CN104988137A - 一种改良ctab法提取头花蓼dna - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，包括如下步骤：取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心；取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提；将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干；去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解；分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次；将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存。本发明采用改良CTAB法提取头花蓼DNA，方法简单、成本低廉，提取的头花蓼DNA纯度更高。

Description

一种改良CTAB法提取头花蓼DNA

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法，尤其涉及一种改良CTAB法提取头花蓼DNA。  

背景技术

目前，对头花蓼的研究主要在其化学成分及药理作用、临床应用、显微鉴别和栽培技术等方面。不同研究小组对不同产地野生与栽培头花蓼中的总黄酮含量进行比较发现存在一定的差异，提示生长环境对药材质量有影响。近几年随着头花蓼在市场价值中的提高，对头花蓼分子生物学方面的研究也逐渐进入热点阶段。随着人们对药品质量的关注，为保证中药药品质量，利用现代分子生物学DNA条形码技术对贵州道地苗药头花蓼进行鉴定、分析研究是目前研究的热点。

但目前传统的头花蓼DNA提取方法仍然存在如下问题：提取过程复杂、成本高昂、周期长、纯度低，导致引物不具有标准性等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、成本低廉、周期短，提取的头花蓼DNA纯度更高的头花蓼DNA提取方法。

    本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，包括如下步骤：

    取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心；

取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提；

将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干；

去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解；

分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次；

将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进

    进一步，所述取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心步骤的具体实现如下：

称取121.1gTris，溶于800ml水中，加入浓盐酸并在不断搅拌条件下，调节pH值至8.0，加入双蒸水至总体积为1L，分装并高压灭菌后4℃保存；

称取186.1gEDTA-Na₂·H₂O，加入900ml双蒸水，磁力搅拌器上搅拌，加入NaOH调节pH值至8.0，加双蒸水定容至1L；

称取4gCTAB，加100ml双蒸水溶解，再加20ml/LTris-HCl(pH8.0),8ml，

0.5mol/LEDTA(pH8.0)，56ml5mol/LNaCl，加双蒸馏水至200ml，室内保存；

取头花蓼幼嫩叶片，-70℃的低温冰箱中保存备用，取冷冻头花蓼材料2g，立即放入冰冻过的研钵中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉末状；

将粉末快速移入1.5ml离心管，加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴60min，期间混匀10-15次。

    进一步，所述取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提步骤的具体实现如下：

 取上清液,加入等体积的氯仿:异戊醇，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀10-15次，取上清转移至1.5ml离心管中，再次取上清液用氯仿：异戊醇抽提1次，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1。

进一步，所述将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干步骤的具体实现如下：

称取24.608g无水醋酸钠，加入双蒸水70ml加热至50-80℃溶解，再加入双蒸水定容至100ml，高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用；

 将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm/min，离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀1次，12000rpm/min离心1min,用小枪头吸干乙醇，风干。

    进一步，所述去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解步骤的具体实现如下：

 去除沉淀中的乙醇，用700μl 含RNA酶（20μg/ml）的TE溶解，37℃消化2h以裂解RNA。

 进一步，所述分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次步骤的具体实现如下：

分别用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇，在4℃，12000rpm/min，5min条件下各抽提一次，其中苯酚、氯仿、异戊醇体积比为25：24：1，氯仿、异戊醇体积比为24：1。

 进一步，所述将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存步骤的具体实现如下：

将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积的-20℃--70℃无水乙醇，轻轻混匀；

 在4℃，12000rpm/min，离心5min条件下，将沉淀用70%乙醇溶液洗涤2次，风干，加100μl TE液溶解，低温保存。

 本发明的有益效果是：

 1.改良CTAB法简单、成本低廉、提取周期短；

 2.改良CTAB法可有效提取头花蓼DNA，A260/A280比值区间在1.1-2.0,比较传统的SDS法、CTAB法具有更高的提取纯度；

 3.测序结果表明，rbcL序列长度在979-985bp之间，rDNA ITS序列长度为661-666bp；

 4.序列比对和聚类分析结果表明，目的序列具有高度同源性；

 5.测序结果提交NCBI获得GenBank序列号。

附图说明

图1本发明rbcL序列PCR扩增产物电泳图谱；

图2本发明ITS序列PCR扩增产物电泳图谱。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例：

分别取不同来源的头花蓼幼嫩叶片（见表1），-70℃的低温冰箱中保存备用，取冷冻头花蓼材料2g，立即放入冰冻过的研钵中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉末状；将粉末快速移入1.5ml离心管，加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴60min，期间混匀10-15次。 取上清液,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,V/V)，颠倒混匀10-15次，取上清转移至另一1.5ml离心管中，再次取上清液用氯仿：异戊醇(24:1,V/V)抽提1次。称取24.608g无水醋酸钠，加入双蒸水70ml加热至50-80℃溶解，再加入双蒸水定容至100ml，高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用； 将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm/min，离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀1次，12000rpm/min离心1min,用小枪头吸干乙醇，风干。 去除沉淀中的乙醇，用700μl 含RNA酶（20μg/ml）的TE溶解，37℃消化2h以裂解RNA。分别用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1,,V/V/V)，氯仿：异戊醇（24：1,V/V），在4℃，12000rpm/min，5min条件下各抽提一次。将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积的-20℃--70℃无水乙醇，轻轻混匀；在4℃，12000rpm/min，离心5min条件下，将沉淀用70%乙醇溶液洗涤2次，风干，加100μl TE液溶解，低温保存。

表1 不同来源头花蓼编号及采集地

1.                                                

2.头花蓼基因组DNA纯度检测

应用紫外分光光度计检测不同来源头花蓼样品的DNA纯度，测得吸光度数值（见表2）：

表2 不同来源头花蓼DNA纯度

表2所示，不同来源头花蓼DNA浓度最高值为440μg/ml最低值为80μg/ml，A260最高值为0.048，最低值为0.01。A280最高值为0.035，最低值为0.005。A260/A280比值在1.1-2.0之间，所有样品达到PCR扩增标准。

3.不同来源头花蓼中rbcL/rDNA ITS序列的PCR扩增

   将已达到PCR扩增标准的6个不同来源头花蓼DNA样品，用rbcL序列通用引物进行PCR扩增，并对所获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

    如图1所示，rbcL序列长度与marker条带相比，在900bp到1000bp之间，条带无拖尾，单一清晰，符合测序要求。

将不同来源头花蓼6个DNA样品用rDNA ITS序列通用引物对rDNA ITS序列PCR扩增。

如图2所示，PCR扩增产物条带与marker条带相比，ITS序列的长度都在600bp-700bp到之间，电泳条带清晰单一，符合测序要求。

4.改良CTAB法与传统SDS法、CTAB法提取头花蓼DNA纯度对比

表3 不同方法提取头花蓼DNA纯度

    表3所示，本发明改良CTAB法提取头花蓼DNA中RNA、蛋白质杂质较传统SDS法、CTAB法中更少。因此，改良CTAB法提取头花蓼DNA纯度得到进一步提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，包括如下步骤：

     取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心；

取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提；

将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干；

去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解；

分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次；

将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存。

2.根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心步骤的具体实现如下：

称取121.1g Tris，溶于800ml水中，加入浓盐酸并在不断搅拌条件下，调节pH值至8.0，加入双蒸水至总体积为1L，分装并高压灭菌后4℃保存；

称取186.1g EDTA-Na₂·H₂O，加入900ml双蒸水，磁力搅拌器上搅拌，加入NaOH调节pH值至8.0，加双蒸水定容至1L；

称取4g CTAB，加100ml双蒸水溶解，再加20ml/L Tris-HCl(pH8.0),8ml，

0.5mol/L EDTA(pH8.0)，56m l5mol/L NaCl，加双蒸馏水至200ml，室内保存；

取头花蓼幼嫩叶片，-70℃的低温冰箱中保存备用，取冷冻头花蓼材料2g，立即放入冰冻过的研钵中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉末状；

    将粉末快速移入1.5ml离心管，加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴60min，期间混匀10-15次。

3. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提步骤的具体实现如下：

    取上清液,加入等体积的氯仿:异戊醇，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀10-15次，取上清转移至1.5ml离心管中，再次取上清液用氯仿：异戊醇抽提1次，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1。

4.根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干步骤的具体实现如下：

称取24.608g无水醋酸钠，加入双蒸水70ml加热至50-80℃溶解，再加入双蒸水定容至100ml，高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用；

将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm/min，离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀1次，12000rpm/min离心1min,用小枪头吸干乙醇，风干。

5.根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解步骤的具体实现如下：

去除沉淀中的乙醇，用700μl 含RNA酶（20μg/ml）的TE溶解，37℃消化2h以裂解RNA。

6.根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次步骤的具体实现如下：

分别用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇，在4℃，12000rpm/min，5min条件下各抽提一次，其中苯酚、氯仿、异戊醇体积比为25：24：1，氯仿、异戊醇体积比为24：1。

7.根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，其特征在于，所述将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存步骤的具体实现如下：

将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积的-20℃--70℃无水乙醇，轻轻混匀；

在4℃，12000rpm/min，离心5min条件下，将沉淀用70%乙醇溶液洗涤2次，风干，加100μl TE液溶解，低温保存。