CN105018464A - 一种干燥植物组织的dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体提供了一种针对干燥植物组织的DNA提取方法。所述方法利用改良CTAB裂解液进行干燥植物组织的细胞裂解；所述改良CTAB裂解液的组分为：2％CTAB，2％PVP40，100mM？Tris-HCl，25mM？EDTA，2M？NaCl，350mM山梨醇，100mMNa2SO3，2％β-巯基乙醇。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种针对干燥植物组织的DNA提取方法。
背景技术
在二代和三代测序技术中，获得纯度好、完整性高的基因组DNA是文库构建顺利完成并获得真实、完整的基因组信息的前提和关键。植物组织的特点是含有多种复杂的次生代谢物，特别是多糖多酚类化合物，不仅难去除，还会介导基因组DNA的降解，并对后续酶反应有一定的抑制作用；此外，对于野外采集只能采取干燥保存的植物组织，不仅次生代谢物含量明显偏高，基因组DNA降解的风险也会加大。目前常用的植物组织DNA提取方法，如常规CTAB(Hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(Sodium dodecylsulfate，十二烷基磺酸钠)法、试剂盒(过柱法和磁珠法)，既不能保证梨、猕猴桃等多糖或其它杂质含量高的基因组DNA的纯度，也不能克服干燥保存植物组织提取DNA的降解问题，这些方法提取的基因组DNA在二代和三代测序技术中会造成文库构建失败或信息分析异常。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种针对干燥植物组织的DNA提取方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：、
一种干燥植物组织的DNA提取方法，所述方法利用改良CTAB裂解液进行干燥植物组织的细胞裂解；所述改良CTAB裂解液的组分为：2％CTAB，2％PVP40，100mM Tris-HCl，25mM EDTA，2M NaCl，350mM山梨醇，100mM Na2SO3，2％β-巯基乙醇。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
(一)将样品在预冷的研钵中充分研磨成粉末状；
(二)将样品粉末加入预热的改良CTAB裂解液中混匀，使样品悬浮，温浴30～60min；取出冷却至室温，离心取上清；
(三)经氯仿-异戊醇抽提离心取上清；
(四)加入乙酸钠和异丙醇进行DNA沉淀；
(五)经乙醇清洗后离心得到DNA沉淀，干燥后加入含Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
其中，所述步骤(二)将样品粉末加入65℃预热的改良CTAB裂解液中混匀，使样品悬浮，65℃温浴30～60min；取出冷却至室温，离心取上清。
其中，所述步骤(二)在温浴期间摇匀2～3次，保证细胞充分裂解。
其中，所述步骤(三)中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
其中，所述步骤(四)加入相对于上清液1/10体积的3M乙酸钠和相对于上清液2/3体积预冷的异丙醇进行DNA沉淀。
更进一步地，所述方法包括以下步骤：
1)将样品移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至无菌离心管中；
2)立即加入65℃预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65℃温浴30～60min；取出后，冷却至室温，离心取上清液至新无菌离心管中；
3)加入氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒多次，室温离心；
4)吸取上清液至新无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下颠倒多次，室温离心；
5)吸取上清液至新无菌离心管中，加入乙酸钠和异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h，室温离心，弃上清，瞬时离心，弃上清；
6)加入70％乙醇清洗沉淀两次，离心弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，干燥至DNA沉淀呈半透明状；
7)根据DNA沉淀量加入含20μg/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
作为优选，所述方法包括以下步骤：
1)将100mg-200mg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2.0mL无菌离心管中；
2)立即加入1mL 65℃预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65℃温浴30min至60min，温浴期间摇匀2～3次，保证细胞充分裂解；取出后，冷却至室温，8000rpm室温离心5min，取800μL上清液至新的2.0mL无菌离心管中；
3)加入800μL氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min；
4)吸取600μL上清液至新的2.0mL无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min；
5)吸取400μL上清液至新的1.5mL无菌离心管中，加入相对于上清液1/10体积的3M乙酸钠和相对于上清液2/3体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清；
6)加入1mL 70％乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，37℃或室温干燥5min，至DNA沉淀呈半透明状；
7)根据DNA沉淀量加入适量含20μg/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，37℃消化30min。
本发明还提供了一种用于干燥植物组织DNA提取的改良CTAB裂解液，改良CTAB裂解液的组分为：2％CTAB，2％PVP40，100mMTris-HCl(pH8.0)，25mM EDTA，2M NaCl，350mM山梨醇，100mMNa2SO3，2％β-巯基乙醇。
本发明的有益效果在于：
本发明在改良CTAB裂解液中增加了PVP和亚硫酸钠，有效的抑制了酚醌类次生代谢物氧化造成的所提基因组DNA纯度低，并提高了DNA的完整性。
附图说明
图1为本发明实施例2所提基因组DNA进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
图2为本发明对比例1所提基因组DNA进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1改良CTAB裂解液
在常规CTAB裂解液配方的基础上添加了PVP40、山梨醇和亚硫酸钠，得到了改良CTAB裂解液。
所述改良CTAB裂解液的组分为：
2％CTAB，2％PVP40，100mM Tris-HCl，25mM EDTA，2M NaCl，350mM山梨醇，100mM Na2SO3，2％β-巯基乙醇。
实施例2海带干燥叶片基因组DNA提取
1.将100mg-200mg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；而后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2.0mL无菌离心管中。
2.立即加入1mL 65℃预热的实施例1所述的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65℃温浴30min至60min(温浴期间摇匀2～3次，保证细胞充分裂解)；取出后，冷却至室温，8000rpm室温离心5min，取800μL上清液至新的2.0mL无菌离心管中。
3.加入800μL氯仿：异戊醇(24:1)，缓慢上下颠倒100次(上下为1次)，12000rpm室温离心20min。
4.吸取600μL上清液至新的2.0mL无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min。
5.吸取400μL上清液至新的1.5mL无菌离心管中，加入1/10体积的3M乙酸钠和2/3体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清。
6.1mL 70％乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，37℃干燥5min(或室温干燥)，至DNA沉淀呈半透明状。
7.根据DNA沉淀量加入适量含20μg/L RNase A的超纯水溶解DNA沉淀，37℃消化30min。
8.Nanodrop 2000(Thermo)检测浓度，并取500ng进行琼脂糖凝胶电泳。NaNodrop 2000检测结果见表1，琼脂糖凝胶电泳见附图1。
表1检测结果
对比例1
相同植物组织，利用未经改良的CTAB裂解液进行DNA提取，提取方法除裂解液不同外，其它步骤与实施例1相同。NaNodrop 2000检测结果见表2，琼脂糖凝胶电泳见附图2。
表2检测结果
从电泳图可以看出，同样的样品在使用改良CTAB裂解液后，所提基因组DNA的降解程度明显改善，此降解程度可以满足二代测序要求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种干燥植物组织的DNA提取方法，其特征在于，所述方法利用改良CTAB裂解液进行干燥植物组织的细胞裂解；所述改良CTAB裂解液的组分为：2％CTAB，2％PVP40，100mM Tris-HCl，25mMEDTA，2M NaCl，350mM山梨醇，100mM Na2SO3，2％β-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(一)将样品在预冷的研钵中充分研磨成粉末状；
(二)将样品粉末加入预热的改良CTAB裂解液中混匀，使样品悬浮，温浴30～60min；取出冷却至室温，离心取上清；
(三)经氯仿-异戊醇抽提离心取上清；
(四)加入乙酸钠和异丙醇进行DNA沉淀；
(五)经乙醇清洗后离心得到DNA沉淀，干燥后加入含Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(二)将样品粉末加入65℃预热的改良CTAB裂解液中混匀，使样品悬浮，65℃温浴30～60min；取出冷却至室温，离心取上清。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(二)在温浴期间摇匀2～3次，保证细胞充分裂解。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(三)中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(四)加入相对于上清液1/10体积的3M乙酸钠和相对于上清液2/3体积预冷的异丙醇进行DNA沉淀。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将样品移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至无菌离心管中；
2)立即加入65℃预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65℃温浴30～60min；取出后，冷却至室温，离心取上清液至新无菌离心管中；
3)加入氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒多次，室温离心；
4)吸取上清液至新无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下颠倒多次，室温离心；
5)吸取上清液至新无菌离心管中，加入乙酸钠和异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h，室温离心，弃上清，瞬时离心，弃上清；
6)加入70％乙醇清洗沉淀两次，离心弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，干燥至DNA沉淀呈半透明状；
7)根据DNA沉淀量加入含20μg/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将100mg-200mg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2.0mL无菌离心管中；
2)立即加入1mL 65℃预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65℃温浴30min至60min，温浴期间摇匀2～3次，保证细胞充分裂解；取出后，冷却至室温，8000rpm室温离心5min，取800μL上清液至新的2.0mL无菌离心管中；
3)加入800μL氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min；
4)吸取600μL上清液至新的2.0mL无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min；
5)吸取400μL上清液至新的1.5mL无菌离心管中，加入相对于上清液1/10体积的3M乙酸钠和相对于上清液2/3体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清；
6)加入1mL 70％乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，37℃或室温干燥5min，至DNA沉淀呈半透明状；
7)根据DNA沉淀量加入适量含20μg/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，37℃消化30min。
9.一种用于干燥植物组织DNA提取的改良CTAB裂解液，其特征在于，改良CTAB裂解液的组分为：2％CTAB，2％PVP40，100mMTris-HCl，25mM EDTA，2M NaCl，350mM山梨醇，100mM Na2SO3，2％β-巯基乙醇。
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