CN110438118A - 一种提取黄瓜线粒体及其dna的有效方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法，属于植物生物技术领域。以黄瓜黄化苗为材料，调整提取过程组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合percoll密度梯度离心分离得到线粒体，并使用3％CTAB裂解线粒体，后续用氯仿‑异戊醇抽提得到高质量mtDNA。用甘露醇和半胱氨酸取代传统方法的蔗糖和巯基乙醇配成的匀浆缓冲液A所提取线粒体完整性好，分离细胞破碎组织及纯化线粒体离心力分别为2000×g、17000×g时得到明显的线粒体聚层，纯化后mtDNA浓度为158ng·μL‑1，每20g叶片可得7.9μg mtDNA。其中A260/A280约1.87，说明本方法提取分离得到的mtDNA纯度高。本发明首次建立一套适用于黄瓜mtDNA提取纯化的有效体系，对于其他物种构建mtDNA提取纯化体系具有参考意义。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法，适用于黄瓜线粒体DNA分离纯化，属于植物生物技术领域。
二、背景技术
线粒体作为一种半自主性细胞器，是细胞能量代谢重要场所(Lane et al.，2010)，在植物生长发育和繁殖等过程中发挥重要作用(Cui et al.，2012)。线粒体基因组拥有自身独立的转录和翻译系统，同时受到细胞核基因的调控(张晓等，2011；苏爱国等，2011)。
黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国重要的蔬菜作物，其线粒体基因组高达1685kb(Andrew J et al.，2011)，数倍于其他植物的线粒体基因组。作为一个细胞内遗传物质表现出三种不同遗传方式的双子叶植物，黄瓜线粒体呈现独特的父系遗传(HAVEY M J etal.，1998；SHEN J et al.， 2013)，是线粒体遗传研究的绝佳体系。陈劲枫等人率先通过远缘杂交成功获得了野生酸黄瓜 (C.hystrix，2n＝2x＝24)和栽培黄瓜(C.sativus，2n＝2x＝14)的种间杂交黄瓜(Chen et al.，2000)，为研究甜瓜属种间杂交质体的遗传研究提供了良好材料。因此提取高质量黄瓜mtDNA是进行线粒体基因组功能分析，成为进一步开展黄瓜种间杂交核质互作、细胞器遗传进化等研究工作的关键。
然而，由于植物细胞中细胞壁、液泡和叶绿体的影响，使黄瓜线粒体的分离变得更加困难。另外，黄瓜基因组较大的原因主要是包含了大量的重复序列以及外源序列片段，包括核基因组序列、叶绿体基因组序列以及病毒细菌的序列，而并非包含更多的基因。因此，和其他作物相比，黄瓜mtDNA的提取难度更大，目前还没有关于黄瓜mtDNA提取方法的报道。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种提取黄瓜线粒体及其DNA的有效方法，适用于黄瓜线粒体 DNA分离纯化。要想得到高纯度的mtDNA，需要除去核基因和叶绿体基因等污染。经过差速离心法可以去除核基因污染，但是无法将沉降系数差异小的叶绿体和线粒体分开。本发明结合不同植物mtDNA提取方法，调整组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合percoll 密度梯度离心分离得到线粒体，成功构建了黄瓜mtDNA提取纯化体系，并且成本低、操作简单，产物质量高，这为进一步研究黄瓜线粒体基因组的核质互作、遗传差异等科学问题奠定基础。
技术方案
本发明基于前期不断摸索提取过程的组织匀浆缓冲液成分和差速离心力组合，结合 percoll密度梯度离心分离得到线粒体，现得到适用于黄瓜mtDNA提取纯化有效体系。具体实验内容如下：
1.叶片组织破碎：
(1)摘取适量预冷的黄化苗叶片，放入1∶6稀释最终浓度1％的消毒液中清洗2分钟，之后置于冰水中清洗3遍；
(2)称取上述组织20g置于组织破碎机(JJ-2，温州标诺仪器有限公司)，加入200mL组织匀浆缓冲液，同时加入0.28g半胱氨酸，在较低设置下匀浆3次，每次约5秒；
(3)匀浆液用8层提前预冷无菌纱布和200目细胞筛依次过滤，并在冰上收集滤液，等量分装于4个无菌的50mL离心管中；
2.线粒体的提取与分离：
(1)高速冷冻离心10min，离心力1000×g，细胞碎片于底部沉淀，收集上层清液；
(2)上层清液转至4个全新50mL离心管，2000×g离心10min，去除叶绿体等细胞器结构，收集上层清液；
(3)将4管含有线粒体的清液分别转至4个无菌预冷的50mL离心管，于17000×g离心20min，此时沉淀即为粗制的线粒体；
(4)去除上清液，向线粒体沉淀中加入0.5mL洗涤缓冲液，并用无菌软毛笔蘸取重新悬浮，将4管合并得到2mL线粒体悬浮液；
(5)线粒体悬浮液中加入500uL的100％Percoll溶液，制成2.5mL含丰富线粒体的20％Percoll 溶液；
(6)用移液管将线粒体悬浮液贴壁转移至提前备好的Percoll梯度液，之后超速冷冻离心 60min，离心力18000×g；
(7)线粒体会在80％和33％Percoll液之间形成一条层带，回收线粒体加入10mL洗涤缓冲液，再以18000×g离心20min即可得到纯化的线粒体。
3.mtDNA的提取纯化：
(1)向所提线粒体沉淀中加入800μL 3％CTAB重悬沉淀，并于65℃水浴1h。水浴冷却至室温加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀于室温下静置10min，12000×g离心10min；
(2)收集上清液至新的离心管，同样加入800μL氯仿-异戊醇(24∶1)混匀，12000×g离心 10min；
(3)上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃条件下静置沉淀1-3h；
(4)12000×g离心10min后即可得到浓缩线粒体DNA，弃上清液，加入70％乙醇洗涤3次，并在干净的工作台中干燥后重悬于适量无菌超纯水中，置于-20℃保存；
4.mtDNA的定量和定性分析：
(1)线粒体完整性观察：吸取15μL线粒体溶液置于干净载玻片，再加入5μL健那绿染液，吸打混匀后盖上盖玻片，10min之后进行显微观察线粒体；
(2)mtDNA浓度及电泳条带检测：吸取1μL所提mtDNA溶液，利用紫外分光光度计检测其浓度和纯度。取2μL mtDNA样品进行琼脂糖凝胶(1％)电泳检测，与空白对照观察DNA分子大小和带型；
(3)mtDNA纯度检测：根据NCBI基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计线粒体基因、核基因、叶绿体基因特异性引物。以所提取的mtDNA为模板进行PCR扩增，进一步验证是否存在叶绿体基因组和核基因组的污染。50μL PCR反应体系包括：1μL mtDNA，1μL上游和下游引物(10mmol·L-1)，25μL 2×Taq Master Mix和22μL ddH2O2。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20S；55℃退火20S；72℃延伸2min20S，33个循环；72℃延伸5min， 4℃保存。在1％琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物，结合凝胶成像系统观察条带。
有益效果
本发明一种提取黄瓜线粒体及其DNA的方法，具有以下创新点和有益效果：
(1)为了避免叶绿体以及酚类物质干扰，选用遮光培养3天以上的黄瓜黄花苗作为试验材料，组织收获预冷后尽快处理确保线粒体的完整性同时减少了叶绿体DNA污染；
(2)组织匀浆缓冲液中加入一定量PVP、BSA，并用甘露醇和半胱氨酸取代传统方法中的蔗糖和巯基乙醇，有效地减少酚类等物质对线粒体的影响，有利于保持线粒体完整性；
(3)在优化差速离心组合去除大量破碎组织和核基因的基础上，结合Percoll密度梯度离心进一步将与线粒体沉降系数差异较小的叶绿体分离；
(4)经3％CTAB悬浮沉淀，后续用氯仿-异戊醇(24∶1)反复抽提排除蛋白质污染，使mtDNA 完全从蛋白复合体中释放，减少了蛋白质污染；
本发明可解决黄瓜线粒体研究技术难题，有效地从黄瓜中提取得到高质量mtDNA。经纯化后mtDNA浓度为158ng·μL-1，mtDNA得率＝(158ng·μL-1×50μL)/20g×100％＝3.95×10-7％，每20g叶片可得7.9μg mtDNA。另外A260/A280约1.87，经电泳检测条带清晰且无核和叶绿体基因组DNA污染，可用于进一步研究。
四、附图说明
图1：线粒体聚层观察图示
图2：线粒体健那绿染色观察图示
图3：mtDNA琼脂糖凝胶电泳检测结果
图中，M泳道：2000bp DNA Marker；a泳道：所提mtDNA；b泳道：空白对照
图4：mtDNA纯度琼脂糖凝胶电泳检测结果
图中，M泳道：10000bp DNA Marker；a泳道：.线粒体基因nad7；b泳道：线粒体基因nad1； c泳道：叶绿体基因RbcS；d泳道：叶绿体基因scl；e泳道：核基因trnL；f泳道：核基因rpl-s 表1：相关基因组DNA的引物序列
五、具体实施方式
本研究所用黄瓜种子由南京农业大学园艺学院葫芦科作物遗传育种与种质创新国家重点实验室提供。选取健康饱满的种子，消毒播种于温室中，待萌发长至5-7片真叶时，挑生长健壮幼苗用黑色塑料袋遮光处理，于28℃培养3-5天，获得黄化苗。本发明所用试剂包括牛血清蛋白、核酸染料等常用试剂购于南京寿德生物科技有限公司，以下缓冲液各试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司，具体配方如下：
匀浆缓冲液(Homogenization buffer 1L)：甘露醇/蔗糖400mmol；EGTA 1mmol；MOPS-KOH(pH 7.8)25mmol；甘氨酸10mmol；半胱氨酸/巯基乙醇8mmol；牛血清蛋白 0.1％(W/V)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)1％(W/V)(注：半胱氨酸在试验前加)；
洗涤缓冲液(Wash buffer 1L)：甘露醇400mmol；EGTA 1mmol；MOPS-KOH(pH 7.2)10mmol；牛血清蛋白0.1％(W/V)；
蔗糖梯度缓冲液(5X Gradient Buffer 1L)：蔗糖1.5mol；MOPS(pH 7.2)50mmol；牛血清蛋白0.5％(W/V)；
33％Percoll梯度缓冲液(Percoll Gradients 20mL)：5X蔗糖梯度缓冲液4ml；Percoll溶液 6.6ml；ddH2O 9.4ml；
80％Percoll梯度缓冲液(Percoll Gradients 20mL)：5X蔗糖梯度缓冲液4ml；Percoll溶液 16ml；ddH2O 0.0ml；
Ringer溶液：氯化钠6.5g；氯化钙0.12g；重碳酸钠0.2g；氯化钾0.14g；磷酸氢二钠0.01g；葡萄糖2.0g，蒸馏水定容至1L；
健那绿B染液：0.1g健那绿；10mL Ringer液(注：现用现配，避光保存)；
50X TAE电泳缓冲液：Tris 242g；冰乙酸57.1mL；100mL EDTA 0.5mol·L-1，pH＝8.0，蒸馏水定容至1L；
实验过程如下：
1.叶片组织破碎：
为了降低组织破碎过程中叶绿体和细胞碎片的影响，同时保持线粒体结构完整性，本试验拟设定4种不同配比的匀浆缓冲液，以及4种不同差速离心力组合。每个处理进行3次生物学重复，以确定适用于黄瓜线粒体提取的最佳匀浆缓冲液和离心力。试验开始之前，把各缓冲液、现配试剂以及离心管等所用器材放置4℃冰箱预冷备用，同时安装角转子，打开高速冷冻离心机(CR 21GIII，日本Hitachi公司)设置4℃提前预冷。
(1)摘取适量预冷的黄化苗叶片，放入1∶6稀释最终浓度1％的消毒液中清洗2分钟，以除去残留在叶面的真菌和细菌，之后置于冰水中清洗3遍。将洗净的叶片在干净的滤纸上铺平晾干，剪碎并去除叶脉；
(2)称取上述组织20g置于组织破碎机(JJ-2，温州标诺仪器有限公司)，加入200mL匀浆缓冲液，同时加入0.28g半胱氨酸，在较低设置下匀浆3次，每次约5秒；
(3)匀浆液用8层提前预冷无菌纱布和200目细胞筛依次过滤，并在冰上收集滤液，等量分装于4个无菌的50mL离心管中；
2.线粒体的提取与分离：
提取之前，准备2个Corex离心管依次加入10mL 80％Percoll和10mL 33％Percoll液制成明显分层的密度梯度液，置于4℃冰箱备用；
(1)配平上述分装等量匀浆液的离心管，在角转子中离心10min，设置离心力1000×g，细胞碎片于底部沉淀，收集上层清液；
(2)将收集的上层清液合并混匀，转至4个全新50mL离心管，在2000×g条件下离心10min，去除叶绿体等细胞器结构，收集上层清液，并吸取少量清液用于后续显微镜检测；
(3)将4管含有线粒体的清液分别转至4个无菌预冷的50mL离心管，于17000×g离心20min，此时沉淀即为粗制的线粒体；
(4)去除上清液，向线粒体沉淀中加入0.5mL洗涤缓冲液，并用无菌软毛笔蘸取重新悬浮，将4管合并得到2mL线粒体悬浮液。吸取适量线粒体悬浮液后续显微系统检测；
(5)线粒体悬浮液中加入500uL的100％Percoll溶液，制成2.5mL含丰富线粒体的20％Percoll 溶液；
(6)用移液管将线粒体悬浮液贴壁转移至提前备好的Percoll梯度液，之后使用水平转子，超速冷冻离心机(XPN-100，美国Beckman公司)18000×g离心60min；
(7)线粒体会在80％和33％Percoll液之间形成一条层带，回收线粒体加入10mL洗涤缓冲液，再以18000×g离心20min即可得到纯化的线粒体。如需保存，可适量添加洗涤缓冲液和5％甘油重新悬浮，储存于-20℃用于后续试验；
3.mtDNA的提取纯化：
(1)向所提线粒体沉淀中加入800μL 3％CTAB重悬沉淀，并于65℃水浴1h。水浴冷却至室温加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀于室温下静置10min，12000×g离心10min；
(2)收集上清液至新的离心管，同样加入800μL氯仿-异戊醇(24∶1)混匀，12000×g离心 10min；
(3)上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃条件下静置沉淀1-3h；
(4)12000×g离心10min后即可得到浓缩线粒体DNA，弃上清液，加入70％乙醇洗涤3次，并在干净的工作台中干燥后重悬于适量无菌超纯水中，置于-20℃保存或立即进行检测；
4.mtDNA的定量和定性分析：
(1)线粒体完整性观察：利用线粒体易被健那绿染液染成蓝绿色的特异性，吸取15μL线粒体溶液置于干净载玻片，再加入5μL健那绿染液，吸打混匀后盖上盖玻片，10min之后进行显微观察线粒体；
(2)mtDNA浓度及电泳条带检测：吸取1μL所提mtDNA溶液，利用紫外分光光度计检测其浓度和纯度。取2μL mtDNA样品进行琼脂糖凝胶(1％)电泳检测，与空白对照观察DNA分子大小和带型；
(3)mtDNA纯度检测：根据NCBI基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计线粒体基因、核基因、叶绿体基因特异性引物。以所提取的mtDNA为模板进行PCR扩增，进一步验证是否存在叶绿体基因组和核基因组的污染。50μL PCR反应体系包括：1μL mtDNA，1μL上游和下游引物(10mmol·L-1)，25μL 2×Taq Master Mix和22μL ddH2O2。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20S；55℃退火20S；72℃延伸2min20S，33个循环；72℃延伸5min， 4℃保存。在1％琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物，结合凝胶成像系统观察条带。
表1相关基因组DNA的引物序列
Table 1 Primer sequences of related genomic DNA
Claims (4)
1.黄瓜叶片组织破碎：
(1)摘取适量预冷的黄化苗叶片，放入1∶6稀释最终浓度1％的消毒液中清洗2分钟，之后置于冰水中清洗3遍；
(2)称取上述组织20g置于组织破碎机(JJ-2，温州标诺仪器有限公司)，加入200mL匀浆缓冲液，同时加入0.28g半胱氨酸，在较低设置下匀浆3次，每次约5秒；
(3)匀浆液用8层提前预冷无菌纱布和200目细胞筛依次过滤，并在冰上收集滤液，等量分装于4个无菌的50mL离心管中。
2.对权利1黄瓜叶片破碎组织匀浆滤液离心分离出线粒体：
提取之前，准备2个Corex离心管依次加入10mL80％Percoll和10mL33％Percoll液制成明显分层的密度梯度液，置于4℃冰箱备用；
(1)高速冷冻离心10min，离心力1000×g，细胞碎片于底部沉淀，收集上层清液；
(2)上层清液转至4个全新50mL离心管，2000×g离心10min，去除叶绿体等细胞器结构，收集上层清液；
(3)将4管含有线粒体的清液分别转至4个无菌预冷的50mL离心管，于17000×g离心20min，此时沉淀即为粗制的线粒体；
(4)去除上清液，向线粒体沉淀中加入0.5mL洗涤缓冲液，并用无菌软毛笔蘸取重新悬浮，将4管合并得到2mL线粒体悬浮液；
(5)线粒体悬浮液中加入500uL的100％Percoll溶液，制成2.5mL含丰富线粒体的20％Percoll溶液；
(6)用移液管将线粒体悬浮液贴壁转移至提前备好的Percoll梯度液，之后超速冷冻离心60min，离心力18000×g；
(7)线粒体会在80％和33％Percoll液之间形成一条层带，回收线粒体加入10mL洗涤缓冲液，再以18000×g离心20min即可得到纯化的线粒体。如需保存，可适量添加洗涤缓冲液和5％甘油重新悬浮，储存于-20℃用于后续试验。
3.对权利2分离的线粒体裂解提取纯化mtDNA：
(1)向所提线粒体沉淀中加入800μL3％CTAB重悬沉淀，并于65℃水浴1h。水浴冷却至室温加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀于室温下静置10min，12000×g离心10min；
(2)收集上清液至新的离心管，同样加入800μL氯仿-异戊醇(24∶1)混匀，12000×g离心10min；
(3)上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃条件下静置沉淀1-3h；
(4)12000×g离心10min后即可得到浓缩线粒体DNA，弃上清液，加入70％乙醇洗涤3次，并在干净的工作台中干燥后重悬于适量无菌超纯水中，置于-20℃保存或立即进行检测。
4.对权利3所得mtDNA进行定量和定性分析：
(1)线粒体完整性观察：吸取15μL线粒体溶液置于干净载玻片，再加入5μL健那绿染液，吸打混匀后盖上盖玻片，10min之后进行显微观察线粒体；
(2)mtDNA浓度及电泳条带检测：吸取1μL所提mtDNA溶液，利用紫外分光光度计检测其浓度和纯度。取2μLmtDNA样品进行琼脂糖凝胶(1％)电泳检测，与空白对照观察DNA分子大小和带型；
(3)mtDNA纯度检测：根据NCBI基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计线粒体基因、核基因、叶绿体基因特异性引物。以所提取的mtDNA为模板进行PCR扩增，进一步验证是否存在叶绿体基因组和核基因组的污染。50μLPCR反应体系包括：1μLmtDNA，1μL上游和下游引物(10mmol·L-1)，25μL 2×Taq Master Mix和22μLddH2O2。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20S；55℃退火20S；72℃延伸2min20S，33个循环；72℃延伸5min，4℃保存。在1％琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物，结合凝胶成像系统观察条带。
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|---|---|
| CN (1) | CN110438118B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111808793A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-23 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法 |
| CN112538476A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 湖北省农业科学院中药材研究所 | 一种提取白术叶片全基因组dna的方法 |
| CN113736664A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-03 | 深圳大学 | 一种莱茵衣藻线粒体提取试剂及其提取纯化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899432A (zh) * | 2010-05-04 | 2010-12-01 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种提取高纯度芝麻线粒体dna的方法 |
-
2019
- 2019-05-22 CN CN201910431970.XA patent/CN110438118B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899432A (zh) * | 2010-05-04 | 2010-12-01 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种提取高纯度芝麻线粒体dna的方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111808793A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-23 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法 |
| CN112538476A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 湖北省农业科学院中药材研究所 | 一种提取白术叶片全基因组dna的方法 |
| CN113736664A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-03 | 深圳大学 | 一种莱茵衣藻线粒体提取试剂及其提取纯化方法 |
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| CN110438118B (zh) | 2022-07-05 |
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