CN104830839A - 一种茄子单粒种子dna快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法。它是取待测品种纯合亲本种子各1粒种子、杂交种F1代100粒，单粒提取DNA。每粒种子分别装入2mL圆头离心管中，内放两颗2mm直径钢珠，液氮速冻30秒。采用高通量组织研磨器破碎，频率设定65Hz，时间设定70s。通过添加乙酸钠、增加颠倒混匀次数、离心时间和转速等改进，充分提取DNA。该方法简单快速，不需对种子进行任何处理，提取DNA可以满足SSR法鉴定品种纯度的要求。本发明的鉴定方法具有检测速度快、成本低、结果可靠的特点。

Description

一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的新方法。

背景技术

与常规种比较，茄子杂交种具有高产、抗逆和优质等诸多方面的优势。但茄子为严格自花授粉作物，在杂交制种过程中，由于去雄不及时或去雄不完全，往往产生自交种子，给生产造成损失。因此，及时进行杂交种纯度检测非常重要。目前，主要方法有：

田间检测：此方法目前为多数茄子种子生产单位选用。茄子苗龄50-60天，定植后40-50天始收，整个鉴定期100天以上，耗时长。得到鉴定结果后往往已错过当年播种期，导致库存压力增大，种子芽势降低。

室内DNA检测：目前有ＲAPD、SRAP、SSR标记法对茄子进行纯度检测，但都是采取叶片，通过传统CTAB提取法DNA。茄子出苗慢，从播种到第一片真叶展开大约30左右，研磨一个样品至少要30秒，纯度鉴定至少要求群体在100株以上。刘军利用NaOH裂解法提取茄子种嫩芽DNA进行品种纯度鉴定，提取的DNA中蛋白质和杂质含量较高，琼脂糖电泳并不能看到明显的DNA条带，而且提取的DNA中有2%-4%的样本不能正常扩增，导致条带缺失，而茄子发芽也至少需要5-7天。经检索，目前尚未发现通过提取单粒茄子种子DNA快速实现杂交种纯度鉴定的报道。

发明内容

本发明公开了一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法，其特征在于下如下的步骤进行：

1）杂交种母本和父本种子各1粒， F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取；包括：圆丰园单粒种子、茄子杂交种46-2012单粒种子、茄子杂交种紫帅四号单粒种子。

2）将每粒种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻15-60秒，采用高通量组织研磨器破碎，参数设定频率为45-100赫兹、时间为30-70秒；

3）DNA提取过程中65℃水浴10-60min，每隔3-8min混匀一次；

4）采用苯酚抽提和体积比为24:1的氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀次数80-100次，12000rpm转速，离心时间4-10分钟；其中苯酚用量为450ul；优选颠倒混匀次数为80-100次。

5) 取上清200uL，加入等体积异丙醇之前加入20uL 3 M乙酸钠促进DNA沉淀纯化；

6)70%（w/w）乙醇洗沉淀两次，种子DNA量少，洗时尽量避免将DNA沉淀倒掉，留10uL底液室温晾干至无酒精味。

7）加入20ul ddH₂O后65℃保温15min，混匀，3000rpm转速离心20-60秒。

8）取2uLDNA采用天津科润蔬菜研究所茄子研究室自有SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。

本发明采用杂交种母本和父本各1粒(有市售)、茄子 F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取。将不做任何处理的种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻30秒后，采用破碎仪破碎，参数设定为65Hz、70s。破碎后用连续加样器每管添加600uL裂解液65℃温浴30分钟后通过氯仿异戊醇分离得到DNA样品。（氯仿：异戊醇的体积比为24:1）经过核酸蛋白仪测定浓度后统一调整为50ng/uL，取2uLDNA采用已知SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。

本发明检测方法的检测对象为茄子F1杂交种。

本发明首次实现了对茄子种子DNA直接进行提取的目标。采用一台高通量组织研磨器（宁波新芝Scientz-48）可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过去研磨效率至少提高20倍。在改良CTAB法的基础上，通过增加颠倒混匀次数（从20次增加到100次）、添加3 M乙酸钠、最后洗涤时留少许乙醇使其自然蒸发晾干等措施，在单粒种子中提取到了质量稳定、数量充足的DNA质量，利用自有SSR纯度鉴定体系可在5个小时内完成茄子杂种纯度鉴定。

本发明的原理在于：

小样品提取到足够的DNA，在研磨方法，水浴过程中间隔混匀多次，苯酚抽提，颠倒混匀次数从20次增加到100次，添加3 M乙酸钠，离心时间从4分钟增加到10分钟，以及进行PCR时间有调整，具体的内容如下：

采用机械研磨的方法研磨充分，可以更好破碎茄子种子的组织和细胞，由于种子细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB) 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。离心管添加CTAB水浴过程中每隔5min混匀一次，目的是使药品与种子组织和细胞充分接触，尽量实现完全反应。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀100次以上，为的是将除核蛋白之外的其余蛋白杂质溶解在苯酚有机相中，减少对DNA提取的影响。离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24﹕1）轻轻颠倒摇匀100次以上，因为此时DNA已经与核蛋白分离，DNA较脆弱，如果剧烈摇动会导致DNA断裂，影响提取效果。摇匀100次以上为的是充分分离DNA，提高DNA提取质量。取上清200uL，加入20uL 3 M乙酸钠可以促进DNA沉淀纯化。3M的醋酸钠有H₂O分子的作用，促进DNA沉淀，PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使DNA得到纯化。再加入220uL异丙醇即可将DNA完全沉淀，沉淀DNA溶于20uLddH2O中，65℃保温15min，使DNA得到充分溶解，得到总DNA溶液。防止DNA量少而出现降解，应该立刻进行PCR扩增，或者-20℃保存。

本发明公开的基于茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交茄子品种纯度鉴定的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1） 检测速度快：以种子为材料提取DNA可以不受采样时间、地点的限制，也解除了提取DNA过程中需要液氮研磨的麻烦。通过采用高通量组织研磨器（宁波新芝Scientz-48）可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过去研磨效率至少提高20倍。

（2） 成本低：由于DNA提取工作量大大降低，节省人力物力，利用分子标记技术鉴定一个品种纯度，仅需要500元左右，是所有技术中成本最低的。

（3）提取充分，结果可靠：实验证实，利用本方法提取DNA，速度快，质量高，每粒种子提取的DNA可供3次电泳，而且条带清晰，纯度鉴定结果与田间纯度鉴定结果吻合。

附图说明：

图1为圆丰园SSR琼脂糖凝胶电泳；

图2为杂交种46-2012聚丙烯凝胶电泳；

图3为紫帅四号SSR聚丙烯凝胶电泳。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明所用到的杂交种母本和父本来源于包括：圆丰园单粒种子、茄子杂交种46-2012单粒种子、茄子杂交种紫帅四号单粒种子均由市售。

实施例1

茄子杂交种圆丰园单粒种子DNA快速提取用于品种纯度鉴定

DNA提取

1、 将待测茄子品种圆丰园的母本和父本种子各1粒，F₁种子100粒分别装入事先放好两颗2mm直径钢珠的2ml圆底离心管中，分三批置于高通量组织研磨机48孔托盘，采用65Hz频率研磨70s后成均匀粉末状，非常适合大批量DNA样品快速提取。用连续加样器分别给每个离心管加入600uL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液（包括0.1%巯基乙醇），放置在离心管架后在水浴锅中65℃水浴30min，每隔5min混匀一次。30min后取出离心管放置在高速离心机，参数设定为12000rpm离心10min。

2、打开2mL离心管盖，用1000uL移液器取上清液450uL，加入事先预添加450uL苯酚溶液的1.5mL离心管中，盖上盖放入102孔离心管架后剧烈颠倒摇匀100次以上，12000 rpm离心10 min。注意：加入苯酚（450 ul）时，应在通风口或通风橱里面操作，且在加入苯酚过程中，取水相下面的苯酚溶液而不能取上层溶液。

3、取350ul上清（有时取下液，看环境温度。总之取水相），加入等体积的氯仿/异戊醇（24﹕1）（通风口或通风橱里面操作），轻轻颠倒摇匀100次以上，12000 rpm离心10 min。

4、取上清（200ul）转入新的1.5 ml离心管中，加入1/10 体积3 M乙酸钠，混匀，加入等体积的－20℃预冷的异丙醇，混匀， -20℃静置2小时以上。注意：遵循宁愿少取上清也不要吸到下层氯仿的原则。

5、离心（10000 rpm, 10 min），弃上清，加入1 ml 70%乙醇洗沉淀两次（注意：由于种子DNA量少，所以洗的时候不要将DNA沉淀倒掉），室温晾干至无酒精味。

6、加入20ul ddH₂O后65℃保温15min，混匀，离心。注意：溶解后的DNA经过核酸蛋白仪浓度检测后统一调整为50ng/uL，立刻进行PCR扩增，防止由于DNA量少而出现降解的情况；或者立即放入-20℃冷冻。

纯度鉴定选用引

SSR199：

Forward primer为ATCAAATGGGAGAAAATACTGCATC

Reverse primer为GTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC

由上海生工合成。

药品及材料：

（ddH2O、10×buffer、dNTPS、Tap酶）、引物、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、琼脂糖、0、6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖）、EB(溴化乙锭)采用王利英亲子鉴定体系中SSR反应体系，总共10ul包括5uL Mix（宝生物 2×），2uL ddH₂O，2uL模板DNA（浓度为50 ng/uL），前后引物各0.5uL（浓度为10 pmol/uL）。PCR程序为预变性：95℃3min，变性：95℃30s，退火：56℃30s，延伸：72℃40s（变性、退火、延伸三过程循环34次），延伸：72℃3min，保存：4℃）。

琼脂糖电泳：

1．琼脂糖凝胶的制备

（1）将制胶模放在工作台的水平位置上，在距离底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距离玻璃板太近，则拔出梳子时孔底有破裂的危险，最后导致样品渗漏。

（2）配制2%浓度的凝胶。在电泳缓冲液（0.5×TBE）中加入琼脂糖，在沸水浴或微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖彻底溶解。一般中型槽子加入80ml0.5×TBE,1.6g琼脂糖。

（3）使溶液冷却至60℃（可用手感受锥形瓶底部的温度），加入溴化乙锭，迅速充分混匀后倒入胶膜中，检查梳子的齿下或齿间是否有气泡，如有则马上清除。

（4）在凝胶完全凝固后（大约需要30分钟），小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。

（5）在电泳槽中加入没过胶面1 mm以上的电泳缓冲液。

注意：缓冲液中缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。所以应该常换电泳缓冲液。

2．加样与电泳

（1）将一定量的PCR产物DNA样品与加样缓冲液在Parafilm膜上或离心管中按5﹕1混匀。

（2）用微量取液器先将DL500Marker溶液加入加样孔中，然后将DNA样品混合液依次加入同一排相邻的加样孔中。加样完成后通电（电压按照两极间距离2-4 V/cm计算）。

（3）当溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离时（一般为3-5cm），切断电流，在紫外灯下观察并照相(如果亲本之间的差异较小，可以适当加长电泳时间，一般90v，电泳时间30min到一个小时)。

（4）切断电流，紫外灯下照相。

附录： CTAB法提取DNA

6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖）：将 0.125 g溴酚蓝、0.125 g二甲苯青与20 g蔗糖溶于30 ml蒸馏水中，定溶至50 ml，4℃保存备用。

1M Tris-HCl（pH 8.0）：将Tris碱121.1 g溶于800 ml去离子水中，待溶液冷却至室温后用浓盐酸将pH值调节至8.0（约需42 ml浓盐酸）或7.5（约需65 ml浓盐酸），定容至1000 ml，分装、高压灭菌，室温保存备用。

0.5 M EDTA（pH 8.0）：将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·H2O）溶于800 ml去离子水中，用固体氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0(约需20 g氢氧化钠颗粒；pH值接近8.0时，EDTA二钠盐才能完全溶解)，定容至1000ml，分装后高压灭菌，室温保存备用。

5 M NaCl：将292.2 g 氯化钠溶于800 ml去离子水中，定容至1000 ml，分装后高压灭菌，室温保存备用。20% PVP（相对分子质量10000）：将20 g聚乙烯吡咯烷酮溶于80 ml去离子水中，定容至100 ml，高压灭菌，室温保存备用。

10% CTAB：将10 g CTAB加入80 ml去离子水中，加热至65℃并搅拌使之溶解，定溶至100 ml，室温保存备用。

2×CTAB提取缓冲液（现配现用, 0.1M Tris-HCl、0.02M EDTA、1.4M NaCl、5% PVP、2% CTAB、2% 2-巯基乙醇），将下列试剂混匀备用（100 ml）：5M NaCl 28 ml 20% PVP 25 ml 10% CTAB 20 ml 1M Tris-HCl（pH 8.0） 10 ml 0.5M EDTA（pH 8.0） 4 ml 100% β-巯基乙醇 2 ml 去离子水 11 ml氯仿/异戊醇（24﹕1）：将480 ml氯仿与20ml异戊醇混匀备用，-20℃保存备用。

3 M乙酸钠（CH3COONa，pH5.2）：将12.3 g无水乙酸钠溶于30 ml去离子水中，先用冰乙酸调节溶液的pH值至5.2，定容至50 ml，高压灭菌，室温保存备用。

5×TBE：混合下列成分，定容至1000 ml，室温保存备用。Tris 碱 54 g、硼酸 27.5 g、0.5 mol/l EDTA（pH 8.0） 20 ml、去离子水 500 ml

结果分析：见图1。共提取120个样品，损失9个，扩增111个样品，可读条带103个，其中母本型18个，杂合型85个，纯度：85/103=82.5%。

实施例2

   茄子杂交种46-2012单粒种子DNA快速提取用于品种纯度鉴定，方法同实施例1，所用引物改为SSR150，

Forward primer为ACAACATTTCTAAGGG CCTTCACG，

Reverse primer为GTTTGGGCATATTTGGCACTTGTTGAAT，

由上海生工合成。

结果分析：见图2。共提取178个样品，损失23个，扩增131个样品，可读条带111个，其中母本型7个，杂合型104个。纯度：104/111=93.7%。

实施例3

   茄子杂交种紫帅四号单粒种子DNA快速提取用于品种纯度鉴定，方法同实施例1，所用引物改为SSR150，

Forward primer为ACAACATTTCTAAGGG CCTTCACG，

Reverse primer为GTTTGGGCATATTTGGCACTTGTTGAAT，

由上海生工合成。

结果分析：共提取120个样品，损失4个，扩增116个样品，可读条带110个。从图中可以看出，9-1群体的父本除了8号外还有一个父本x。其中7、8亲本产生的后代占总数的54.5%=60/110；7、x亲本产生的后代占总数的42.7%=47/110；母本基因型的后代占总数的1.8%=2/110；父本基因型的后代占总数的0.9%=1/110，最后结果测试紫帅四号纯度为54.5%。

三个杂交种的三份种子都存在纯度问题，田间鉴定结果与室内SSR鉴定结果一致。

实施例4

结论：本发明公开的基于茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交茄子品种纯度鉴定的方法与现有技术相比有以下三个特点。

（1）检测速度快。

（2）成本低。

（3）结果可靠。

SEQUENCE LISTING

<110>  天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所

<120>  一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atcaaatggg agaaaatact gcatc                                             25

 

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtttggctta aacacacaac gtatatggac                                        30

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acaacatttc taagggcctt cacg                                              24

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gtttgggcat atttggcact tgttgaat                                          28

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

acaacatttc taagggcctt cacg                                              24

 

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gtttgggcat atttggcact tgttgaat                                          28 

Claims (4)

1.一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）取杂交种母本和父本种子各1粒， F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取；

2）将每粒种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻15-60秒，采用高通量组织研磨器破碎，参数设定频率为45-100赫兹、时间为30-70秒；

3）DNA提取过程中65℃水浴10-60min，每隔3-8min混匀一次；

4）采用苯酚抽提和体积比为24:1的氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀次数80-100次，12000rpm转速，离心时间4-10分钟；其中苯酚用量为450ul；

5) 取上清200uL，加入等体积异丙醇之前加入20uL 3 M乙酸钠促进DNA沉淀纯化；

6)70%（w/w）乙醇洗沉淀两次，种子DNA量少，洗时尽量避免将DNA沉淀倒掉，留10uL底液室温晾干至无酒精味；

7）加入20ul ddH₂O后65℃保温15min，混匀，3000rpm转速离心20-60秒；

8）取2uLDNA采用SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。

2.权利要求1所述的鉴定方法，其中的F1代种子指的是：茄子F1杂交种。

3.权利要求1所述的鉴定方法，其中步骤4）的颠倒混匀次数100次。

4.权利要求1所述的鉴定方法，其中杂交种母本和父本种指的是：杂交种圆丰园、杂交种46-2012、杂交种紫帅四号的父母本。