CN102428963A - 玉米ZmRop1蛋白的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米ZmRop1蛋白的新用途。本发明所提供的新用途为序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用、序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用、以及含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。本发明通过在玉米原生质体中共转化能表达ZmRop1的质粒与SCMV RNA，发现过量表达ZmRop1，SCMV病毒复制水平降低约392.6％，即过量表达ZmRop1可有效抑制SCMV的复制。这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。

Description

玉米ZmRop1蛋白的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域中玉米ZmRop1蛋白的新用途。

背景技术

玉米矮花叶病(maize dwarf mosaic disease，MDMD)可由一至多种病毒系统性侵染引起，在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病毒有6种，它们均属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，它们分别是甘蔗花叶病毒(Sugar cane mosaic virus，SCMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)、约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、玉米属花叶病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)和白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)。甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的优势株系(Fan ZF，Chen HY，Liang XM，Li HF，2003.Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain ofa potyvirus infecting maize in China.Archives of Virology 148，773-82)。

作为一种细胞内专性寄生物的植物病毒，在侵染过程中，其生活史的完成必须依赖寄主因子参与病毒脱壳、基因组复制、病毒颗粒组装和病毒运动过程。而这种依赖性就需要寄主因子在病毒侵染时改变原有的正常的功能和状态。这些复杂的改变一方面体现在植物发生了一系列生理和组织上的变化，从分子、化学和物理水平上来抵抗病毒的侵染，另一方面表现在病毒通过多种策略适应或改变寄主细胞从而增强侵染复制复合体的形成、抑制转录后基因沉默，促进细胞间的移动、干扰植物细胞周期等，同时导致寄主植物形成各种症状，包括花叶、褪色、矮化、发育缺陷或死亡等(WhithamSA，Yang C Goodin MM 2006.Global impact：elucidating plant responses to viral infection.Molecular Plant-Microbe Interactions 19，1207-15)。

在抗性寄主中，病毒的侵染会激发抗性寄主的免疫反应，病毒的无毒基因(Avrgene)和寄主的抗病基因(R gene)相互识别可激发寄主的一些抗病防卫反应。在感病寄主中，植物基因表达的变化可能是由两种原因造成：一是病毒侵染过程要求的寄主因子参与；二是由于寄主本身的抗病反应或由于病毒侵染干扰了植物miRNA的功能，进而引起植物典型的表型变化即症状的产生(Yang Z，Fu Y，2007.ROP/RAC GTPasesignaling.Current Opinion in Plant Biology 10，490-4)。

鉴定SCMV侵染后玉米中差异表达的基因，有助于探索防治玉米矮花叶病的新途径。近年来，科学家已经做了大量工作来鉴定SCMV侵染后玉米中差异表达的基因(Uzarowska A，Dionisio G，Sarholz，B et al.，2009.Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays L.)byexpression profiling.BMC Plant Biology 9，15doi：10.1186/1471-2229-9-15)，然而，SCMV和玉米之间的分子互作机理尚不清晰。

Rop作为植物重要的调控因子，参与调控植物多种信号途径，如调控花粉管的生长、调控肌动蛋白细胞骨架和细胞极性生长(Yang Z，2002.Small GTPase：versatilesignaling switches in plants.Plant Cell Supplement 14，S375-88)、参与植物非生物胁迫(Nibau C，Wu H，Cheung A，2006.RAC/ROP GTPase：‘hubs’for signal integration anddiversification in plants.Trends in Plant Science 11(6)，1360-85)，Rops还参与一些植物激素如脱落酸(Zheng ZL，Nafisi M，Tam A，Li H.et al.，2002.Plasmamembrane-associated ROP 10small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acidresponses in Arabidopsis.Plant Cell 14，2787-97)和生长素信号途径，Rops也参与泛素/26S蛋白体介导的蛋白水解(Tao L，Cheung AY，Nibau C Wu HM，2005.RAC GTPasesin tobacco and Arabidopsis mediate Auxin-induced formation of proteolytically activenuclear protein bodies that containAUX/IAAproteins.Plant Cell 17，2369-83)。在玉米中，共有9个Rop成员，ZmRop1～9；ZmRop1(ZmRacA)，ZmRop2(ZmRacB)，ZmRop3(ZmRacC)和ZmRop4(ZmRacD)在哺乳动物细胞中表达能够诱导过氧化物的产生(Hassanain HH，Sharma YK，Moldovan L et al.，2000.Plant Rac proteins inducesuperoxide production in mammalian cells.Biochemical and Biophysical Research.Communications 272：783-8)；而ZmRop2在玉米雄性配子体(花粉粒)中发挥重要功能(Agrawal GK，Iwahashi H，Rakwal R，2003.Small GTPase‘Rop’：molecular switch forplant defense responses.FEBSLetters 546，173-80)，然而在大多数情况下，ZmRop成员的参与调控玉米正常生长发育和玉米对生物、非生物逆境胁迫响应知之甚少。

发明内容

本发明的一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。

本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。

本发明的另一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。

本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复制；

所述植物细胞为植物细胞中的原生质体；

所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒；

所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。

序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。

序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述植物病毒病害为玉米矮花叶病；

所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的；

所述植物为玉米。

本发明通过(1)在玉米原生质体中共转化能表达ZmRop1的质粒与SCMV RNA，发现过量表达ZmRop1，SCMV病毒复制水平降低约392.6％，即过量表达ZmRop1可有效抑制SCMV的复制；(2)在玉米叶片中瞬时沉默ZmRop1后接种SCMV，ZmRop1瞬时沉默的植株上，SCMV建立系统侵染的时间缩短(提前3d)，病毒累积增加(表现在SCMV mRNA水平增加约274～395％)，产生的系统花叶症状更为严重，瞬时沉默ZmRop1促进了SCMV在玉米上的系统侵染。这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。

附图说明

图1为在玉米原生质体中过量表达ZmRop1对SCMV复制的影响。

图2为瞬时沉默ZmRop1的玉米植株表型及其ZmRop1的mRNA水平。

图3为瞬时沉默ZmRop1对SCMV系统侵染玉米植株的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、过量表达ZmRop1抑制甘蔗花叶病毒(SCMV)的复制

一、构建ZmRop1瞬时表达载体

按照分子克隆常规方法，构建ZmRop1瞬时表达载体pGFP-Rop1。具体方法如下：从美国自交系cv.Va35(购自中国农业大学国家玉米改良中心)叶片中提取总RNA为模板，用上下游引物Rop1F和Rop1R，

Rop1F：5′-GTCGACATGGCGTCCAGCGCCTCTCGGTTCAT-3′，(下划线部分为Sal I酶切位点)，

Rop1R：5′-GAGCTCTCAGGACTTGAAGCATAGCATTTTTCTTCCACCG-3′，(下划线部分为Sac I酶切位点)，

反转录PCR扩增得到ZmRop1蛋白的编码基因序列，该编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，该序列所编码的ZmRop1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。然后利用Sal I和Sac I限制性内切酶酶切该编码基因序列，回收酶切后的基因片段；同时，用Sal I和Sac I酶切载体pGFP(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是：Shi Y，Qin Y，Cao Y.et al.，2011.Influence of an m-type thioredoxin in maizeon potyviral infection.European Journal of Plant Pathology 131，317-26)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的基因片段连接后，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pGFP载体的Sal I和Sac I酶切位点间插入了序列表中序列2所示的ZmRop1基因片段，证明重组载体构建正确，将该重组载体命名为pGFP-Rop1。

二、甘蔗花叶病毒(SCMV)RNA提取

1、SCMV病毒粗提纯

收集感染SCMV且系统花叶症状明显的玉米叶片200g，剪成小段，在液氮中快速研磨成粉状。在研磨后的粉状物中加入400ml提取缓冲液I(0.5M磷酸钾缓冲液，使用前加入0.01M的二乙基二硫代氨钾酸钠和1％β-巯基乙醇，WV，pH7.2)，搅拌均匀。用双层尼龙网(孔径38μm)过滤，滤液加20％(WV)CCl₄，充分搅拌20～30min。8,500rpm离心25min。往上清液中加入0.25M的NaCl(终浓度)，搅拌至完全溶解后，再缓慢加入6％(g/ml)PEG-6000(Fluka，日本)，冰浴中搅拌至PEG-6000完全溶解，于4℃静置2h。8,500rpm离心30min，沉淀用含1％Tween-20(Roche，Germany)的提取缓冲液II(0.05M磷酸钾缓冲液，pH7.2)于4℃悬浮过夜。7,000rpm离心15min，将上清液置于20％的蔗糖垫上(上清液与蔗糖垫的体积比为1∶2)，38,000rpm离心90min。每管沉淀用1.0ml提取缓冲液III(0.005M磷酸钾缓冲液，pH7.2)充分悬浮，4℃冰箱中过夜。7,000rpm离心10min去沉淀，上清液即为粗提纯的SCMV，然后以100μl为单位分装，于-80℃冰箱中保存备用。

收集感染SCMV且系统花叶症状明显的玉米叶片的方法为：将SCMV侵染的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第三片叶上，接种后将玉米植株放在人工气候室中培养，培养条件为：23℃光照16h和21℃黑暗8h。接种30天后收集系统花叶症状明显的玉米叶片。

SCMV侵染的玉米汁液的制备方法如下：

从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为SCMV侵染后，通过机械摩擦方式接种到玉米(综31)植株上，保存在防虫温室中。接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明显的幼嫩叶片，称取0.1g该幼嫩叶片，加入1ml接种缓冲液，充分研磨后转移到Eppendorf管中，4℃，5000g离心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。

2、从粗提纯病毒中提取SCMV RNA

在100μl粗提纯SCMV中加入160μl RNAse-free的ddH₂O，再加入200μl RNA抽提缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0；200mM NaCl；5mM EDTA)，然后加入40μl 10％SDS，混匀，室温保持5min。加入2倍体积(800μl)的PCI(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，12,000×g离心5min。吸取上层水相，加入2倍体积的PCI，混匀，12,000×g离心5min，再重复抽提一次。吸取上层水相，确定其体积后，加入1/10(V/V)3M的NaAC(pH 5.2)，混匀；加入2.2倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃沉淀1h或-20℃沉淀过夜。12,000×g离心20min，用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥；所得RNA溶于30μl RNAse-free的ddH₂O中，-80℃保存备用。

三、玉米原生质体的制备、转化及观察

(1)玉米原生质体的分离

选取籽粒饱满、大小均一的玉米自交系综31(购自中国农业大学国家玉米改良中心)种子，用氯气消毒并在超净工作台吹净氯气后置于25℃的培养箱中发芽、暗培养。当玉米黄化苗长到第2片叶高于第一片10～15cm时，剪下第2片叶子中间的6～8cm的部分，轻轻将20片剪下的叶片叠在一起，用新开封的刀片切成约0.5mm的细丝，在蒸馏烧瓶中按照1g叶片加入5ml酶溶液(1～1.5％纤维素酶R10(Yakult Honsha，日本)、0.2～0.4％离析酶R10(Yakult Honsha)、0.6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，pH5.7)的比例加入酶溶液，然后消化、避光，抽真空30min(真空度0.05MPa)，使酶溶液充分渗透到叶片中。然后在摇床(40rpm)上继续避光消化2h。将上述经酶溶液消化的叶片滤过尼龙网(孔径38μm)，转移到圆底离心管中，置于冰上，获得分离的玉米原生质体。

(2)玉米原生质体的活力测定

用尖端剪去的吸头取出500μl分离的原生质体，转移到2ml离心管中，加入等体积的0.02％荧光素乙酰乙酸盐(FDA)溶液(0.1ml FDA母液(2mg FDA溶于1ml丙酮)溶于10ml CPW洗液中(27.2mg/L KH₂PO₄，101mg/L KNO₃，1480mg/L CaCl₂·2H₂O，246mg/L MgSO₄·7H₂O，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO₄·SH₂O，10％mannitol，pH5.7)，静置5min。取适量样品置于载玻片上，用镊子轻轻盖上盖片，注意不要使其盖片滑动。在荧光显微镜下，五点取样，每个视野的原生质体总数不少于50个，观察记录原生质体总数和发黄绿荧光的原生质体总数，发黄绿荧光原生质体为有活力的原生质体(图1中A，玉米原生质体活力检测；分离出的玉米原生质体经FDA染色后在显微镜下观察黄绿色荧光，物镜倍数20×)。

(3)玉米原始质体的转化及观察

将玉米原生质体用电击缓冲液(0.6M mannitol，4mM MES，pH5.7，20mM KCl)洗2次。150×g离心2min，小心吸去上清液，用电击缓冲液重悬原生质体，用血球计数板计数使重悬后的原生质体浓度达到2×10⁶/ml，将原生质体置冰上备用。在2ml圆底离心管中加入50μg重组质粒pGFP-Rop1和300μl原生质体，充分混匀，再加入10μg SCMVRNA，用移液器吸吐混匀，电击2次(5msec，200μF，400V)，冰上放置10min。150g离心2min，吸去上清液，用1ml孵育缓冲液(1000ml中包括30g蔗糖，4.3gMurashige-Skoog[MS]盐，2mg甘氨酸，1mg维生素B1，100mg肌醇，0.5mg 1-萘乙酸，0.5mg 6-BA，0.2mg 2，4-二氯苯氧乙酸，0.55M甘露醇，pH 5.7)重悬原生质体，25℃黑暗孵育过夜。同时，以转化质粒pGFP和SCMV RNA的原生质体作为对照。

转化后的原生质体，通过激光扫描共聚焦显微镜观察GFP绿色荧光来检测ZmRop1的表达，转化质粒pGFP的对照原生质体，绿色荧光分布于整个原生质体细胞，而转化重组质粒pGFP-Rop1的原生质体，绿色荧光分布于原生质体细胞质膜(图1中B，转化后的玉米原生质体GFP绿色荧光观察；激光扫描共聚焦显微镜激发光波长488nm，40×油镜，标尺10μm)。

四、转化后玉米原生质体的总RNA提取和Real-time RT-PCR检测SCMV的累积

将1ml的TRIzol(Invitogen，美国)加入到转化后孵育24h的原生质体中(每1ml TRIzol裂解10个电击反应的原生质体)，剧烈振荡3min；冰上放置5min。原生质体裂解物于4℃、12,000×g离心10min以除去不溶的成分，将上清转入一新的1.5ml离心管中。在室温下静置5min，加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，然后在室温下静置2～5min，再于4℃、12,000×g的条件下离心15min。将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，混合(上下颠倒)，使样品在室温下静置15min，4℃、12,000×g离心10min，则RNA会在管的侧壁和底部形成沉淀。弃上清，加入75％的乙醇洗涤沉淀，于4℃、7,500×g离心5min(如RNA沉淀悬浮起来，则用12,000×g)，弃乙醇。RNA在室温下干燥10min或在冷冻离心干燥机上浓缩5min，加入30μl RNAase-Free的ddH₂O溶解沉淀，-70℃保存备用。

将总RNA用DNase I消解后，检测其纯度和浓度。然后用试剂盒Takaka SYBRpremix Ex Taq^Tm进行Real-time RT-PCR分析超量表达ZmRop1对SCMV复制的影响。以500ng总RNA作为模板，以试剂盒自带Oligo-d(T)和Random 6mers作为反向引物，进行反转录反应。每个反应管依次加入4.0μl 5×Reaction Buffer、1.0μl dNTPs(10mM)、0.5μl RNase inhibitor、0.5μl Oligo-d(T)Primer(50μM)、0.5μl Random 6mers(100μM)、500ng总RNA、0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，最后用RNAse-free的ddH₂O补充至20μl。反应液在42℃水浴反应1h。获得的反转录产物用试剂盒自带的稀释缓冲液(EASY Dilution)稀释10倍。

每个PCR反应管中加入2.0μl稀释10倍的反转录产物、12.5μl 2×SYBR Premix ExTaq、10mM dNTPs，1.0μl SCMV特异性引物(20μM)引物序列为：

SCMVqF：5′-TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，

SCMVqR：5′-TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′，最后用dd H₂O补充至25μl。玉米泛素基因(登录号U29159)作为内参，内参引物为：

UbiF：5′-GGAAAAACCATAACCCTGGA-3′，

UbiR：5′-ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3′。在DNAEngine Opticon^TM 2system(Bio-Rad)上进行反应。反应条件是：50℃，2min；94℃，10min；94℃，15sec，58℃，15sec；72℃，15sec；80.5℃，1sec，读板，40个循环。Real time PCR结束以后，根据扩增仪自带的软件Opticon Monitor 3对数据进行分析。2^-ΔΔCT法的步骤如下：

首先，对所有的测试样本(test)和校准样本(calibrator)，用参照基因(ref)的C_T值归一目标基因(target)的C_T值：

ΔC_T(test)＝C_{T(target，test)}-C_{T(ref，test)}

ΔC_{T(calibrator)}＝C_{T(target，calibrator)}-C_{T (ref，calibrator)}

其次，用校准样本的ΔC_T值归一测试样本的ΔC_T值：

ΔΔC_T＝ΔC_T(test)-ΔC_{T(calibrator)}

最后，计算表达水平比率：

2^-ΔΔCT＝表达量的比值

得到的结果是通过参照基因表达水平校准的实验样本中目标基因相对于校准样本的增加或减少的倍数，用参照基因校准目标基因表达的目的是为了弥补样本组织量的差异。

结果表明，过表达ZmRop1的玉米原生质体(即转入重组质粒pGFP-Rop1的玉米原生质体)中SCMV mRNA的相对表达量为747％，而转入空载体pGFP-II的玉米原生质体中SCMV mRNA的相对表达量为1139.6％，相对于转入空载体pGFP-II的玉米原生质体，过表达ZmRop1的玉米原生质体中SCMV mRNA的相对表达量降低392.6％(图1中C，Real-time RT-PCR检测玉米原生质体转化24h后SCMV的mRNA水平；每个数值代表三次独立实验数值±标准偏差，不同字母代表student’s t-test显著性差异(P＜0.05)。

实施例2、ZmRop1在玉米植株上的瞬时沉默及其对SCMV侵染的影响

一、ZmRop1在玉米植株上的瞬时沉默

1、构建ZmRop1瞬时沉默载体

从美国自交系cv.Va35叶片中提取总RNA为模板，用上下游引物Rop1GSF和Rop1GSR，

Rop1GSF：5′-CATAAGCTTGTCGACCCACGCGTCCGCCCAG-3′，(下划线部分为Hind III酶切位点)，

Rop1GSR：5′-CATAAGCTTAGCAGCGGCGGATGAGCAGGGC-3′，(下划线部分为Hind III酶切位点)，

反转录PCR扩增得到ZmRop1非翻译区特异性片段，通过HindIII酶切PCR产物并回收145bp的基因片段，同时用HindIII酶切雀麦花叶病毒侵染性克隆载体BMVpF3-5/13’A/G(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是：Ding，X.S.，Schneider，W.L.，Chaluvadi，S.R.，Mian，M.A.R.，&Nelson，R.S.(2006).Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing inmonocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions，19，1229-1239.)，回收2.1kb的载体片段，将回收的2.1kb的载体片段与回收的145bp的基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体BMVpF3-5/13’A/G的HindIII酶切位点处插入了序列表中序列2第1到145位所示的ZmRop1序列，证明质粒构建正确，将构建的沉默载体命名为pF3-5/13’A/G-ZmRop1。

2、体外转录模板的制备

在体外转录之前，用SpeI线性化载体BMVF1-11、用PshAI线性化载体BMVF2-2(公众可从中国农业大学获得，记载过载体BMVF1-11和载体BMVF2-2的非专利文献是：Ding，X.S.，Schneider，W.L.，Chaluvadi，S.R.，Mian，M.A.R.，&Nelson，R.S.(2006).Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing inmonocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions，19，1229-1239.)、用PshAI线性化重组载体pF3-5/13’A/G-ZmRop1和用PshAI线性化载体BMVpF3-5/13’A/G。线性化后的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳分析线性化完全程度，确定线性化完全以后，用DNA回收试剂盒进行回收，测定DNA浓度，所有DNA浓度调整到500ng/μl。

3、体外转录

以Spe I线性化的BMVF1-11为模板，进行体外转录，得到BMVF1-11体外转录产物；以PshA I线性化的BMVF2-2为模板，进行体外转录，得到BMVF2-2体外转录产物；以PshA I线性化的pF3-5/13’A/G-ZmRop1为模板，进行体外转录，得到pF3-5/13’A/G-ZmRop1体外转录产物；以PshA I线性化的BMVpF3-5/13’A/G为模板，进行体外转录，得到BMVpF3-5/13’A/G体外转录产物。体外转录体系参照

andRiboMAX(TM)In Vitro Transcription Systems(Promega，美国)，并进行修改，体外转录体系如下所示：

最后用无RNA酶的ddH2O补足20μl，在37℃反应1h。体外转录完成以后，取出1μl用琼脂糖凝胶电泳分析体外转录产率和体外转录物的降解情况。

在接种玉米以前，先对上述体外转录产物进行纯化，体外转录产物加入ddH2O，补足至100μl，加入等体积4M LiCl溶液，混匀后，冰浴过夜或-70℃沉淀1h以上，12,000×g离心20min，充分吸出上清后，用70％乙醇洗涤两次，干燥后溶于适量RNAase-Free的ddH₂O中，-70℃保存备用。吸出的上清中为双链DNA模板，可以用乙醇沉淀后再次利用做体外转录的模板。

4、体外转录产物接种

将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和重组载体pF3-5/13’A/G-ZmRop1三者的体外转录产物等量混匀后摩擦接种玉米Va35三叶期的第二片叶，即为沉默接种(C-BMV_A/GRop₁₄₅)。将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和载体BMVpF3-5/13’A/G三者的体外转录产物等量混匀后摩擦接种玉米三叶期的第三片叶片，即为空载体对照接种(C-BMV_A/G)；用无RNase的ddH₂O接种的植株作为模拟接种(Mock)。

接种方法如下：

在待接种的叶片的第二片叶上轻微撒上高温灭菌的金刚砂，按每片叶子接种1.0μg体外转录物的量吸取接种液(体外转录为混合物)，用带有乳胶手套的手指轻轻涂抹叶片，尽量均匀且不重复涂抹。5min后，用蒸馏水冲洗叶片，洗去金刚砂。接种后的植物放置在暗处12h后，然后置22℃的温室中生长。C-BMV_A/G和C-BMV_A/G/Rop₁₄₅每次都至少各接种3株，同时用RNAase-Free的ddH₂O接种相同数量的植株作为模拟接种。

5、结果

(1)体外转录物接种后美国自交系cv.Va35的表型

C-BMV_A/G和pC-BMV_A/G/Rop1₁₄₅接种以及模拟接种美国自交系cv.Va35后，在培养箱中生长，观察美国自交系cv.Va35上出现的症状等表型，并用数码相机记录。

在代表C-BMV_A/G和C-BMV_A/G/Rop₁₄₅的体外转录物接种后第7天，在接种叶上第一片系统叶均出现轻微的白色条纹症状。在接种后第10天，C-BMV_A/G/Rop₁₄₅接种的植株在接种叶上第一片和第二片系统叶均出现紧密的白色或淡黄色条纹，但接种C-BMV_A/G玉米植株系统叶片仍表现轻微的白色条纹症状；而模拟接种的玉米植株的叶片未出现白色或淡黄色条纹症状，表型正常(图2中A，ZmRop1瞬时沉默的美国自交系cv.Va35的表型；体外转录物及模拟接种10d后对第一片系统叶进行拍照)。

(2)美国自交系cv.Va35中ZmRop1的沉默效率检测

为了验证接种C-BMV_A/G和C-BMV_A/G/Rop₁₄₅的玉米植株在表型上的差异是由于ZmRop1的沉默引起的，在接种后第12天，提取各接种植株的系统叶片的总RNA，通过Real-time RT-PCR检测ZmRop1mRNA水平，所用到的特异性引物为：

Rop1qF：5′-AGGATGTTCTATGATGAACATCTTCGG-3′，

Rop1qR：5′-CTGCTTAACTCATAGCTAGCTAACCACAC-3′。具体方法参照实施例1中的步骤四。

结果表明，接种C-BMV_A/G/Rop₁₄₅的玉米植株系统叶片中，ZmRop1的mRNA水平是接种C-BMV_A/G植株的系统叶片ZmRop1的mRNA水平的20％～24％，是模拟接种植株(Mock)系统叶片ZmRop1的mRNA水平的15％～18％(图2中B，体外转录物及模拟接种后14天，Real-time RT-PCR检测ZmRop1沉默效率。每个数值代表三次独立实验数值±标准偏差，不同字母代表student’s t-test显著性差异(P＜0.05)；Mock代表模拟接种植株系统叶片ZmRop1的mRNA水平；C-BMV_A/G代表接种C-BMV_A/G植株的系统叶片ZmRop1的mRNA水平；C-BMV_A/G/Rop₁₄₅代表接种C-BMV_A/G/Rop₁₄₅植株的系统叶片ZmRop1的mRNA水平)。

二、瞬时沉默ZmRop1对SCMV侵染的影响

1、ZmRop1瞬时沉默的美国自交系cv.Va35挑战接种SCMV

为了研究瞬时沉默对SCMV侵染的影响，在C-BMV_A/G/Rop1₁₄₅等体外转录物接种后12天，在接种叶上部第二片系统叶用金刚砂摩擦接种SCMV，具体方法为：在步骤1)接种10d后，分别在沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)、空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的玉米叶片上等量接种(5μl)(等量是指沉默接种、空载体对照以及模拟接种的叶片上接种的SCMV侵染的玉米汁液量是相等的)SCMV侵染的玉米汁液。接种方法为：将SCMV侵染的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第二片系统叶上，接种SCMV后的美国自交系cv.Va35植株继续在相同的生长条件下生长。

SCMV侵染的玉米汁液的制备方法如下：

从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为SCMV侵染后，通过机械摩擦方式接种到玉米(综31)植株上，保存在防虫温室中。接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明显的幼嫩叶片，称取0.1g该幼嫩叶片，加入1ml接种缓冲液，充分研磨后转移到Eppendorf管中，4℃，5000g离心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。

接种缓冲液的配制：将1.362g KH₂PO₄溶于1000ml蒸馏水中，再将1.781gNa₂HPO₄·2H₂O溶于1000ml蒸馏水中，然后将490ml KH₂PO₄溶液和510mlNa₂HPO₄溶液混合，4℃保存备用。

2、美国自交系cv.Va35植株在二次接种SCMV后的表型差异

这些接种了C-BMV_A/G和C-BMV_A/G/Rop1₁₄₅以及模拟接种的美国自交系cv.Va35植株在二次接种SCMV后在表型上又出现了差异。一方面表现为，SCMV系统症状出现的时间不同，沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)的美国自交系cv.Va35植株二次接种SCMV后第一片、第二片系统叶出现系统症状的时间是在二次接种SCMV后7d和11d；而空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株中二次接种SCMV后第一、二片系统叶出现系统症状对应的时间是10d和14d。二次接种SCMV后7d和11d，沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)的美国自交系cv.Va35植株，SCMV接种叶上系统叶均能通过RT-PCR检测到SCMV，而空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株，对应叶位的叶片中检测不到SCMV。

另一方面表现为，沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)的美国自交系cv.Va35植株中SCMV系统叶表现的系统花叶症状要比空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)植株症状要严重的多(图3中A，分别为沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)、空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株二次接种SCMV后系统叶的表型；SCMV接种后10天对第一片系统叶片进行拍照)。

3、瞬时沉默ZmRop1促进了SCMV在美国自交系cv.Va35上的系统侵染

为了验证SCMV在以上植株的症状差异是由于其在这些植株上侵染程度不同造成的，分别收集沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)、空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株二次接种SCMV后的SCMV系统叶用于分析SCMV的mRNA水平和病毒的累积情况。这些系统叶片一部分用来提取总RNA，用Real-time RT-PCR分析SCMV的mRNA水平，所用到的特异性引物为：

SCMVqF：5′-TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，

SCMVqR：5′-TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′。具体方法参照实施例1中的步骤四。

结果表明，在沉默接种(C-BMV_A/G Rop₁₄₅)的美国自交系cv.Va35植株中，第一、二片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种(C-BMV_A/G)的美国自交系cv.Va35植株和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株中对应叶位的系统叶片中SCMV的mRNA水平均显著高；沉默接种植株中，第一片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种和模拟接种分别高257.5％和294％；第二片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种和模拟接种分别高145.8％和171.8％；(图3中B，Real-time RT-PCR检测沉默接种(C-BMV_A/GRop₁₄₅)、空载体对照接种(C-BMV_A/G)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株二次接种SCMV后系统叶的mRNA水平。每个数值代表三次独立实验数值±标准偏差，不同字母代表student’s t-test显著性差异(P＜0.05)；Mock代表模拟接种植株系统叶片SCMV的mRNA水平；C-BMV_A/G代表接种空载体对照接种植株的系统叶片SCMV的mRNA水平；C-BMV_A/G/Rop1₁₄₅代表接种沉默接种植株的系统叶片SCMV的mRNA水平)。

Claims (10)

1.序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。

2.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

3.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。

4.根据权利要求3中所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复制；

所述植物细胞为植物细胞中的原生质体；

所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒；

所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。

6.序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用。

7.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

8.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害中的应用。

9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物病毒病害为玉米矮花叶病；

所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的；

所述植物为玉米。

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