CN101899432A

CN101899432A - 一种提取高纯度芝麻线粒体dna的方法

Info

Publication number: CN101899432A
Application number: CN 201010169014
Authority: CN
Inventors: 张秀荣; 黎冬华; 王林海; 张艳欣
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2010-12-01

Abstract

本发明涉及一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，包含以下步骤：(1)材料的预处理，得到黄化苗；(2)匀浆化处理；(3)离心获得粗制线粒体；4)Dnase处理：在步骤(3)的粗制线粒体沉淀中加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入DNase I，2～6℃酶解1.4h～1.6h；终止酶解反应；再将终止酶解反应后的溶液叠加在洗涤缓冲液中，离心收集沉淀；(5)裂解获得线粒体DNA；(6)抽提提纯；(7)Rnase处理：用70％(重量)的乙醇洗涤，在空气气氛中干燥，然后用含20μg/ml RNase的1×TE溶解，置于-20℃保存备用。本发明方法产率高；得到的芝麻线粒体DNA纯度高，没有非线粒体DNA的污染。

Description

一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取高纯度芝麻线粒体DNA(mtDNA)的方法。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum L.)古称胡麻，是我国继油菜、大豆和花生后的第四大油料作物，因其不仅含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、钙、磷、铁等物质，还含有多种维生素和芝麻素(sesamin)、芝麻酚(sesamol)、甾醇及卵磷脂等营养元素(http://www.ars.usda.gov)，自古以来被誉为营养和保健食品，并可入药。我国是世界芝麻主产国之一，在全国多数省市均有种植，尤其以长江、淮河流域较为集中。芝麻每亩单产水平较低，据统计，印度25.27kg、缅甸23.44kg、苏丹12.19kg、中国69.82kg，除本身遗传因素外，病、虫、渍、旱等生物或非生物胁迫影响也是重要因素。

线粒体是植物进行呼吸的细胞器，其编码的一些线粒体呼吸链中的几个主要组成蛋白具有重要功能，存在一个线粒体基因表达与核基因表达的协调机制问题，这种协调机制直接关系到线粒体电子传递链的畅通，进而影响到氧化磷酸化作用。尽管大多数的线粒体蛋白是由核基因组编码，在细胞质中合成后再运入线粒体中的，但线粒体基因组仍包含有10％左右的形成线粒体的遗传信息，特别是翻译体系中的rRNA和tRNA组分也是由线粒体DNA编码。研究表明，细胞质雄性不育、抗除草剂、抗逆等性状与线粒体DNA(mtDNA)有关(HansonMR，et al.，2004；罗银玲等，2004；向文胜等，1997)，因此研究线粒体基因具有重要意义。

植物线粒体DNA(mtDNA)的提取方法主要有密度梯度离心法(Mikami T，et al.，1984；Leroy P，et al.，1985；唐群等，2005)和差速离心法(Pring DR and Levings CS，1978；Kemble RJ，et al.，1980；McNay JW，et al.，1984；Wilson AJ and Chourey PS，1984；Kemble RJ，1987；Pérez C，et al.，1990；Triboush SO，et al.，1998；Scotti N，et al.，2001)等方法。密度梯度离心法得到的mtDNA纯度高，但操作复杂、耗时，对材料的需求量大，且mtDNA提取产量低，长时间高速离心对离心机要求很高。差速离心法因其操作简单，是目前应用最多的方法，但所提取的mtDNA纯度低、易降解，且易受核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染，所以要在差速离心的基础上添加其他一些辅助步骤，以获得高纯度线粒体DNA。

差速离心提取线粒体DNA法一般包括材料获取、匀浆化处理、过滤、差速离心获得粗制线粒体、DNase处理、衬垫离心获得较纯的线粒体以及线粒体裂解获得线粒体DNA等步骤。材料获取大多选择黑暗培养获得的黄化苗，这样提取获得的线粒体可以最大程度的减小叶绿体的污染，但也有人选择特定的植物组织作为提取材料；匀浆化处理一般是在预冷研钵中添加匀浆缓冲液及材料研磨获得匀浆，这样获得的完整线粒体所占比率大，但是由于研磨的不够充分，获得线粒体量较少，后来研究者纷纷尝试机械匀浆的方法，机械匀浆虽然线粒体碎片较多，但是经过后续的辅助步骤仍可以获得高纯度的线粒体，因该技术操作简便、线粒体提取效率高，已经被广泛利用；由于不同作物线粒体大小及重量不一，所以不同作物提取线粒体所需离心速率也不一样，但一般都是先以1000～3000g的转速除去细胞核及其他杂质，然后再以12000～17000g的转速获得粗制线粒体；DNase处理步骤，不同作物所用的DNase浓度不一，但一般都是在4℃条件下处理1h，但也有些研究者在室温和37℃条件下处理；衬垫离心一般选用0.2～0.6M蔗糖衬垫进行低温高速离心；获得的线粒体一般用SDS结合蛋白酶K在37℃裂解，再经过氯仿抽提而获得线粒体DNA(mtDNA)，但也有人使用十二烷基肌氨酸钠结合蛋白酶K和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)结合蛋白酶K裂解获得mtDNA。

植物mtDNA大多数为环状分子，不同物种线粒体DNA分子数从几拷贝到几十拷贝不等，且mtDNA分子大小差别也很大，从几十kb到几千kb不等，建立于差速离心基础上的mtDNA提取方法对于不同物种所用的具体参数不同，辅助条件也不一致，因此很难将mtDNA提取方法统一。随着分子生物学的发展，对芝麻基因组的研究已经开始。目前提取芝麻全基因组DNA的技术已经成熟，但对于芝麻线粒体DNA的提取方法及具体技术参数的研究至今未见报道。而且由于物种之间的差异性，用于其它植物的提取方法所提取的芝麻线粒体DNA，表现为纯度不高，十分容易降解，无法满足后续实验要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法。该提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法产率高，得到的线粒体DNA没有非线粒体DNA污染，纯度高。

为解决本发明提出的技术问题，本发明采用的技术方案为：一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)材料的预处理：将芝麻种子置于恒温培养箱中28～30℃黑暗培养，得到黄化苗；

(2)匀浆化处理：准确称取步骤(1)获得的黄化苗，加入预冷的研磨缓冲液，用匀浆器快速匀浆，再在冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，100～200目过滤，得到过滤液；

(3)离心获得粗制线粒体：将步骤(2)得到的过滤液于2～6℃，2200～2600g离心12～15min，然后将离心得到的上层清液于2～6℃，12000～13000g离心10～12min，收集粗制线粒体沉淀；

(4)Dnase处理：在步骤(3)得到的粗制线粒体沉淀中，加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入DNase I，2～6℃酶解1.4h～1.6h，得到酶解液；终止酶解反应；再将终止酶解反应后的溶液叠加在洗涤缓冲液中，于2～6℃，15000～20000g离心12～15min，收集沉淀；

(5)裂解获得线粒体DNA：在步骤(4)获得的沉淀中，加入悬浮缓冲液，混匀，于2～6℃，12000～13800g离心12～15min，去除上清液，然后向得到的沉淀中加入裂解缓冲液，再分别加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)，37℃水浴2h以上，得到线粒体裂解液；

(6)抽提提纯：步骤(5)的线粒体裂解液平衡至室温后，向其中加入NH₄Ac至终浓度为0.8mol/L，然后加入苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，于2～6℃，12000～13800g离心12～15min，分离出上层溶液；以上层溶液的体积为基准，分别向上层溶液中加入1/10体积的浓度为8mol/L的NH₄Ac和2.5～3倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃沉淀，然后于2～6℃，12000～13800g离心10～15min，收集线粒体DNA沉淀；

(7)Rnase处理：用70％(重量百分数)的乙醇将步骤(6)的沉淀洗涤至少3次，在空气气氛中干燥，然后用含20μg/ml RNase的1×TE溶解DNA，置于-20℃保存备用。

按上述方案，所述研磨缓冲液：500mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.1％(体积百分数)牛血清蛋白(BSA)，5mmol beta-巯基乙醇，pH为7.5；所述悬浮缓冲液：0.5mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，pH为7.5；所述洗涤缓冲液：600mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，20mmol/1EDTA，pH为7.5；所述裂解缓冲液：50mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

按上述方案，所述步骤(1)中：培养时间为6～8天，得到的黄化苗高度为5±3cm。

按上述方案，所述步骤(2)中：研磨缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加3～5mL；超声波细胞破碎仪的破碎时间为1.5～2.5h。

按上述方案，所述步骤(4)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.16～0.24mL，DNase I的用量为每克黄化苗鲜重加0.4U～0.6U；终止酶解反应是向酶解液中加入预冷的PH为8.0的EDTA至终浓度为50mmol/L；洗涤缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.5～1mL。

按上述方案，在进行步骤(5)之前，步骤(4)重复进行至少1次。

按上述方案，所述步骤(5)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.2～0.3mL；裂解缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.9～lmL；在加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)后，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解缓冲液中混匀。

按上述方案，所述步骤(6)中：苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与线粒体裂解液的体积比为1∶1～1.5∶1，苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。

按上述方案，在进行步骤(7)之前，步骤(6)重复进行至少1次。

按上述方案，所述步骤(7)中：含20μg/ml RNase的1×TE的用量为0.1～0.2mL；溶解时间为2～3天。

本发明的有益效果：(1)本发明提供的一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法产率高(每克黄化苗中可得到1μg以上的线粒体DNA)；(2)本发明的提取方法得到的芝麻线粒体DNA纯度高，没有非线粒体DNA的污染。

附图说明

图1为本实施例提取的芝麻线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图1中，M：DNA Marker；1：鄂芝2号线粒体DNA；2：芝麻品种2541线粒体DNA。

图2为本实施例提取的芝麻线粒体DNA分别由细胞核基因组特异引物、线粒体基因组特异引物以及叶绿体基因组特异引物进行PCR扩增后测得的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2中，M：DNA Marker；1-5为核基因特异引物扩增结果；6～10为线粒体基因特异引物扩增结果；11～15为叶绿体基因特异引物扩增结果；1～2，6～7，11～12为DNase处理1h后获得的线粒体DNA的引物扩增结果；3～4，8～9，13～14为DNase处理1.5h后获得的线粒体DNA的引物扩增结果；1、3、6、8、11、13为鄂芝2号线粒体DNA的引物扩增结果，2、4、7、9、12、14为芝麻品种2541线粒体DNA的引物扩增结果，5、10和15为对照(蒸馏水)。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，操作过程除特别说明之外，均在4℃进行。所有引物均由上海生工合成。芝麻品种2541及鄂芝2号的种子，为中国农业科学院油料作物研究所芝麻资源课题组自有材料。

实施例1：

(1)材料的预处理：分别将10g左右芝麻品种2541和鄂芝2号的饱满种子，均匀铺在含2层滤纸的搪瓷盘中，喷洒蒸馏水使滤纸湿透，但不能淹没种子，然后置于恒温培养箱中30℃黑暗培养6～8天生成黄化苗；

(2)匀浆化处理：称取步骤(1)的黄化苗30g，加入90mL预冷的研磨缓冲液，用匀浆器快速匀浆，再在冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎2h(参数设置：每隔5秒脉冲5秒)，100目纱布过滤；

(3)离心获得粗制线粒体：将步骤(2)的过滤液于4℃，2400g离心15min，然后将离心得到的上层清液转到一个新的离心管中，于4℃，12000g离心12min，收集粗制线粒体沉淀；

(4)DNase处理：在步骤(3)得到的粗制线粒体沉淀中，加入6mL悬浮缓冲液，轻轻混匀，然后加入15U DNase I，4℃下酶解1.5h，得到酶解液；向酶解液中加入预冷的EDTA(pH 8.0)至终浓度50mmol/L，终止酶解反应；然后将终止酶解反应后的溶液缓慢叠加在盛有15mL洗涤缓冲液的离心管中，于4℃，20000g离心15min后收集沉淀，得到芝麻线粒体沉淀，重复上述步骤一次；

(5)线粒体裂解获得线粒体DNA：在步骤(4)获得的沉淀中，加6ml悬浮缓冲液，轻轻混匀后，于4℃，13800g离心15min，去除上清液，然后在每个离心管中加入27ml裂解缓冲液，然后分别加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解液中混匀，然后在37℃水浴2h以上裂解线粒体(期间颠倒混匀3次左右)，得到线粒体裂解液；

(6)抽提提纯：步骤(5)得到的线粒体裂解液平衡至室温后，向其中加入8mol/LNH₄Ac至终浓度为0.8mol/L，然后加入与线粒体裂解液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，缓慢混匀10min；于4℃，13800g离心15min抽提DNA，分离上层溶液；取上层溶液于新离心管中，以上层溶液的体积为基准，分别向上层溶液中加入1/10体积的浓度为8mol/L NH₄Ac和5/2体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀后，放入冰箱中-20℃过夜沉淀，次日取出，在4℃，13800g离心15min收集线粒体DNA沉淀，重复上述步骤1次；

(7)RNase处理：用70％(重量百分数)的乙醇洗涤步骤(6)得到的沉淀3次，空气干燥后用100μl含20μg/ml RNase的1×TE溶解DNA2天，置-20℃保存备用；

所述研磨缓冲液：500mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.1％(体积百分数)BSA和5mmol beta-巯基乙醇，pH为7.5；

所述悬浮缓冲液：0.5mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，pH为7.5；

所述洗涤缓冲液：600mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，20mmol/1EDTA，pH为7.5；

所述裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

线粒体DNA的完整性检测实验

直接用琼脂糖凝胶电泳对本实施例提取的芝麻线粒体DNA进行检测，结果见图1。图1可看出：本发明方法提取的鄂芝2号线粒体DNA和芝麻品种2541线粒体DNA分别仅有一条分子量在4.5kb以上的条带，这说明该方法提取的线粒体DNA完整性良好，没有明显的降解现象，适用于PCR等常用分子生物学实验。

线粒体DNA的浓度及纯度检测实验

用紫外分光光度仪对本实施例提取的鄂芝2号线粒体DNA和芝麻品种2541线粒体DNA分别进行纯度检测，即测定该线粒体DNA在260nm的吸光度A260和280nm的吸光度A280，并计算A260和A280的比值A260/A280(见表1)。由表1可得：A260/A280可作为线粒体DNA纯度的评价指标，为1.8～2.0之间，说明本发明方法提取得到的线粒体DNA纯度较高。

表1DNase处理不同时间获得的线粒体DNA浓度及纯度测定

注：所测DNA浓度为实施例l提取得到的芝麻线粒体DNA稀释100倍后的浓度。

DNase处理1h的样品是采用实施例1的提取方法，并将步骤4)中的DNase处理时间替换为1h制备得到的样品。

PCR引物扩增试验

分别将本实施例提取的鄂芝2号和芝麻品种2541线粒体DNA稀释100倍，然后用线粒体基因rrn26S的特异引物，核基因组beta-actin的特异引物和叶绿体基因ARCP5的特异引物进行PCR扩增(各特异引物的序列见表2)，验证所提取的线粒体DNA的纯度。

50μL的PCR反应体系中含有5μL 10×PCR缓冲液、4μL MgCl₂、2μL dNTPs、上下游引物各1μL、0.3μL Taq DNA聚合酶及模板DNA 50ng。PCR程序为：首先95℃变性3min；然后94℃变性1min；50℃变性1min；72℃变性1min，循环扩增30个；最后于72℃延伸4min，测得PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上的电泳结果(见图2)。

PCR引物扩增试验结果显示，利用细胞核基因组特异引物和叶绿体基因组特异引物未能在经DNase处理1.5h的芝麻线粒体DNA中检测到任何目的产物，而在DNaseI处理1h的芝麻线粒体DNA中有细胞核基因组和叶绿体基因组DNA污染(见图2)，说明本实施例所提取的芝麻线粒体DNA(DNase处理1.5h)没有受到其它非线粒体DNA的污染。

表2线粒体基因、核基因、叶绿体基因的特异引物序列

引物名称上游序列下游序列

rrn26S 5′TTTTCAAGTGTCAGTAGCGG 3′ 5′TTGACTATGACAAGAGTCGC 3′

beta-actin 5′ATGGCCGATGGTGAGGACATTC 3′ 5′GGTGCGACCACCTTGATCTTC 3′

ARCP5 5′GGCCATAGGCTGGAAAGTCT 3′ 5′GTTTATGCATGGCGAAAAGG 3′

实施例2：

(2)匀浆化处理：称取步骤(1)的黄化苗30g，加入120mL预冷的研磨缓冲液，用匀浆器快速匀浆，再在冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎2h(参数设置：每隔5秒脉冲5秒)，150目纱布过滤；

(3)离心获得粗制线粒体：将步骤(2)的过滤液于6℃，2600g离心12min，然后将离心得到的上层清液转到一个新的离心管中，于2℃，13000g离心15min，收集粗制线粒体沉淀；

(4)DNase处理：在步骤(3)得到的粗制线粒体沉淀中，加入5mL悬浮缓冲液，轻轻混匀，然后加入18U DNase I，6℃下酶解1.6h，得到酶解液；向酶解液中加入预冷的EDTA(pH 8.0)至终浓度50mmol/L，终止酶解反应；然后将终止酶解反应后的溶液缓慢叠加在盛有20mL洗涤缓冲液的离心管中，于6℃，18000g离心12min后收集沉淀，得到芝麻线粒体沉淀，重复上述步骤一次；

(5)线粒体裂解获得线粒体DNA：在步骤(4)获得的沉淀中，加8ml悬浮缓冲液，轻轻混匀后，于6℃，12000g离心12min，去除上清液，然后在每个离心管中加入30ml裂解缓冲液，然后分别加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解液中混匀，然后在37℃水浴2h以上裂解线粒体(期间颠倒混匀3次左右)，得到线粒体裂解液；

(6)抽提提纯：步骤(5)得到的线粒体裂解液平衡至室温后，向其中加入8mol/LNH₄Ac至终浓度为0.8mol/L，然后加入苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液的体积为线粒体裂解液体积的1.5倍，缓慢混匀10min；于6℃，12000g离心12min抽提DNA，分离上层溶液；取上层溶液于新离心管中，以上层溶液的体积为基准，分别向上层溶液中加入1/10体积的浓度为8mol/L NH₄Ac和3倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀后，放入冰箱中-20℃过夜沉淀，次日取出，在6℃，12000g离心12min收集线粒体DNA沉淀，重复上述步骤1次；

(7)RNase处理：用70％(重量百分数)的乙醇洗涤步骤(6)得到的沉淀3次，空气干燥后用150μl含20μg/ml RNase的1×TE溶解DNA 3天，置-20℃保存备用；

所述裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

Claims

1.一种提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

(7)Rnase处理：用70％的乙醇(重量百分数)将步骤(6)的沉淀洗涤至少3次，在空气气氛中干燥，然后用含20μg/ml RNase的1×TE溶解，置于-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述研磨缓冲液：500mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.1％(体积百分数)牛血清蛋白，5mmol beta-巯基乙醇，pH为7.5；所述悬浮缓冲液：0.5mmol/L蔗糖，50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl₂，pH为7.5；所述洗涤缓冲液：600mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH为7.5；所述裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

3.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中：培养时间为6～8天，得到的黄化苗高度为5±3cm。

4.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中：研磨缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加3～5mL；超声波细胞破碎仪的破碎时间为1.5～2.5h。

5.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.16～0.24mL，DNase I的用量为每克黄化苗鲜重加0.4U～0.6U；终止酶解反应是向酶解液中加入预冷的PH为8.0的EDTA至终浓度为50mmol/L；洗涤缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.5mL～1mL。

6.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：在进行步骤(5)之前，步骤(4)重复进行至少1次。

7.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中：悬浮缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.2～0.3mL；裂解缓冲液的用量为每克黄化苗鲜重加0.9～1mL；在加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL和十二烷基磺酸钠至终浓度为1％(重量百分数)后，用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂解缓冲液中混匀。

8.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(6)中：苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与线粒体裂解液的体积比为1∶1～1.5∶1，苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。

9.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：在进行步骤(7)之前，步骤(6)重复进行至少1次。

10.根据权利要求1所述的提取高纯度芝麻线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(7)中：含20μg/ml RNase的1×TE的用量为0.1～0.2mL；溶解时间为2～3天。