加2mLβ-巯基乙醇，混匀；

2)TE缓冲液，pH8.0，10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA；

3)100mL TE缓冲液，pH8.0的配制方法：1mL 1mol/L Tris-HCl和200μL 0.5mol/L EDTA混匀后定容至100.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(3)缓冲液配制：

缓冲浸提液配制，100mL

(4)其他常用试剂的配制：

1)氯仿：异戊醇(体积比24:1)；

2)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1，4℃保存)；

3)异丙醇(4℃保存)；

4)RNA酶(10.0mg/mL)；

5)70％浓度的乙醇；

6)无水乙醇(4℃和-20℃分别保存相应量备用)；

7)液氮、双蒸水。

Claims (2)

1.一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法，其特征在于下列步骤：

(1)去除杏叶的叶柄，称取20mg叶片，加入0.001克的PVP-40T，加入液氮，将叶片研磨成细粉末状，将细粉末加到2.0mL的离心管中；

(2)加入1mL预冷的缓冲浸提液，混匀后冰浴15分钟，冰浴过程中颠倒混匀2-3次；

(3)在7000g下离心10min，弃上清；

(4)重复步骤(2)和(3)，直至上清不黏稠；

(5)每管迅速加入0.8mL预热至沸腾的CTAB Buffer，混匀，65℃水浴0.5-1h，间隔15min摇匀一次；

(6)加入0.01mL 100mg/L RNase，37℃水浴30–60min；

(7)取出后冷却至室温，每管加入0.8mL的体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，4℃保存，轻轻颠倒充分混匀15分钟，室温下10000g离心10min；

(8)吸上清并置于新的2.0mL离心管中，加入0.7mL的氯仿：异戊醇按体积比为24：1的氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀15分钟，10000g离心10min，置于另一1.5mL离心管中；

(9)加入0.5mL-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后-20℃垂直放置30min；

(10)在10000g离心10min，弃上清，再短暂离心收集剩余液体，用移液枪吸除剩余液体；

(11)加入0.5mL 75％浓度的乙醇溶液，轻轻弹起沉淀，在10000×g离心2min，弃上清；

(12)重复步骤(11)；

(13)风干乙醇，加入0.1mL TE溶解DNA；

(14)测定DNA的浓度和纯度，得到DNA样品；

相关试剂及配制方法如下：

(1)母液配制：

1)1000.0mL1.0mol/LTris-HCl，pH8.0，母液：

称量Tris 121.10g，加入500.0mL双蒸水溶解，用1.0mol/L HCl调pH至8.0，定容至1000mL，混匀，灭菌，4℃保存；

2)500.0mL 5.0mol/L NaCl母液：146.00g NaCl用双蒸水溶解、定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

3)500.0mL 0.5mol/L EDTA母液：93.05g Na₂EDTA·H₂O加350.0mL双蒸水溶解，10.0mol/L调pH至8.0，定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

4)250.0mL 3.0mol/L NaAc，pH5.2-5.3，母液的制备：

取102.00g NaAc·3H₂O，用少量双蒸水溶解，用3.0mol/L乙酸调pH至5.2，定容至250.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(2)相关试剂的配制：

1)100.0mL，2％浓度的CTAB Buffer的配制方法：

称取CTAB 2.00g，偏重亚硫酸钠0.10g，PVP 1.00g，加入1.0mol/L Tris-HCl 10.0mL，5.0mol/L NaCl 30.0mL，0.5mol/L EDTA 10.0mL，混匀后加双蒸水至100.0mL，煮沸，提取前趁热迅速加2mLβ-巯基乙醇，混匀；

2)TE缓冲液，pH8.0，10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA；

3)pH8.0的100mL TE缓冲液配制方法：1mL 1mol/L的Tris-HCl和200μL 0.5mol/LEDTA混匀后定容至100.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(3)缓冲液配制：

1.缓冲浸提液配方，100mL

2.权利要求1所述的方法在干燥杏叶片中提取DNA中的应用。